《2019-2020學(xué)年高中生物 第4章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第2節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)案 蘇教版選修1》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2019-2020學(xué)年高中生物 第4章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第2節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)案 蘇教版選修1（9頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第二節(jié)　分子生物學(xué)技術(shù) [學(xué)習(xí)目標(biāo)]　1.簡述PCR技術(shù)的原理及基本操作步驟。(重難點(diǎn))　2.嘗試進(jìn)行DNA片段的PCR擴(kuò)增。(難點(diǎn)) 知識點(diǎn)一| PCR擴(kuò)增的原理和過程 1．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件 原料 4種脫氧核苷酸 模板 2條DNA母鏈 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸 2.PCR擴(kuò)增技術(shù) (1)概念：在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，又稱為體外基因擴(kuò)增技術(shù)或DNA擴(kuò)增技術(shù)。 (2)PCR技術(shù)的原理： ①條件：DNA模板、TaqDNA聚合酶、脫氧核苷酸引物、四種脫氧核苷酸。

2、 ②PCR擴(kuò)增的特點(diǎn)：快速、簡便和靈敏。 ③進(jìn)行PCR的先決條件：待擴(kuò)增的DNA片段3′端的脫氧核苷酸序列要為已知。 ④引物序列確定的依據(jù)是：被擴(kuò)增區(qū)域的3′端邊界DNA序列。 3．PCR反應(yīng)的過程 — 探討：什么是引物？DNA復(fù)制時為什么需要引物？ 提示：所謂引物是指兩段與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的一小段DNA或RNA片段。在DNA擴(kuò)增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應(yīng)加入兩種引物。 探討：為什么PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶？ 提示：因?yàn)镻CR反應(yīng)過程中變性和延伸都需要較高的溫度，一般的DNA聚合酶

3、在這種溫度下會變性失活，只有耐高溫的TaqDNA聚合酶在這種溫度下可以正常發(fā)揮作用。 探討：如果某DNA片段經(jīng)過PCR反應(yīng)擴(kuò)增了4個循環(huán)，請計(jì)算雙鏈中都含引物的DNA分子的數(shù)目。 提示：由于DNA復(fù)制具有半保留復(fù)制的特點(diǎn)，所以含有母鏈的DNA分子只有兩個，其他分子的兩條鏈都含有引物。復(fù)制4次共形成24＝16(個)，有14個DNA分子的兩條鏈均含引物。 1．PCR解旋與復(fù)旋的原理：DNA熱變性的原理 2．PCR的反應(yīng)過程 (1)變性：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到90 ℃以上時，雙鏈間的氫鍵打開，DNA解旋為單鏈，如圖： (2)復(fù)性：當(dāng)系統(tǒng)溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)

4、配對分別與兩條單鏈DNA結(jié)合，如圖： (3)延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到72 ℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸(A，G，C，T)在DNA聚合酶的作用下，從引物的3′末端開始，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，如圖： 3．PCR擴(kuò)增的計(jì)算 理論上DNA呈指數(shù)方式擴(kuò)增。若開始只有一個DNA提供模板，則循環(huán)n次后有2n個；若開始有N0個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為N0·2n個。 1．下列有關(guān)PCR的描述，不正確的是(　　) A．PCR的技術(shù)原理是DNA復(fù)制 B．是一種酶促反應(yīng)，需耐高溫的解旋酶和DNA聚合酶 C．一個DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，可形成2n個D

5、NA片段(n代表循環(huán)的次數(shù)) D．PCR技術(shù)利用DNA的熱變性來控制DNA的解聚與結(jié)合 B　[PCR技術(shù)是利用熱變性原理讓模板DNA分子解旋的而不是通過解旋酶的作用。] 2．PCR技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對樣品進(jìn)行研究的問題，從而被廣泛應(yīng)用，此過程需要TaqDNA聚合酶。請回答有關(guān)問題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù)中應(yīng)用___。 (2)TaqDNA聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌Taq中分離的。 ①為什么在熱泉中只篩選出來Taq細(xì)菌呢？ ________________________________________________

6、_________________ _________________________________________________________________ ________________________________________________________________。 ②TaqDNA聚合酶的功能是________________________________________。 ③TaqDNA聚合酶的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，可用________________法和________________法進(jìn)行分離。 (3)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在____

7、____中才能進(jìn)行，并且要嚴(yán)格控制________條件。 (4)PCR中加入的引物有________種，加入引物的作用是________________。 [解析]　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋。(2)①利用細(xì)菌特有的特性而與其他細(xì)菌區(qū)分開來，Taq細(xì)菌具有耐高溫的特性，放在高溫環(huán)境下，其他絕大多數(shù)細(xì)菌死亡，而Taq細(xì)菌得以保留。②在DNA分子復(fù)制中，TaqDNA聚合酶將一個脫氧核苷酸的脫氧核糖和另一脫氧核苷酸的磷酸連接形成磷酸二酯鍵。③蛋白質(zhì)的分離可以根據(jù)其分子大小和帶電的性質(zhì)和多少使之分離，即凝膠色譜法和電泳法。(3)PCR反應(yīng)是在一定的緩沖溶液中進(jìn)行的，

8、并需嚴(yán)格控制好溫度條件。(4)PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制過程中的原料是完全相同的，并加入小段單鏈DNA或RNA作為引物，引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點(diǎn)。 [答案]　(1)高溫使DNA分子熱變性　(2)①熱泉70 ℃～80 ℃的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物 ②催化脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵 ③凝膠色譜　電泳　(3)一定的緩沖溶液　溫度 (4)2 作為DNA復(fù)制的起點(diǎn) 知識點(diǎn)二| 目的DNA片段的體外擴(kuò)增 1．DNA片段的PCR擴(kuò)增 (1)準(zhǔn)備器材 (2)在0.2 mL PCR薄壁離心管中加入5_μL10倍濃縮的PCR緩沖液，4

9、種脫氧核苷酸的溶液各5 μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2,29_μL雙蒸水。 (3)煮沸5_min之后冰浴2 min，低速離心，按照1單位/μL加入TaqDNA聚合酶。 (4)擴(kuò)增DNA片段的反應(yīng)程序：將微量離心管放入PCR儀中，蓋上樣品池蓋。在94_℃的條件下預(yù)熱5 min，再設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，30 s―→55 ℃，30 s―→72 ℃，1 min(以上過程循環(huán)30次)。最后一次延伸條件為72_℃，1_min。運(yùn)行反應(yīng)程序。 2．DNA分子的測定 探討：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？ 提示：在PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、

10、緩沖液和蒸餾水都要在使用前進(jìn)行高壓滅菌。 探討：為什么要將微量離心管放在離心機(jī)上進(jìn)行離心？ 提示：離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部。 探討：PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶、引物等條件，如何通過設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證？ 提示：在對照組中不加入TaqDNA聚合酶或引物，與實(shí)驗(yàn)組形成對照，就可以證明PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶和引物。 1．PCR實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng) (1)PCR所用的緩沖液配制一定要嚴(yán)格，或者直接購買專用擴(kuò)增緩沖液。 (2)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、吸液槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。 (3)在微

11、量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。 (4)PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意各種反應(yīng)成分的用量，用量不當(dāng)、漏加成分、PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?，均有可能?dǎo)致DNA片段擴(kuò)增的失敗。 (5)PCR擴(kuò)增的是位于兩種引物之間的DNA片段，合理設(shè)計(jì)引物是PCR成功的關(guān)鍵。 2．PCR技術(shù)的應(yīng)用 (1)醫(yī)學(xué)上用該技術(shù)分析人的精液，對細(xì)菌、病毒感染進(jìn)行早期診斷。 (2)對單細(xì)胞中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用于遺傳病的基因診斷，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備無突變的DNA片段供遺傳病患者基因治療時使用。 (3)法醫(yī)學(xué)用此技術(shù)來鑒別罪犯或進(jìn)行親子鑒定。 (4)古生物學(xué)用此技術(shù)分析古生物化石樣品，追溯其

12、生存年代或遷徙蹤跡。 (5)在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中，可運(yùn)用此技術(shù)檢測目的基因是否已經(jīng)成功導(dǎo)入目標(biāo)生物等。 1．下列操作過程的敘述中錯誤的是(　　) A．PCR反應(yīng)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲存 C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換 C　[為了防止外源DNA等因素的污染，PCR反應(yīng)中所用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水等，在使用前要進(jìn)行高壓滅菌；還要將所用的緩沖液和酶分裝成小份；并且使用一次

13、性吸液槍頭，則A、B、D項(xiàng)都正確。在使用前，將PCR所需試劑從冰箱內(nèi)拿出來，放在冰塊上緩慢融化，則C項(xiàng)錯誤。] 2．PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺自動調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) ①94 ℃，使DNA分子變性，失去生物活性 ②94 ℃，使DNA分子變性，解開螺旋?、?6 ℃，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?6 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性?、?2 ℃，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 A．①③⑤　　　　　　 B．②③⑤ C．②④⑤ D．②④⑥ C　[PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合

14、，PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。當(dāng)溫度上升至94 ℃時，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到50 ℃左右(56 ℃)，引物與DNA單鏈結(jié)合，DNA恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性；溫度上升至72 ℃，DNA分子開始復(fù)制延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。] 3．有關(guān)PCR技術(shù)，下列敘述不正確的是(　　) A．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù) B．在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似 C．PCR反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D．PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性、延伸

15、C　[PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文縮寫，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性和延伸三步。] [課堂小結(jié)] 知識網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 核心語句歸納 1.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 2.PCR反應(yīng)需要DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶等條件。 3.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合

16、。 4.PCR每次循環(huán)都包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步。 5.PCR擴(kuò)增DNA片段可以使目的片段呈指數(shù)增長。 6.測定DNA分子的試劑是二苯胺。DNA在酸性條件和加熱下，能與二苯胺試劑生成藍(lán)色的物質(zhì)。 1．PCR利用了DNA熱變性的原理，PCR儀實(shí)際上是一種能自動調(diào)節(jié)溫度的儀器。下列關(guān)于PCR過程中溫度控制的說法，錯誤的是 (　　) A．酶促反應(yīng)需要高溫，是為了保證模板是單鏈 B．延伸的溫度必須高于退火的溫度，而低于變性的溫度 C．要用耐高溫的DNA聚合酶 D．需要耐高溫的解旋酶 D　[PCR是體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，DNA雙鏈的解開不需要解旋酶，靠高溫使其變性。] 2．

17、右圖為DNA變性和退火示意圖，下列相關(guān)說法正確的是(　　) A．向右的過程為加熱(94 ℃)變性的過程 B．向左的過程是DNA雙鏈迅速制冷退火 C．變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實(shí)質(zhì)都相同 D．圖中DNA片段共有4個游離的磷酸基、4個3′端 A　[變性后的DNA在緩慢降溫后才會退火；變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件不同，實(shí)質(zhì)相同；任一DNA片段都有2個游離的磷酸基(5′端)和2個3′端。] 3．下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．PCR技術(shù)的基本原理是DNA雙鏈復(fù)制 B．每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性和延伸三步 C．參與PCR的物質(zhì)有引物、酶、脫氧核糖、模板等 D．一

18、個模板DNA分子第n次循環(huán)需要2n－1對引物 C　[PCR技術(shù)利用了細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的原理，A正確；PCR的一個循環(huán)要經(jīng)歷變性、復(fù)性和延伸三個步驟，B正確；引物、酶、dNTP、模板是參與PCR的物質(zhì)，而不是脫氧核糖，C錯誤；如果開始的基因只有一個，第n－1次結(jié)束后的基因有2n－1個，每個基因復(fù)制1次需要1對引物，第n次循環(huán)需要2n－1對引物，D正確。] 4．近十年來，PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在很短的時間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物

19、體。 (1)加熱使DNA雙鏈打開，這一步是打開________鍵，稱為________。 (2)當(dāng)溫度降低時，引物與模板________端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成兩個DNA分子，此過程中原料是____________，遵循的原則是________________。 (3)PCR技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、酶以外，至少還需要三個條件，即：液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度由________自動調(diào)控，酸堿度則靠________來維持。 (4)DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是(　　) A．可加快DNA的復(fù)制速度 B．引物可與DNA母鏈通過堿基

20、互補(bǔ)配對結(jié)合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA鏈 D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈 [解析]　(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，稱為變性。 (2)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需原料一樣，為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對原則。引物與模板的3′端結(jié)合后，DNA聚合酶才發(fā)揮作用。 (3)PCR技術(shù)除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度靠PCR儀自動調(diào)控，而酸堿度靠緩沖液來維持。 (4)引物的作用是結(jié)合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位點(diǎn)，而DNA聚合酶的作用是從引物的3′端開始催化DNA鏈的延伸，故選D。 [答案]　(1)氫　變性　(2)3′　四種脫氧核苷酸　堿基互補(bǔ)配對原則　(3)PCR儀　緩沖液　(4)D - 9 -