《2017-2018學(xué)年高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實踐 第10課時 分子生物學(xué)技術(shù)同步備課教學(xué)案 蘇教版選修1》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2017-2018學(xué)年高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實踐 第10課時 分子生物學(xué)技術(shù)同步備課教學(xué)案 蘇教版選修1（15頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、 第10課時　分子生物學(xué)技術(shù) [學(xué)習(xí)導(dǎo)航]　1.結(jié)合教材了解PCR技術(shù)的基本操作。2.理解PCR擴增DNA片段的原理。 3.結(jié)合教材，嘗試進行目的DNA片段的體外擴增。 [重難點擊]　1.了解PCR技術(shù)的基本操作。2.理解PCR的原理。 一、使用PCR儀的安全措施和PCR反應(yīng)程序 1.DNA分子的結(jié)構(gòu) (1)寫出各個標號的名稱：①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鳥嘌呤；④胸腺嘧啶；⑤脫氧核糖；⑥磷酸基團；⑦胸腺嘧啶脫氧核苷酸；⑧氫鍵；⑨堿基對；⑩一條脫氧核苷酸鏈。 (2)DNA的兩條鏈是反向平行的，為了明確表示DNA鏈的方向，通常將DNA的羥基末端稱為3′端，將磷酸基團的末端稱為5

2、′端，按此原則在圖上方框內(nèi)標出兩條鏈的方向。 答案　左鏈上5′端，下3′端；右鏈上3′端，下5′端。 2.細胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 打開DNA雙螺旋 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3′端起點 3.PCR技術(shù) (1)概念：在體外快速擴增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的技術(shù)稱為PCR技術(shù)。 (2)物質(zhì)條件：DNA模板、四種脫氧核苷酸、TaqDNA

3、聚合酶、引物。 (3)PCR反應(yīng)的過程及結(jié)果 ①PCR反應(yīng)程序 a.變性：在94 ℃高溫下，作為模板的雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA。 b.退火(復(fù)性)：反應(yīng)體系的溫度降至55 ℃，引物與作為模板的單鏈DNA上的特定部位相互配對。 c.延伸：反應(yīng)體系的溫度回升到72 ℃左右，按照單鏈DNA上的脫氧核苷酸序列，4種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補配對原則，在TaqDNA聚合酶的作用下連接到引物之后，使引物鏈延伸，形成互補的DNA雙鏈。 ②結(jié)果 a.PCR擴增一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、退火、延伸三步。 b.兩引物之間的固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴增。 1.PCR原理

4、PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同？請分析原因。 答案　不相同。體內(nèi)DNA復(fù)制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反應(yīng)時所用引物一般是人工加入的一小段單鏈DNA。 2.PCR反應(yīng)過程 (1)PCR反應(yīng)中需要解旋酶和DNA聚合酶嗎？若需要，則與細胞內(nèi)DNA復(fù)制有何區(qū)別？ 答案　PCR反應(yīng)不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反應(yīng)中需要高溫使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高溫。 (2)PCR的每次循環(huán)中應(yīng)如何控制溫度？請分析原因。 答案　每次循環(huán)中先高溫解旋，再低溫使引物與模板結(jié)合，最后適當升溫有利于Taq DNA聚合酶發(fā)揮作用。

5、(3)結(jié)合下圖分析PCR過程中DNA復(fù)制的方向是怎樣的？ 答案　DNA的羥基(—OH)末端為3′端；磷酸基團的末端為5′端。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 歸納總結(jié)　PCR擴增與DNA復(fù)制的異同 項目 DNA復(fù)制 PCR擴增 不 同 點 時期 有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂的間期 任何時期 場所 活細胞內(nèi) 細胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的Taq DNA聚合酶 引物 有轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生RNA作引物，無需人工加入 無轉(zhuǎn)錄，無引物產(chǎn)生，需人工加

6、入兩種DNA引物 特點 邊解旋邊復(fù)制 先全部解旋后開始復(fù)制 緩沖液 不需緩沖液 配制緩沖液代替細胞核液 設(shè)備 無 控制溫度變化的溫控設(shè)備 相 同 點 原理 嚴格遵循堿基互補配對原則 引物 都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 模板 DNA的兩條鏈為模板 特點 半保留復(fù)制 原料 游離的四種脫氧核苷酸 1.下列關(guān)于DNA復(fù)制和PCR技術(shù)的描述中，正確的是(　　) A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5′端延伸DNA鏈 B.DNA復(fù)制不需要引物 C.引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結(jié)合 D.PCR擴增的對象是氨基酸序列

7、答案　C 解析　DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，故DNA復(fù)制需要引物。DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，而不能從5′端延伸DNA鏈。引物通過堿基互補配對原則與DNA母鏈相結(jié)合。PCR擴增的對象是DNA，不是氨基酸序列。 2.PCR技術(shù)有效地解決了因為樣品中DNA含量太低難以對樣品進行研究的問題，而被廣泛應(yīng)用，與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR可以快速擴增所需的DNA片段，請分析回答下列有關(guān)問題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù)中的解旋原理是

8、 。 (2)此過程需要一種Taq DNA聚合酶。該酶是從 中分離的。 (3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。 (4)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在 中才能進行，并且要嚴格控制 條件。 (5)PCR中加入的引物有 種，加入引物的作用是 。 答

9、案　(1)DNA的熱變性原理　(2)水生耐熱細菌Taq　(3)耐高溫　(4)一定的緩沖溶液　溫度　(5)2　作為DNA復(fù)制的起點 解析　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋，其原理是DNA的熱變性原理。(2)Taq DNA聚合酶是從水生耐熱細菌Taq中提取的。(3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的環(huán)境中不變性，具有耐高溫的特性。(4)PCR反應(yīng)需要適宜的溫度和pH，因此PCR反應(yīng)要在一定的緩沖溶液中進行，并需嚴格控制好溫度條件。(5)PCR需要兩種引物，引物的識別位點決定了PCR擴增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段單鏈DNA，作用

10、是引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點。 一題多變 細胞內(nèi)的DNA復(fù)制需要適宜的溫度和pH嗎？若需要，是如何實現(xiàn)的？ 答案　需要。細胞內(nèi)的適宜溫度和pH與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，低等生物與環(huán)境因素有關(guān)。 易錯提醒　與PCR原理有關(guān)的三個易錯點 (1)酶的作用位點：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開；DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。 (2)DNA聚合酶和DNA連接酶：DNA聚合酶是將單個核苷酸連接到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，

11、不需要模板。 (3)PCR中的解旋過程：PCR過程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時的溫度不會破壞磷酸二酯鍵，因此，DNA加熱變性后變?yōu)閱捂湥⑽捶纸獬蓡误w。 二、目的DNA片段的體外擴增與鑒定 1.DNA片段的PCR擴增 (1)準備器材：PCR儀、臺式高速離心機、0.2 mL PCR微量離心管、自動取液器、模板DNA等。 (2)在0.2 mL PCR微量離心管中加入5 μL 10倍濃縮的PCR緩沖液，4種脫氧核苷酸的溶液各5 μL,1 μL模板DNA,5 μL引物1和5 μL引物2,29 μL雙蒸水。 (3)煮沸5 min之后冰浴2 min，低速離心，按照1單位

12、/μL加入TaqDNA聚合酶。 (4)擴增DNA片段的反應(yīng)程序：將微量離心管放入PCR儀中，蓋上樣品池蓋。在94 ℃的條件下預(yù)熱5 min，再設(shè)置反應(yīng)程序為：94 ℃，30 s→55 ℃，30 s→72 ℃，1 min(以上過程循環(huán)30次)。最后一次延伸條件為72 ℃，1 min。 (5)按照PCR儀器操作要求運行反應(yīng)程序。 2.DNA分子的測定 (1)配制二苯胺試劑：分別配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加入1.5 mL濃硫酸，用棕色瓶保存)和B液(體積分數(shù)為0.2%的乙醛溶液)。將0.1 mL B液加入10 mL A液中，混勻。 (2)條件：取一定量擴增前和

13、擴增后的溶液分別放入等量的二苯胺試劑，混勻后觀察顏色變化。用沸水浴加熱上述溶液。 (3)現(xiàn)象：出現(xiàn)藍色現(xiàn)象。 3.定量分析方法：如果需要進行定量分析，可以采用紫外分光光度法或瓊脂糖凝膠電泳法。前者需要使用紫外分光光度計，后者需要使用電泳儀等。 1.實驗過程分析 (1)離心的目的是什么？在離心的過程中，微量離心管的蓋子為什么一定要蓋嚴？ 答案　離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效率。微量離心管的蓋子一定要蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。 (2)在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁，目的是什么？ 答案　離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應(yīng)液混合均勻。 (3)PCR實驗中

14、使用的微量離心管、取液器、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌，為什么這樣操作？還有哪些操作與此目的相同？ 答案　為避免外源DNA等的污染。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，取液器上的槍頭都必須更換。 2.結(jié)果檢測 (1)實驗中為什么要測定DNA的含量？ 答案　實際操作過程中會有許多因素影響DNA含量，所以需要對DNA含量進行測定。 (2)如何判斷DNA擴增成功？ 答案?、倏梢酝ㄟ^計算DNA含量來評價擴增的效果。②電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。 (3)PCR擴增過程可能會出現(xiàn)哪些異常結(jié)果？ 答案　樣品

15、產(chǎn)物少，或產(chǎn)生新的DNA。 3.進行PCR反應(yīng)的具體實驗操作順序應(yīng)為(　　) ①設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序?、诎磁浞綔蕚浜酶鹘M分　③用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分　④進行PCR反應(yīng)?、蓦x心使反應(yīng)液集中在離心管底部 A.②③⑤④① B.①⑤③②④ C.②③⑤①④ D.④②⑤③① 答案　C 解析　PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準備(包括配制配方及將各配方放于實驗臺上)―→移液―→混合―→離心―→反應(yīng)。PCR儀是一種自動控制溫度的儀器，設(shè)計好循環(huán)程序就可以進行反應(yīng)了。 4.近20年來，PCR技術(shù)(多聚酶鏈式反應(yīng))成為分子生物學(xué)實驗室的一種常規(guī)實驗手段，其原理是利用D

16、NA半保留復(fù)制，在試管中進行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在短時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈間的 鍵完全打開，稱為 ；而在細胞中是在 酶的作用下進行的。 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個特定區(qū)段，應(yīng)該加入 種特定的引物。當溫度降低至55 ℃時，引物與兩條“舒展”的模板鏈的特定位置結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是

17、 。 (3)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、適宜的 和 ，前者由 自動調(diào)控，后者則靠 來維持。 (4)通過PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，如果將一個用15N標記的DNA分子放入試管中，以14N標記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則15N標記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是 。 問題導(dǎo)析　(1)解旋是使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，PCR技術(shù)是利用DNA的熱

18、變性原理，細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不論復(fù)制幾次，含有15N標記的DNA分子都只有2個。 答案　(1)氫　解旋　解旋　(2)兩　3′　從子鏈的5′端向3′端延伸　(3)溫度　酸堿度　PCR儀　緩沖液　(4)1/8 解析　(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為解旋，而在細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個基本反應(yīng)步驟：變性(94 ℃)、退火(55 ℃)、延伸(72 ℃)，其特異性依賴于與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增DNA序列互補的片段，兩引物之間的距離決定擴增片段的長度。由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從

19、引物的3′端延伸DNA鏈，則DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(3)PCR技術(shù)與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖溶液)，每一個步驟都需要適宜的溫度和酸堿度等。(4)一個DNA分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成16個DNA分子，15N標記的DNA分子有2個，則15N標記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。 1.PCR利用了DNA的哪種特性來控制DNA的解聚與結(jié)合(　　) A.特異性 B.穩(wěn)定性 C.熱變性 D.多樣性 答案　C 2.符合PCR反應(yīng)條件的一項是(　　) ①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境?、贒

20、NA模板?、酆铣梢铩、芩姆N脫氧核苷酸?、軩NA聚合酶?、轉(zhuǎn)NA解旋酶?、呦拗泼浮、鄿乜卦O(shè)備 A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧ C.③④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑤⑧ 答案　D 解析　PCR反應(yīng)模擬了生物細胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，只是無需解旋酶(可熱變性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。 3.下列關(guān)于PCR的描述中，正確的是(　　) ①PCR是一種酶促反應(yīng)?、谝餂Q定了擴增的特異性　③擴增DNA利用了熱變性的原理?、軘U增的對象是氨基酸序列 A.①②④ B.②③④ C.①③④ D.①②③ 答案　D 解析　PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，在高溫條

21、件下，把DNA的雙鏈打開，緩慢冷卻后，又重新結(jié)合，需要耐高溫的DNA聚合酶，同時，還需要引物，從引物的3′端連接脫氧核苷酸。 4.如圖所示為PCR擴增的產(chǎn)物，請分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A.第一次循環(huán) B.第二次循環(huán) C.第三次循環(huán) D.第四次循環(huán) 答案　A 解析　在PCR反應(yīng)中，以引物為標記，第一次循環(huán)時，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng)，所以會形成DNA分子兩端均含引物的情況，如下圖所示，因此題干中所出現(xiàn)的

22、情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。 5.多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。請回答下列問題： (1)DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將 的末端稱為5′端，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的 開始延伸DNA鏈。 (2)PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀80年代，科學(xué)家從一種Taq細菌中分離到 ，它的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了上述問題。要將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來，所用的培養(yǎng)基叫

23、 。 (3)PCR的每次循環(huán)可以分為 三步。假設(shè)在PCR反應(yīng)中，只有一個DNA片段作為模板，請計算在5次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有 個這樣的DNA片段。 (4)簡述PCR技術(shù)的主要應(yīng)用： (要求至少答兩項)。 答案　(1)磷酸基團　3′端　(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶　選擇培養(yǎng)基　(3)變性、退火和延伸　32　(4)遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等 解析　一條脫氧核苷酸鏈一端是游離的羥基，另一端是游離的磷酸基團，含羥基的一端是3′端，含磷酸基團的是

24、5′端。引物的5′端與模板鏈的3′端結(jié)合，然后沿著引物的3′端延伸。耐高溫的Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是實現(xiàn)PCR的關(guān)鍵，該酶可以利用選擇培養(yǎng)基從一些微生物中分離出來。PCR一次循環(huán)要經(jīng)歷變性、退火和延伸三個階段。 課時作業(yè) [學(xué)考達標] 1.PCR技術(shù)擴增DNA，需要的條件是(　　) ①目的基因?、谝铩、鬯姆N脫氧核苷酸?、蹹NA聚合酶等?、輒RNA　⑥核糖體 A.②③④⑤ B.①②③⑥ C.①②③④ D.①③④⑤ 答案　C 解析　PCR技術(shù)需要目的基因作為擴增的模板，DNA聚合酶催化反應(yīng)的進行，而引物是滿足DNA聚合酶起作用的需要，四種脫氧核苷酸是該過程的原料，以

25、及一定的緩沖溶液和能嚴格控制溫度的溫控設(shè)備。 2.下列有關(guān)PCR反應(yīng)的敘述，正確的是(　　) A.PCR反應(yīng)所需要的引物只是RNA B.PCR反應(yīng)所需要的材料是核糖核苷酸 C.PCR反應(yīng)所需要的酶在60 ℃會變性 D.PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進行 答案　D 解析　PCR反應(yīng)需要的引物一般是DNA，反應(yīng)所需要的材料是脫氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高溫的，在60 ℃不會變性。 3.下列各項屬于引物作用的是(　　) A.打開DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始復(fù)制 D.提供模板 答案　C 解析　DNA分子的復(fù)制具有方向

26、性，即只能從子鏈的5′端→3′端方向進行復(fù)制。當引物與DNA母鏈結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。 4.PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時(　　) A.仍與引物Ⅰ結(jié)合進行DNA子鏈的延伸 B.與引物Ⅱ結(jié)合進行DNA子鏈的延伸 C.同時與引物Ⅰ和引物Ⅱ結(jié)合進行子鏈的延伸 D.無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈 答案　B 解析　當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物固定端為5′端，因此與它互補的子鏈應(yīng)從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結(jié)合延伸DNA子鏈。 5.PC

27、R儀實質(zhì)上是一臺自動調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) ①94 ℃，使DNA分子變性，磷酸二酯鍵斷開　②94 ℃，使DNA分子變性，解開螺旋?、?5 ℃時，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?5 ℃時，引物與DNA單鏈結(jié)合?、?2 ℃時，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 A.①③⑤ B.②③⑤ C.②④⑤ D.②④⑥ 答案　C 解析　PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。當溫度上升至94 ℃時，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到55

28、 ℃時，引物與DNA單鏈結(jié)合，恢復(fù)活性；溫度上升至72 ℃時，DNA分子開始復(fù)制、延伸，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。 6.下列有關(guān)PCR過程的敘述中，不正確的是(　　) A.在PCR的變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，DNA在人體細胞內(nèi)復(fù)制時可利用解旋酶實現(xiàn) B.退火過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依據(jù)堿基互補配對原則完成的 C.延伸過程中需要耐高溫的DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D.PCR與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高 答案　C 解析　變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開，DNA在人體細胞內(nèi)復(fù)制時借助解旋酶來實現(xiàn)；根據(jù)堿基

29、互補配對原則，引物可與 DNA模板鏈結(jié)合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四種脫氧核苷酸為原料；PCR過程所需溫度較高，會導(dǎo)致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫的DNA聚合酶。 [高考提能] 7.有關(guān)下列操作過程的敘述，錯誤的是(　　) A.PCR實驗中使用的微量離心管、取液器、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲存 C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，取液器上的槍頭都必須更換 答案　C 解析　在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱中取出后應(yīng)放在冰塊上

30、緩慢融化，而不能迅速融化，即C項錯誤。 8.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下可以繼續(xù)鏈的延伸)，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如下圖乙所示，其中第⑤種DNA分子有幾個(　　) A.8 B.6 C.4 D.2 答案　A 解析　由圖分析可知：X基因第一次復(fù)制得到兩個兩種DNA分子：①和②；X基因第二次復(fù)制得到四個四種DNA分子：①復(fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④；X基因第三次復(fù)制得到八個五種D

31、NA分子：①復(fù)制得①和③、③復(fù)制得③和⑤、②復(fù)制得②和④、④復(fù)制得④和⑤；X基因第四次復(fù)制得到16個五種DNA分子：①復(fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④、兩個③復(fù)制得兩個③和兩個⑤、兩個④復(fù)制得兩個④和兩個⑤、兩個⑤得到4個⑤。從上面的推測可知，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中有8個⑤。 9.在PCR擴增DNA的實驗中，預(yù)計一個DNA分子經(jīng)過30次循環(huán)后，應(yīng)該得到230個DNA分子，但是結(jié)果只有約210個DNA分子，那么出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因不可能是(　　) A.Taq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制 B.系統(tǒng)設(shè)計欠妥 C.循環(huán)次數(shù)不夠 D.引物不能與母鏈結(jié)合 答案　D 解析　如果Taq DNA聚合

32、酶活力不夠，或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少，A項正確；如果PCR系統(tǒng)設(shè)計欠妥，則達不到預(yù)期的結(jié)果，B項正確；如果循環(huán)次數(shù)過少，產(chǎn)物的量比預(yù)期的少，C項正確；如果引物設(shè)計不合理，若不能與模板DNA結(jié)合，將造成無法進行擴增，而結(jié)果得到了210個DNA分子，D項錯誤。 10.有關(guān)PCR技術(shù)的說法，下列敘述不正確的是(　　) A.多聚酶鏈式反應(yīng)，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù) B.在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似 C.PCR反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D.PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為

33、變性、退火和延伸 答案　C 解析　PCR是多聚酶鏈式反應(yīng)的英文縮寫，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、退火和延伸三步。 11.PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))技術(shù)是一項在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，下圖表示合成過程，請據(jù)圖分析回答下面的問題。 (1)A過程高溫使DNA變性解旋，對該過程的原理敘述正確的是 。 A.該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B.該過程用到限制酶破壞磷酸二酯鍵 C.該

34、過程不需要解旋酶的作用 D.該過程與人體細胞的過程完全相同 (2)C過程要用到的酶是耐高溫的 。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴增時可以 加入， (填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反應(yīng)除提供酶外，還需要滿足的基本條件有： 。 (3)如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記，控制“94 ℃－55 ℃－72 ℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占 。 答案　(1

35、)C (2)DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸，通過控制溫度和酸堿度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行 (3)25% 解析　(1)高溫所起的作用類似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂湣?2)C過程是PCR技術(shù)的延伸階段，當系統(tǒng)溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。這種DNA聚合酶在高溫下不變性，所以一次性加入即可。(3)PCR技術(shù)遵循半保留復(fù)制的特點。經(jīng)過三次循環(huán)，共產(chǎn)生8個DNA分子，其中有2個DNA分子含有15N標記。 12.PCR是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因

36、片段擴增到數(shù)百萬個。PCR需要模板DNA、引物、脫氧核苷酸和DNA聚合酶等條件。如圖為模板DNA分子及2種引物，請據(jù)圖回答相關(guān)問題： (1)PCR的全稱是 。PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR技術(shù)中先用94 ℃高溫處理的目的是 ，而這一過程在細胞內(nèi)是通過 實現(xiàn)的。 (2)在PCR技術(shù)中所需要的引物通常為一段單鏈DNA。請在圖中繪出引物結(jié)合的位置。 (3)若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入 個引物。 (4)DNA子鏈復(fù)制的

37、方向是 ，這是由于 。 答案　(1)多聚酶鏈式反應(yīng)　使DNA變性(使DNA的兩條鏈解開)　解旋酶的催化 (2)如圖所示 (3)211－2 (4)從5′端到3′端　DNA聚合酶只能從引物的3′端開始連接單個脫氧核苷酸分子 解析　PCR技術(shù)又稱多聚酶鏈式反應(yīng)。在PCR技術(shù)中，用94 ℃高溫處理的目的是使DNA分子中的氫鍵斷裂，使兩條鏈解開，即使DNA分子變性。引物通常是一種單鏈DNA，它能與解開的DNA母鏈的3′端結(jié)合，為DNA聚合酶提供吸附位點，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，從而決定了D

38、NA子鏈復(fù)制的方向是從5′端到3′端。在DNA分子擴增時，需要2種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復(fù)制的起點，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，即2×210－2＝211－2 (個)。 13.PCR技術(shù)有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行研究的問題，而被廣泛應(yīng)用，此過程需要一種Taq DNA聚合酶。 請回答有關(guān)問題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù) 來實現(xiàn)。 (2)Taq DNA聚合酶是從熱泉中的Taq細菌中分離出來的。 ①為什么Taq細菌能從熱泉中被篩選出來呢？

39、 。 ②Taq DNA聚合酶的功能是 。 (3)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在 中才能進行，并且要嚴格控制 條件。 (4)PCR反應(yīng)中加入的引物有 種，加入引物的作用是 。 答案　(1)通過高溫使DNA分子發(fā)生解旋 (2)①熱泉70～80 ℃的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物?、诖呋撗鹾塑账嶂g形成磷酸二酯鍵 (3)一

40、定的緩沖溶液　溫度 (4)2　作為DNA復(fù)制的起點 解析　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋。(2)①利用Taq細菌特有的特性與其他細菌區(qū)分開來，Taq細菌具有耐高溫的特性，放在高溫環(huán)境下，其他絕大多數(shù)細菌死亡，而Taq細菌得以保留。②在DNA分子復(fù)制中，Taq DNA聚合酶將一個脫氧核苷酸的脫氧核糖和另一個脫氧核苷酸的磷酸連接形成磷酸二酯鍵。(3)PCR反應(yīng)是在一定的緩沖溶液中進行的，并需嚴格控制好溫度條件。(4)PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制過程中的原料是完全相同的，并加入2種引物，引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點。

41、 [真題體驗] 14.(2013·江蘇，22)小鼠雜交瘤細胞表達的單克隆抗體用于人體試驗時易引起過敏反應(yīng)，為了克服這個缺陷，可選擇性擴增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達。下列相關(guān)敘述正確的是(多選)(　　) A.設(shè)計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列 B.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列 C.PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶 D.一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細胞 答案　BD 解析　設(shè)計擴增目的基因的引物時，要考慮擴增的目的基因與載體兩端序列堿基互補配對，A錯誤；DNA復(fù)制沿著模板進行，不必知道基因的全部序列，

42、B正確；PCR技術(shù)中的DNA聚合酶是耐高溫的DNA聚合酶，不是從受體細胞中提取的DNA聚合酶，C錯誤；目的基因編碼產(chǎn)物不同，相應(yīng)的受體細胞不同，D正確。 15.(2011·江蘇，33節(jié)選)請回答基因工程方面的有關(guān)問題： (1)利用PCR技術(shù)擴增目的基因，其原理與細胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如圖所示)。 圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。 ①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為 。 ②在第 輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。 (2)設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物都不合理(

43、如圖)，請分別說明理由。 ①第1組： ； ②第2組： 。 (3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為 。 答案　(1)①15/16?、谌? (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效 ②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效 (3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 解析　(1)①從理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)某同學(xué)設(shè)計的兩組引物都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效。②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。 15