《2019-2020學年高中生物 第4章 生物化學與分子生物學技術(shù)實踐 第1節(jié) 生物成分的分離與測定技術(shù)學案 蘇教版選修1》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2019-2020學年高中生物 第4章 生物化學與分子生物學技術(shù)實踐 第1節(jié) 生物成分的分離與測定技術(shù)學案 蘇教版選修1（10頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、第一節(jié)　生物成分的分離與測定技術(shù) [學習目標]　1.掌握分離與測定生物成分中蛋白質(zhì)的技術(shù)。(難點)　2.掌握采用醋酸纖維薄膜電泳的方法分離并純化蛋白質(zhì)。(重點)　3.掌握采用水蒸氣蒸餾法和脂溶性有機溶劑提取法提取脂肪成分。(重難點) 知識點一| 分離與測定生物成分中的蛋白質(zhì) 1．抽提液的選擇 2．分離蛋白質(zhì)的方法 (1)離心沉降法：通過控制離心速率，使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降分層。 (2)薄膜透析法：利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，使蛋白質(zhì)與小分子化合物分離開的純化蛋白質(zhì)的方法。 (3)凝膠色譜法 ①概念：根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小對其進行有效分離的方法。 ②

2、凝膠 ③原理 是否進 入凝膠 顆粒 移動途徑 路程 移動 速度 洗脫 次序 大分子 蛋白質(zhì) 不能 進入 凝膠顆粒 間隙 較短 較快 先洗 脫出來 小分子 蛋白質(zhì) 可以 進入 凝膠顆 粒內(nèi)部 較長 較慢 后洗 脫出來 (4)電泳法：將所帶電荷的數(shù)量和性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)從混合樣品中分離并純化出來。 3．血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 配制試劑―→準備器材―→架濾紙橋―→浸泡薄膜―→細心點樣―→平懸薄膜―→實施電泳―→染色―→漂洗―→脫色。 探討：在抽提液中加入蛋白酶抑制劑的目的是什么？ 提示：防止提取過程中蛋白質(zhì)被蛋白酶分解

3、。 探討：在電泳過程中，影響泳動速度的因素有哪些？ 提示：帶電顆粒的性質(zhì)，即顆粒的大小、形狀和所帶電荷的多少；此外還有電場強度、溶液的pH等因素。 探討：洗滌紅細胞時能否用蒸餾水代替生理鹽水？ 提示：不能。生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂，在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白質(zhì)與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起加大了分離的難度。 1．蛋白質(zhì)的分離方法 (1)薄膜透析法 ①原理：蛋白質(zhì)水溶液具有親水膠體溶液性質(zhì)，不能透過半透膜。 ②目的：去除小分子化合物雜質(zhì)，如無機鹽、單糖、二糖、氨基酸等。 ③常用的半透膜：腸衣、玻璃紙等。 ④步驟：將待純化的

4、蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)，再把透析袋放入透析液中即可。 (2)離心沉降法 ①原理：在離心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，從而被分離。 ②目的：使分子大小、密度不同的不同種類的蛋白質(zhì)彼此分離。 (3)電泳 ①概念：帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。 ②原理：不同的物質(zhì)所帶電荷不同，顆粒的大小、形狀不同，因此，在電場中的泳動速度不同。 ③影響泳動速度的因素：帶電顆粒的性質(zhì)，即顆粒的大小、形狀和所帶電荷的多少；此外還有電場強度、溶液的pH等因素。 ④泳動規(guī)律：帶電顆粒直徑越小、越接近于球形，所帶凈電荷越多，則在電場中的泳動速度越快；反之，則越慢。

5、 ⑤常用方法：支持物電泳。 ⑥支持物：濾紙、醋酸纖維薄膜、大分子凝膠等。 2．血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 (1)特點 ①電泳后區(qū)帶界限清晰。 ②通電時間較短(60～90 min)。 ③它對各種蛋白質(zhì)都幾乎完全不吸附，因此無拖尾現(xiàn)象。 ④對染料也沒有吸附，因此不結(jié)合的染料能完全洗掉，無樣品處幾乎完全無色。 (2)關(guān)鍵步驟及其技術(shù)要求：點樣是本實驗的關(guān)鍵步驟。點樣前，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散；但不宜太干，否則樣品不易進入膜內(nèi)，造成點樣起始參差不齊，影響分離效果。 (3)結(jié)果及其分析 ①結(jié)果： 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜示意圖 ②結(jié)果分析：從電

6、泳圖譜示意圖中可以看出： a．血清蛋白主要包括五種蛋白質(zhì)，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：γ-球蛋白＞α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β-球蛋白。 b．由五種蛋白質(zhì)所處的位置可判斷出它們均帶負電荷，四種球蛋白在電場中的泳動速度由快到慢依次為α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β-球蛋白＞γ-球蛋白。 3.凝膠色譜法分離血紅蛋白 (1)樣品處理：以低速短時間離心分離紅細胞，獲得被洗凈的紅細胞。 (2)血紅蛋白的釋放、分離和透析 ①用蒸餾水和甲苯破裂紅細胞，釋放出血紅蛋白，得到混合液。 ②離心混合液，過濾除去沉淀層，用分液漏斗分離出紅色透明液體。 ③用磷酸緩沖液透析紅色透明液體12 h。

7、(3)凝膠的制備：用蒸餾水溶脹交聯(lián)葡萄糖凝膠，制成凝膠懸浮液。 (4)色譜柱的裝填 ①垂直固定洗凈的層析柱選擇有薄膜的端為下口。 ②打開下端的乳膠管開口，將攪動均勻的凝膠懸浮液沿柱的內(nèi)壁緩緩一次性倒入柱內(nèi)。 ③連接洗脫瓶，用洗脫液充分洗滌平衡凝膠12 h。 (5)樣品的加入 ①打開流出口，讓緩沖液下降到剛好與凝膠面平行，關(guān)閉出口。 ②用滴管將樣品溶液沿柱壁輕輕地加入到色譜柱頂端。 ③打開流出口，使樣品液逐漸滲入到凝膠。 (6)洗脫與收集 ①連接好層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1 mL，進行洗脫。 ②當紅色的蛋白質(zhì)接近出口時，收集洗脫液。 1．下列關(guān)于蛋白質(zhì)的純化方

8、法的敘述，錯誤的是(　　) A．純化主要是根據(jù)蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的理化性質(zhì)的差異進行的 B．透析法可去除小分子化合物雜質(zhì)，原理是不同分子所攜帶凈電荷不同 C．通過控制離心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)沉降分層，從而分離不同的蛋白質(zhì) D．不同的物質(zhì)在同一電場中的泳動速度不同，因此可用電泳法分離蛋白質(zhì) B　[透析法分離純化蛋白質(zhì)是因為蛋白質(zhì)的分子大，不能透過半透膜。] 2．下列關(guān)于血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的說法中，不正確的是(　　) A．架濾紙橋時，待濾紙條濕潤后，要驅(qū)除氣泡，以便使濾紙緊貼于支架上 B．浸泡薄膜時要識別出光澤面，并做記號 C．平懸薄膜時，有記號

9、的一面朝上 D．從染色液中取出薄膜后，用濾紙條壓平并吸干，再浸入透明液中脫色 D　[薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白質(zhì)區(qū)底色脫凈為止，然后才用透明液脫色。] 3．下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是(　　) A．可采集豬血作為實驗材料 B．用蒸餾水重復洗滌紅細胞 C．血紅蛋白釋放后應低速短時間離心 D．洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液 A　[血紅蛋白存在于紅細胞中，而哺乳動物的成熟紅細胞中無核、無細胞器，因此細胞中的干擾物質(zhì)相應較少；洗滌紅細胞時，應用生理鹽水；血紅蛋白釋放后，采用的離心速度為2 000 r/min，時間是10 min；紅色的蛋白質(zhì)接近

10、色譜柱出口時，開始收集洗脫液。]知識點二| 從生物材料中提取芳香油 1．提取方法 主要有蒸餾法、壓榨法和萃取法等，具體采用的方法要根據(jù)植物材料的特點來決定。 (1)對玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性較強，能隨水蒸氣蒸發(fā)的植物芳香油通常利用蒸餾法提取。 (2)檸檬油、甜橙油易受機械壓力作用而直接榨出，一般采用壓榨法制得。 (3)如橘皮芳香油既可采用蒸餾法提取，也可采用壓榨法制得。 (4)如制取茉莉浸膏還可采用萃取法制取。 2．蒸餾 (1)概念：將液體加熱至沸騰，使液體變?yōu)檎魵?，然后使蒸氣冷卻再凝結(jié)為液體，這兩個過程的聯(lián)合操作稱為蒸餾，是分離和提純液態(tài)混合物常用的方法之一。 (2)分

11、離的種類 ①易揮發(fā)和不易揮發(fā)的物質(zhì)。 ②液體混合物中沸點不同的物質(zhì)。 3．水蒸氣蒸餾法提取橘皮中的芳香油 探討：橘皮芳香油的主要成分是什么？有哪些主要用途？ 提示：主要成分是檸檬烯。主要用于生產(chǎn)食用香精、化妝品香精和醫(yī)藥香精。 探討：適合用水蒸氣蒸餾法提取的成分應具有怎樣的特性？ 提示：適用于具有揮發(fā)性的，能隨水蒸氣蒸發(fā)而不被破壞，與水不發(fā)生反應，且難溶或不溶于水的成分的提取。 探討：在水蒸氣蒸餾橘皮中的芳香油時，冷凝管的出水門為什么安裝在進水口的上端？ 提示：目的是為了使產(chǎn)生的蒸氣充分冷卻。 1．提取方法 基本方法有三種：蒸餾法、壓榨法和萃取法。具體采用

12、哪種方法要根據(jù)植物原料的特點來決定。 最常用的方法——水蒸氣蒸餾法 (1)原理：水和芳香油的沸點不同，利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，再冷卻分離。 (2)分類：根據(jù)蒸餾過程中原料放置的位置，可以將水蒸氣蒸餾法劃分為水中蒸餾、水上蒸餾和水氣蒸餾。 (3)適用范圍：適用于具有揮發(fā)性的，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，與水不發(fā)生反應，且難溶或不溶于水的成分的提取。此類成分的沸點多在100 ℃以上，并在100 ℃左右有一定的蒸氣壓。中藥的揮發(fā)油、某些小分子生物堿如麻黃堿、煙堿、檳榔堿以及某些小分子的酚性物質(zhì)如牡丹酚等的提取可采用水蒸氣蒸餾。 2．水蒸氣蒸餾裝置的安裝

13、(1)正確安裝蒸餾裝置 ①固定熱源——酒精燈。 ②固定蒸餾瓶，保持蒸餾瓶軸心與鐵架臺的水平面垂直。 ③安裝蒸餾頭，使蒸餾頭的橫截面與鐵架臺平行。 ④連接冷凝管，保證上端出水口向上，通過橡皮管與水池相連；下端進水口向下，通過橡皮管與水龍頭相連。 ⑤連接接液管(或稱尾接管)。 ⑥將接收瓶瓶口對準接液管的出口。 ⑦將溫度計固定在蒸餾瓶瓶口處，使溫度計水銀球的上限與蒸餾瓶側(cè)管的下限處在同一水平面上。 水蒸氣、蒸餾裝置 (2)實驗操作流程 →→→ ↓　　　　 ←← (3)實驗注意事項 ①安裝裝置順序：從左到右，自下而上。拆卸儀器時與安裝時相反。 ②燒瓶中的液體量：燒瓶容

14、積的～。 ③加熱時防暴沸：墊石棉網(wǎng)，向液體中加入幾片碎石或瓷片。 ④溫度計位置：溫度計的水銀球應與蒸餾燒瓶的支管口下沿保持水平。 ⑤冷凝管中水流方向：從下方進水，上方出水，與蒸氣流向相反。 ⑥裝置安裝好后，應先在冷凝管中通水再加熱。 ⑦除水：加入無水Na2SO4后，放置時間可適當長些。 ⑧溫度及時間：為提高產(chǎn)品質(zhì)量，要嚴格控制蒸餾溫度，可適當延長蒸餾時間。 1．下列屬于植物芳香油理化性質(zhì)的是(　　) ①具有較強的揮發(fā)性?、谝兹苡谒、垡兹苡谟袡C溶劑 ④具有特殊的植物香味 A．①②③　　　　　　 B．②③④ C．①③④ D．①②④ C　[植物芳香油是植物有效成分的

15、提取液，其特點是有特殊的植物香味和較強的揮發(fā)性，且不易溶于水，易溶于有機溶劑。] 2．如圖是用水蒸氣蒸餾法從薄荷葉中提取薄荷油的裝置圖，請據(jù)圖補充完整下面的實驗并回答有關(guān)問題： 水蒸氣蒸餾裝置 Ⅰ.實驗步驟： (1)安裝好如圖所示的裝置，特別要注意將冷凝器夾好。 (2)將薄荷葉盡量剪碎，取適量的薄荷葉放入________瓶內(nèi)。 (3)向________瓶內(nèi)加水，至容積的________左右，為防止出現(xiàn)水堿，可加入數(shù)滴稀硫酸，還應向瓶中放入幾粒________________以防暴沸。 (4)向冷凝器中通入________。 (5)放好連接管，將連接管的出口放在接收瓶中。接收

16、瓶口上蓋一小塊鋁箔或牛皮紙。 (6)將蒸氣發(fā)生器加熱，至瓶中的水沸騰，然后調(diào)節(jié)火的大小，以維持水穩(wěn)定的沸騰溫度。 (7)當接收瓶內(nèi)漂在水上的油狀物(即精油)不再增多時即可停止實驗。 Ⅱ.回答有關(guān)問題： (1)A蒸餾瓶通入B蒸餾瓶中的連接管為什么插入B蒸餾瓶底部？ _____。 (2)冷凝器的作用是______________________________________________。 (3)接收瓶口上蓋一小塊鋁箔或牛皮紙，其目的是____________________ ____________________________________________________

17、__________。 [解析]　水蒸氣蒸餾法的原理是利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后混合物又會重新分出油層和水層。用水蒸氣蒸餾法提取芳香油時，原料放入B瓶中，通入水蒸氣的玻璃管到達瓶底，讓水蒸氣自下而上進行蒸餾。A瓶中水量不能加滿，約占2/3就行，為防止水暴沸，可向A瓶內(nèi)放入幾粒沸石或碎玻璃、碎磚瓦等。薄荷油具有揮發(fā)性，因此在接收瓶口上蓋一小塊鋁箔或牛皮紙。 [答案]?、?(2)B　(3)A　2/3　沸石或碎玻璃、碎磚瓦　(4)自來水 Ⅱ.(1)讓水蒸氣自下而上進行蒸餾　(2)使混合氣體冷凝　(3)薄荷油具有揮發(fā)性，以減少薄荷油的散失 [課堂小結(jié)]

18、 知識網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 核心語句歸納 1.分離與測定生物成分中蛋白質(zhì)的技術(shù)包括離心沉降法、薄膜透析法、凝膠色譜法和電泳法等。 2.離心沉降法是通過控制離心速度，使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降分層，從而分離出不同種類的蛋白質(zhì)。 3.凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法，相對分子質(zhì)量大的先洗脫出來，相對分子質(zhì)量小的后洗脫出來。 4.在電泳中，待分離樣品中分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀都會影響分子的遷移速度。 5.薄膜透析法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離開的純化蛋白質(zhì)的方法。 6.提取植物芳香油的方法有蒸餾法、壓榨法

19、和萃取法等。 1．用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)(　　) A．路程較長，移動速度較慢 B．路程較長，移動速度較快 C．路程較短，移動速度較慢 D．路程較短，移動速度較快 D　[凝膠顆粒內(nèi)部有許多貫穿的通道，當相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。] 2．蛋白質(zhì)的分離與純化是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是(　　) A．根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離

20、 B．根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等，可通過電泳法分離蛋白質(zhì) C．根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) D．根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì) A　[蛋白質(zhì)分子是生物大分子，都不能通過半透膜，因此不能利用半透膜分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小可以使蛋白質(zhì)分子在電場中獲得不同的遷移速度，因此可以利用電泳法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小不同，通過凝膠柱的時間不同，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，具有不同的離心力，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì)。] 3．在玫瑰精油提取過程中，依次用到清水、Na

21、Cl、無水Na2SO4，它們的作用分別是(　　) A．溶解、萃取、除水 B．蒸餾、萃取、除顆粒雜質(zhì) C．蒸餾、油水分層、除水 D．溶解、油水分層、萃取 C　[加入清水共沸，可以通過水分子向原料細胞中滲透，植物中芳香油向水中擴散，并隨水分一起蒸餾出來；加入NaCl的目的是使油水分層，便于分液；加入無水Na2SO4可除去芳香油中的水分，提高產(chǎn)品純度。] 4．凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡單的分離技術(shù)，對高分子物質(zhì)有很好的分離效果，目前已經(jīng)被多個領(lǐng)域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答下列問題： (1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來

22、的是________，原因是___________________________________________________________________ ________________________________________________________________。 (2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結(jié)構(gòu)可由________________替代。 (3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是_____________ _____________________________________________________

23、_________。 (4)洗脫用的液體應盡量與浸泡凝膠所用的液體________(填“相同”或“不同”)，洗脫時，對洗脫液的流速要求是________。 [解析]　(1)用凝膠色譜技術(shù)分離各種不同蛋白質(zhì)時，大分子物質(zhì)由于直徑較大，只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔，在向下移動的過程中，從一個凝膠顆粒內(nèi)擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒內(nèi)，如此不斷地進入和擴散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，所以大分子物質(zhì)先洗脫出來。(2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結(jié)構(gòu)可由尼龍網(wǎng)和尼龍紗替代。(3)在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干、露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。(4)洗脫液應與浸泡凝膠所用液體相同，且洗脫液流速要穩(wěn)定，以免干擾洗脫結(jié)果。 [答案]　(1)a　a相對分子質(zhì)量較大，無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠間隙移動，路程較短，移動速度較快 (2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗 (3)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果 (4)相同　保持穩(wěn)定 - 10 -