《2019-2020學年高中生物 第4章 生物化學與分子生物學技術(shù)實踐 第2節(jié) 分子生物學技術(shù)學案 蘇教版選修1》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《2019-2020學年高中生物 第4章 生物化學與分子生物學技術(shù)實踐 第2節(jié) 分子生物學技術(shù)學案 蘇教版選修1（9頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、第二節(jié)　分子生物學技術(shù) [學習目標]　1.簡述PCR技術(shù)的原理及基本操作步驟。(重難點)　2.嘗試進行DNA片段的PCR擴增。(難點) 知識點一| PCR擴增的原理和過程 1．細胞內(nèi)DNA復制的條件 原料 4種脫氧核苷酸 模板 2條DNA母鏈 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸 2.PCR擴增技術(shù) (1)概念：在體外快速擴增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的實驗技術(shù)，又稱為體外基因擴增技術(shù)或DNA擴增技術(shù)。 (2)PCR技術(shù)的原理： ①條件：DNA模板、TaqDNA聚合酶、脫氧核苷酸引物、四種脫氧核苷酸。

2、 ②PCR擴增的特點：快速、簡便和靈敏。 ③進行PCR的先決條件：待擴增的DNA片段3′端的脫氧核苷酸序列要為已知。 ④引物序列確定的依據(jù)是：被擴增區(qū)域的3′端邊界DNA序列。 3．PCR反應的過程 — 探討：什么是引物？DNA復制時為什么需要引物？ 提示：所謂引物是指兩段與待擴增的DNA序列互補的一小段DNA或RNA片段。在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應加入兩種引物。 探討：為什么PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶？ 提示：因為PCR反應過程中變性和延伸都需要較高的溫度，一般的DNA聚合酶

3、在這種溫度下會變性失活，只有耐高溫的TaqDNA聚合酶在這種溫度下可以正常發(fā)揮作用。 探討：如果某DNA片段經(jīng)過PCR反應擴增了4個循環(huán)，請計算雙鏈中都含引物的DNA分子的數(shù)目。 提示：由于DNA復制具有半保留復制的特點，所以含有母鏈的DNA分子只有兩個，其他分子的兩條鏈都含有引物。復制4次共形成24＝16(個)，有14個DNA分子的兩條鏈均含引物。 1．PCR解旋與復旋的原理：DNA熱變性的原理 2．PCR的反應過程 (1)變性：當系統(tǒng)溫度上升到90 ℃以上時，雙鏈間的氫鍵打開，DNA解旋為單鏈，如圖： (2)復性：當系統(tǒng)溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補

4、配對分別與兩條單鏈DNA結(jié)合，如圖： (3)延伸：當系統(tǒng)溫度上升到72 ℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸(A，G，C，T)在DNA聚合酶的作用下，從引物的3′末端開始，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如圖： 3．PCR擴增的計算 理論上DNA呈指數(shù)方式擴增。若開始只有一個DNA提供模板，則循環(huán)n次后有2n個；若開始有N0個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為N0·2n個。 1．下列有關PCR的描述，不正確的是(　　) A．PCR的技術(shù)原理是DNA復制 B．是一種酶促反應，需耐高溫的解旋酶和DNA聚合酶 C．一個DNA片段經(jīng)PCR擴增，可形成2n個D

5、NA片段(n代表循環(huán)的次數(shù)) D．PCR技術(shù)利用DNA的熱變性來控制DNA的解聚與結(jié)合 B　[PCR技術(shù)是利用熱變性原理讓模板DNA分子解旋的而不是通過解旋酶的作用。] 2．PCR技術(shù)有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行研究的問題，從而被廣泛應用，此過程需要TaqDNA聚合酶。請回答有關問題： (1)體內(nèi)DNA復制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù)中應用___。 (2)TaqDNA聚合酶是從水生耐熱細菌Taq中分離的。 ①為什么在熱泉中只篩選出來Taq細菌呢？ ________________________________________________

6、_________________ _________________________________________________________________ ________________________________________________________________。 ②TaqDNA聚合酶的功能是________________________________________。 ③TaqDNA聚合酶的化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)，可用________________法和________________法進行分離。 (3)與體內(nèi)DNA復制相比較，PCR反應要在____

7、____中才能進行，并且要嚴格控制________條件。 (4)PCR中加入的引物有________種，加入引物的作用是________________。 [解析]　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋。(2)①利用細菌特有的特性而與其他細菌區(qū)分開來，Taq細菌具有耐高溫的特性，放在高溫環(huán)境下，其他絕大多數(shù)細菌死亡，而Taq細菌得以保留。②在DNA分子復制中，TaqDNA聚合酶將一個脫氧核苷酸的脫氧核糖和另一脫氧核苷酸的磷酸連接形成磷酸二酯鍵。③蛋白質(zhì)的分離可以根據(jù)其分子大小和帶電的性質(zhì)和多少使之分離，即凝膠色譜法和電泳法。(3)PCR反應是在一定的緩沖溶液中進行的，

8、并需嚴格控制好溫度條件。(4)PCR與體內(nèi)DNA復制過程中的原料是完全相同的，并加入小段單鏈DNA或RNA作為引物，引導DNA復制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復制的起點。 [答案]　(1)高溫使DNA分子熱變性　(2)①熱泉70 ℃～80 ℃的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物 ②催化脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵 ③凝膠色譜　電泳　(3)一定的緩沖溶液　溫度 (4)2 作為DNA復制的起點 知識點二| 目的DNA片段的體外擴增 1．DNA片段的PCR擴增 (1)準備器材 (2)在0.2 mL PCR薄壁離心管中加入5_μL10倍濃縮的PCR緩沖液，4

9、種脫氧核苷酸的溶液各5 μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2,29_μL雙蒸水。 (3)煮沸5_min之后冰浴2 min，低速離心，按照1單位/μL加入TaqDNA聚合酶。 (4)擴增DNA片段的反應程序：將微量離心管放入PCR儀中，蓋上樣品池蓋。在94_℃的條件下預熱5 min，再設置反應程序為：94 ℃，30 s―→55 ℃，30 s―→72 ℃，1 min(以上過程循環(huán)30次)。最后一次延伸條件為72_℃，1_min。運行反應程序。 2．DNA分子的測定 探討：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？ 提示：在PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、

10、緩沖液和蒸餾水都要在使用前進行高壓滅菌。 探討：為什么要將微量離心管放在離心機上進行離心？ 提示：離心的目的是使反應液集中在離心管底部。 探討：PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶、引物等條件，如何通過設置對照實驗進行驗證？ 提示：在對照組中不加入TaqDNA聚合酶或引物，與實驗組形成對照，就可以證明PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶和引物。 1．PCR實驗操作的注意事項 (1)PCR所用的緩沖液配制一定要嚴格，或者直接購買專用擴增緩沖液。 (2)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、吸液槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌。 (3)在微

11、量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。 (4)PCR實驗中應注意各種反應成分的用量，用量不當、漏加成分、PCR程序設置不當?shù)?，均有可能導致DNA片段擴增的失敗。 (5)PCR擴增的是位于兩種引物之間的DNA片段，合理設計引物是PCR成功的關鍵。 2．PCR技術(shù)的應用 (1)醫(yī)學上用該技術(shù)分析人的精液，對細菌、病毒感染進行早期診斷。 (2)對單細胞中的DNA進行擴增，用于遺傳病的基因診斷，并在此基礎上進一步制備無突變的DNA片段供遺傳病患者基因治療時使用。 (3)法醫(yī)學用此技術(shù)來鑒別罪犯或進行親子鑒定。 (4)古生物學用此技術(shù)分析古生物化石樣品，追溯其

12、生存年代或遷徙蹤跡。 (5)在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中，可運用此技術(shù)檢測目的基因是否已經(jīng)成功導入目標生物等。 1．下列操作過程的敘述中錯誤的是(　　) A．PCR反應中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 B．PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存 C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換 C　[為了防止外源DNA等因素的污染，PCR反應中所用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水等，在使用前要進行高壓滅菌；還要將所用的緩沖液和酶分裝成小份；并且使用一次

13、性吸液槍頭，則A、B、D項都正確。在使用前，將PCR所需試劑從冰箱內(nèi)拿出來，放在冰塊上緩慢融化，則C項錯誤。] 2．PCR儀實質(zhì)上是一臺自動調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) ①94 ℃，使DNA分子變性，失去生物活性 ②94 ℃，使DNA分子變性，解開螺旋?、?6 ℃，使DNA分子開始復制、延伸?、?6 ℃，使DNA分子恢復雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復活性?、?2 ℃，使DNA分子開始復制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復活性 A．①③⑤　　　　　　 B．②③⑤ C．②④⑤ D．②④⑥ C　[PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合

14、，PCR儀實質(zhì)上是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。當溫度上升至94 ℃時，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到50 ℃左右(56 ℃)，引物與DNA單鏈結(jié)合，DNA恢復雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復活性；溫度上升至72 ℃，DNA分子開始復制延伸，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。] 3．有關PCR技術(shù)，下列敘述不正確的是(　　) A．多聚酶鏈式反應，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù) B．在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內(nèi)DNA的復制類似 C．PCR反應只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D．PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復性、延伸

15、C　[PCR是多聚酶鏈式反應的英文縮寫，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內(nèi)DNA的復制類似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復性和延伸三步。] [課堂小結(jié)] 知識網(wǎng)絡構(gòu)建 核心語句歸納 1.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 2.PCR反應需要DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶等條件。 3.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合

16、。 4.PCR每次循環(huán)都包括變性、退火(復性)和延伸三步。 5.PCR擴增DNA片段可以使目的片段呈指數(shù)增長。 6.測定DNA分子的試劑是二苯胺。DNA在酸性條件和加熱下，能與二苯胺試劑生成藍色的物質(zhì)。 1．PCR利用了DNA熱變性的原理，PCR儀實際上是一種能自動調(diào)節(jié)溫度的儀器。下列關于PCR過程中溫度控制的說法，錯誤的是 (　　) A．酶促反應需要高溫，是為了保證模板是單鏈 B．延伸的溫度必須高于退火的溫度，而低于變性的溫度 C．要用耐高溫的DNA聚合酶 D．需要耐高溫的解旋酶 D　[PCR是體外DNA擴增技術(shù)，DNA雙鏈的解開不需要解旋酶，靠高溫使其變性。] 2．

17、右圖為DNA變性和退火示意圖，下列相關說法正確的是(　　) A．向右的過程為加熱(94 ℃)變性的過程 B．向左的過程是DNA雙鏈迅速制冷退火 C．變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實質(zhì)都相同 D．圖中DNA片段共有4個游離的磷酸基、4個3′端 A　[變性后的DNA在緩慢降溫后才會退火；變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件不同，實質(zhì)相同；任一DNA片段都有2個游離的磷酸基(5′端)和2個3′端。] 3．下列關于PCR技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．PCR技術(shù)的基本原理是DNA雙鏈復制 B．每次循環(huán)可分為變性、復性和延伸三步 C．參與PCR的物質(zhì)有引物、酶、脫氧核糖、模板等 D．一

18、個模板DNA分子第n次循環(huán)需要2n－1對引物 C　[PCR技術(shù)利用了細胞內(nèi)DNA復制的原理，A正確；PCR的一個循環(huán)要經(jīng)歷變性、復性和延伸三個步驟，B正確；引物、酶、dNTP、模板是參與PCR的物質(zhì)，而不是脫氧核糖，C錯誤；如果開始的基因只有一個，第n－1次結(jié)束后的基因有2n－1個，每個基因復制1次需要1對引物，第n次循環(huán)需要2n－1對引物，D正確。] 4．近十年來，PCR技術(shù)(多聚酶鏈式反應)成為分子生物學實驗室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復制，在試管中進行DNA的人工復制(如圖)，在很短的時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物

19、體。 (1)加熱使DNA雙鏈打開，這一步是打開________鍵，稱為________。 (2)當溫度降低時，引物與模板________端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成兩個DNA分子，此過程中原料是____________，遵循的原則是________________。 (3)PCR技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、酶以外，至少還需要三個條件，即：液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度由________自動調(diào)控，酸堿度則靠________來維持。 (4)DNA的復制需要引物，其主要原因是(　　) A．可加快DNA的復制速度 B．引物可與DNA母鏈通過堿基

20、互補配對結(jié)合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA鏈 D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈 [解析]　(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，稱為變性。 (2)PCR技術(shù)擴增DNA與細胞內(nèi)DNA復制所需原料一樣，為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補配對原則。引物與模板的3′端結(jié)合后，DNA聚合酶才發(fā)揮作用。 (3)PCR技術(shù)除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度靠PCR儀自動調(diào)控，而酸堿度靠緩沖液來維持。 (4)引物的作用是結(jié)合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位點，而DNA聚合酶的作用是從引物的3′端開始催化DNA鏈的延伸，故選D。 [答案]　(1)氫　變性　(2)3′　四種脫氧核苷酸　堿基互補配對原則　(3)PCR儀　緩沖液　(4)D - 9 -