《2016-2017學(xué)年高中生物 第4章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第2節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)案 蘇教版選修1》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2016-2017學(xué)年高中生物 第4章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐 第2節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)案 蘇教版選修1（14頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 第二節(jié)　分子生物學(xué)技術(shù) 1．簡述PCR技術(shù)的原理及基本操作步驟。(重難點(diǎn)) 2．嘗試進(jìn)行DNA片斷的PCR擴(kuò)增。(難點(diǎn)) P C R 擴(kuò) 增 的 原 理 和 過 程 1．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件 原料 4種脫氧核苷酸 模板 2條DNA母鏈 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸 2.PCR擴(kuò)增技術(shù) (1)概念：在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，又稱為體外基因擴(kuò)增技術(shù)或DNA擴(kuò)增技術(shù)。 (2)PCR技術(shù)的原理： ①條件：DNA模板、TaqDNA聚合酶、脫氧核苷酸引物、四種脫氧核

2、苷酸。 ②PCR擴(kuò)增的特點(diǎn)：快速、簡便和靈敏。 ③進(jìn)行PCR的先決條件：待擴(kuò)增的DNA片段3′端的脫氧核苷酸序列要為已知。 ④引物序列確定的依據(jù)是：被擴(kuò)增區(qū)域的3′端邊界DNA序列。 3．PCR反應(yīng)的過程 變性— ↓ 退火(復(fù)性)— ↓ 延伸— [合作探討] 探討1：什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？ 提示：所謂引物是指兩段與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的一小段DNA或RNA片段。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。 探討2：為什么PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶？ 提示：因?yàn)镻

3、CR反應(yīng)過程中變性和延伸都需要較高的溫度，一般的DNA聚合酶在這種溫度下會(huì)變性失活，只有耐高溫的TaqDNA聚合酶在這種溫度下可以正常發(fā)揮作用。 探討3：如果某DNA片段經(jīng)過PCR反應(yīng)擴(kuò)增了4個(gè)循環(huán)，請(qǐng)計(jì)算雙鏈中都含引物的DNA分子的數(shù)目。 提示：由于DNA復(fù)制具有半保留復(fù)制的特點(diǎn)，所以含有母鏈的DNA分子只有兩個(gè)，其他分子的兩條鏈都含有引物。復(fù)制4次共形成24＝16(個(gè))，有14個(gè)DNA分子的兩條鏈均含引物。 [思維升華] 1．PCR解旋與復(fù)旋的原理：DNA熱變性的原理 2．PCR的反應(yīng)過程 (1)變性：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到90 ℃以上時(shí)，雙鏈間的氫鍵打開，DNA解旋為單鏈，如圖

4、： (2)復(fù)性：當(dāng)系統(tǒng)溫度下降到50 ℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)分別與兩條單鏈DNA結(jié)合，如圖： (3)延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到72 ℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸(A，G，C，T)在DNA聚合酶的作用下，從引物的3′末端開始，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如圖： 3．PCR擴(kuò)增的計(jì)算 理論上DNA呈指數(shù)方式擴(kuò)增。若開始只有一個(gè)DNA提供模板，則循環(huán)n次后有2n個(gè)；若開始有N0個(gè)DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為N0·2n個(gè)。 1．下列有關(guān)PCR的描述，不正確的是(　　) A．PCR的技術(shù)原理是DNA復(fù)制 B．是一種酶促反應(yīng)，需耐高

5、溫的解旋酶和DNA聚合酶 C．一個(gè)DNA片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增，可形成2n個(gè)DNA片斷(n代表循環(huán)的次數(shù)) D．PCR技術(shù)利用DNA的熱變性來控制DNA的解聚與結(jié)合 【解析】　PCR技術(shù)是利用熱變性原理讓模板DNA分子解旋的而不是通過解旋酶的作用。 【答案】　B 2．PCR技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行研究的問題，從而被廣泛應(yīng)用，此過程需要TaqDNA聚合酶。請(qǐng)回答有關(guān)問題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA，而PCR技術(shù)中應(yīng)用 __________________________________________________________

6、__ ____________________________________________________________。 (2)TaqDNA聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌Taq中分離的。 ①為什么在熱泉中只篩選出來Taq細(xì)菌呢？ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ _________________________________________________________

7、___。 ②TaqDNA聚合酶的功能是_________________________。 ③TaqDNA聚合酶的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，可用________________法和________________法進(jìn)行分離。 (3)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在________中才能進(jìn)行，并且要嚴(yán)格控制________條件。 (4)PCR中加入的引物有________種，加入引物的作用是________________。 【解析】　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開，從而解旋。(2)①利用細(xì)菌特有的特性而與其他細(xì)菌區(qū)分開來，Taq細(xì)菌具有耐高溫的特性，放在高溫環(huán)境下，其

8、他絕大多數(shù)細(xì)菌死亡，而Taq細(xì)菌得以保留。②在DNA分子復(fù)制中，TaqDNA聚合酶將一個(gè)脫氧核苷酸的脫氧核糖和另一脫氧核苷酸的磷酸連接形成磷酸二酯鍵。③蛋白質(zhì)的分離可以根據(jù)其分子大小和帶電的性質(zhì)和多少使之分離，即凝膠色譜法和電泳法。(3)PCR反應(yīng)是在一定的緩沖溶液中進(jìn)行的，并需嚴(yán)格控制好溫度條件。(4)PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制過程中的原料是完全相同的，并加入小段單鏈DNA或RNA作為引物，引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點(diǎn)。 【答案】　(1)高溫使DNA分子熱變性　(2)①熱泉70 ℃～80 ℃的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物 ②催化脫氧核苷酸

9、之間形成磷酸二酯鍵 ③凝膠色譜　電泳　(3)一定的緩沖溶液　溫度 (4)2　作為DNA復(fù)制的起點(diǎn) 目 的 D N A 片 段 的 體 外 擴(kuò) 增 1．DNA片段的PCR擴(kuò)增 (1)準(zhǔn)備器材 (2)在0.2 mL PCR薄壁離心管中加入5_μL10倍濃縮的PCR緩沖液，4種脫氧核苷酸的溶液各5 μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2,29_μL雙蒸水。 (3)煮沸5_min之后冰浴2 min，低速離心，按照1單位/μL加入Taq聚合酶。 (4)擴(kuò)增DNA片斷的反應(yīng)程序：將離心管放入PCR儀中，蓋上樣品池蓋。在94_℃的條件下預(yù)熱5 min，再設(shè)置反應(yīng)

10、程序?yàn)椋?4 ℃，30 s―→55 ℃，30 s―→72 ℃，1 min(以上過程循環(huán)30次)。最后一次延伸條件為72_℃，1_min。運(yùn)行反應(yīng)程序。 2．DNA分子的測(cè)定 [合作探討] 探討1：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？ 提示：在PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液和蒸餾水都要在使用前進(jìn)行高壓滅菌。 探討2：為什么要將微量離心管放在離心機(jī)上進(jìn)行離心？ 提示：離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部。 探討3：PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶、引物等條件，如何通過設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證？ 提示：在對(duì)照組中不加入TaqDNA聚合酶或引物，與實(shí)驗(yàn)組形成對(duì)照

11、，就可以證明PCR需要耐高溫的TaqDNA聚合酶和引物。 [思維升華] 1．PCR實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng) (1)PCR所用的緩沖液配制一定要嚴(yán)格，或者直接購買專用擴(kuò)增緩沖液。 (2)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、吸液槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。 (3)在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。 (4)PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意各種反應(yīng)成分的用量，用量不當(dāng)、漏加成分、PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?，均有可能?dǎo)致DNA片段擴(kuò)增的失敗。 (5)PCR擴(kuò)增的是位于兩種引物之間的DNA片段，合理設(shè)計(jì)引物是PCR成功的關(guān)鍵。 2．

12、PCR技術(shù)的應(yīng)用 (1)醫(yī)學(xué)上用該技術(shù)分析人的精液，對(duì)細(xì)菌、病毒感染進(jìn)行早期診斷。 (2)對(duì)單細(xì)胞中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用于遺傳病的基因診斷，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步制備無突變的DNA片段供遺傳病患者基因治療時(shí)使用。 (3)法醫(yī)學(xué)用此技術(shù)來鑒別罪犯或進(jìn)行親子鑒定。 (4)古生物學(xué)用此技術(shù)分析古生物化石樣品，追溯其生存年代或遷徙蹤跡。 (5)在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中，可運(yùn)用此技術(shù)檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)成功導(dǎo)入目標(biāo)生物等。 1．下列操作過程的敘述中錯(cuò)誤的是(　　) A．PCR反應(yīng)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－2

13、0 ℃儲(chǔ)存 C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換 【解析】　為了防止外源DNA等因素的污染，PCR反應(yīng)中所用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水等，在使用前要進(jìn)行高壓滅菌；還要將所用的緩沖液和酶分裝成小份；并且使用一次性吸液槍頭，則A、B、D項(xiàng)都正確。在使用前，將PCR所需試劑從冰箱內(nèi)拿出來，放在冰塊上緩慢融化，則C項(xiàng)錯(cuò)誤。 【答案】　C 2．PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：67850055】 ①94 ℃，使DNA分子變性，失去生物活性

14、 ②94 ℃，使DNA分子變性，解開螺旋?、?6 ℃，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?6 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性?、?2 ℃，使DNA分子開始復(fù)制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 A．①③⑤　　　　　　 B．②③⑤ C．②④⑤ D．②④⑥ 【解析】　PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。當(dāng)溫度上升至94 ℃時(shí)，DNA分子變性，解開雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到50 ℃左右(56 ℃)，引物與DNA單鏈結(jié)合，DNA恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性；溫度上升至72 ℃，DNA分子開始復(fù)制延

15、伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。 【答案】　C 3．有關(guān)PCR技術(shù)，下列敘述不正確的是(　　) A．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù) B．在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似 C．PCR反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D．PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性、延伸 【解析】　PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文縮寫，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多

16、次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性和延伸三步。 【答案】　C 1．PCR利用了DNA熱變性的原理，PCR儀實(shí)際上是一種能自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度的儀器。下列關(guān)于PCR過程中溫度控制的說法，錯(cuò)誤的是 (　　) A．酶促反應(yīng)需要高溫，是為了保證模板是單鏈 B．延伸的溫度必須高于退火的溫度，而低于變性的溫度 C．要用耐高溫的DNA聚合酶 D．需要耐高溫的解旋酶 【解析】　PCR是體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，DNA雙鏈的解開不需要解旋酶，靠高溫使其變性。 【答案】　D 2．右圖為DNA變性和退火示意圖，下列相關(guān)說法正確的是(　　) 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：67850056】 A．向右的過程為加熱(94

17、 ℃)變性的過程 B．向左的過程是DNA雙鏈迅速制冷退火 C．變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實(shí)質(zhì)都相同 D．圖中DNA片段共有4個(gè)游離的磷酸基、4個(gè)3′端 【解析】　變性后的DNA在緩慢降溫后才會(huì)退火；變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件不同，實(shí)質(zhì)相同；任一DNA片段都有2個(gè)游離的磷酸基(5′端)和2個(gè)3′端。 【答案】　A 3．PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈做模板時(shí)將(　　) A．仍與引物Ⅰ結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸 B．與引物Ⅱ結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸 C．同時(shí)與引物Ⅰ和引物Ⅱ結(jié)合進(jìn)行子鏈延伸

18、D．無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈 【解析】　當(dāng)由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈做模板時(shí)，此單鏈引物端為5′端，因此與它互補(bǔ)的子鏈應(yīng)從另一端開始合成，即由引物Ⅱ結(jié)合延伸DNA子鏈。 【答案】　B 4．近十年來，PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈打開，這一步是打開________鍵，稱為________。 (2)當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板________端結(jié)合，

19、在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成兩個(gè)DNA分子，此過程中原料是________，遵循的原則是________。 (3)PCR技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、酶以外，至少還需要三個(gè)條件，即：液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度由________自動(dòng)調(diào)控，酸堿度則靠________來維持。 (4)DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是(　　) A．可加快DNA的復(fù)制速度 B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA鏈 D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈 【解析】　(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，

20、稱為變性。 (2)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需原料一樣，為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。引物與模板的3′端結(jié)合后，DNA聚合酶才發(fā)揮作用。 (3)PCR技術(shù)除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度靠PCR儀自動(dòng)調(diào)控，而酸堿度靠緩沖液來維持。 (4)引物的作用是結(jié)合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位點(diǎn)，而DNA聚合酶的作用是從引物的3′端開始催化DNA鏈的延伸，故選D。 【答案】　(1)氫　變性　(2)3′　四種脫氧核苷酸　堿基互補(bǔ)配對(duì)原則　(3)PCR儀　緩

21、沖液　(4)D 課堂小結(jié)： 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 核心回扣 1.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 2.PCR反應(yīng)需要DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶等條件。 3.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。 4.PCR每次循環(huán)都包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步。 5.PCR擴(kuò)增DNA片段可以使目的片段呈指數(shù)增長。 6.測(cè)定DNA分子的試劑是二苯胺。DNA在酸性條件和加熱下，能與二苯胺試劑生成藍(lán)色的物質(zhì)。 學(xué)業(yè)分層測(cè)評(píng)(十) (建議用時(shí)：45分鐘)

22、[學(xué)業(yè)達(dá)標(biāo)] 1．下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述，不正確的是(　　) A．PCR技術(shù)利用的是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 B．PCR技術(shù)可用于基因診斷，判斷親緣關(guān)系等 C．PCR技術(shù)需在體內(nèi)進(jìn)行 D．PCR技術(shù)可能為變性、退火、延伸三個(gè)階段 【解析】　PCR技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱，是在體外快速大量復(fù)制DNA片段的一種新技術(shù)。 【答案】　C 2．下列有關(guān)PCR技術(shù)中引物的敘述，正確的是(　　) A．引物是一小段DNA分子或雙鏈RNA分子 B．?dāng)U增一個(gè)DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目 C．兩種引物之間能夠發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì) D．DNA聚合酶只能從引物的5′端連接脫氧核

23、苷酸 【解析】　引物是一小段單鏈DNA分子或單鏈RNA分子；在DNA分子擴(kuò)增時(shí)，需要兩種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復(fù)制的起點(diǎn)，則擴(kuò)增一個(gè)DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目；兩種引物分別與DNA母鏈之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，并不是兩種引物之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)；DNA聚合酶只能從引物的3′端連接脫氧核苷酸，從而使子鏈DNA分子的復(fù)制方向只能是5′端→3′端。 【答案】　B 3．下列屬于PCR技術(shù)的條件的是(　　) 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：67850057】 ①單鏈的脫氧核苷酸序列引物?、谀康幕蛩诘腄NA片段?、勖撗鹾塑账帷、芎颂呛塑账帷、軩NA連接酶?、弈蜔岬腄NA聚合

24、酶?、逥NA限制性核酸內(nèi)切酶 A．①②③⑤　　　　　　　 B．①②③⑥ C．①②③⑤⑦ D．①②④⑤⑦ 【解析】　PCR技術(shù)的條件：模板，本題為第②項(xiàng)；引物，本題為第①項(xiàng)；原料，本題為第③項(xiàng)；酶，本題為第⑥項(xiàng)。 【答案】　B 4．使用PCR儀具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為(　　) ①設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序?、诎磁浞綔?zhǔn)備好各組分?、塾米詣?dòng)取液器在微量離心管中依次加入各組分 ④進(jìn)行PCR反應(yīng)?、蓦x心使反應(yīng)液集中在離心管底部 A．②③⑤④① B．①⑤③②④ C．②③⑤①④ D．④②⑤③① 【解析】　PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備器材(包括配制配方及將各配方放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上)→移液→混

25、合→離心→反應(yīng)，因PCR儀是一種自動(dòng)控制溫度的儀器，設(shè)計(jì)好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了。 【答案】　C 5．下圖是PCR反應(yīng)過程中哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A．第一次循環(huán)　　　　 B．第二次循環(huán) C．第三次循環(huán) D．第四次循環(huán) 【解析】　在PCR反應(yīng)中，以引物為標(biāo)記，第一次循環(huán)時(shí)加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每個(gè)子代DNA中只有一種引物。 【答案】　A 6．DNA體內(nèi)復(fù)制和PCR分別利用了DNA的哪種特性原理來控制DNA的解聚與結(jié)合(　　) A．酶催化、特異性 B．熱變性、穩(wěn)定性 C．酶催化、熱變性

26、D．熱變性、多樣性 【解析】　只有解開DNA雙鏈，才能進(jìn)行堿基配對(duì)，進(jìn)行DNA的復(fù)制。DNA體內(nèi)復(fù)制時(shí)，通過解旋酶打開氫鍵。PCR過程中，無解旋酶來打開雙鏈中的氫鍵，因此DNA的解旋和復(fù)性都是通過控制溫度來完成的，依據(jù)的原理是熱變性。 【答案】　C 7．PCR實(shí)驗(yàn)中用到微量離心管、緩沖液和蒸餾水，使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是(　　) 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：67850058】 A．反復(fù)洗滌 B．用酒精擦洗 C．高壓滅菌 D．在－20 ℃保存 【解析】　在PCR實(shí)驗(yàn)中，為了避免外源DNA等因素的污染，微量離心管、槍頭、緩沖液和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。同時(shí)也不能忽視其他操作步驟，如緩

27、沖液和酶應(yīng)該分裝成小份，并且在－20 ℃保存。 【答案】　C 8．關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是(　　) A．古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定 B．診斷遺傳病、基因克隆、古生物學(xué) C．DNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案 D．診斷遺傳病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定 【解析】　本題考查PCR技術(shù)在生活實(shí)踐中的應(yīng)用，目前常用于古生物學(xué)研究、刑偵破案、DNA序列測(cè)定、基因克隆、遺傳病的基因診斷等方面。 【答案】　D 9．關(guān)于DNA分子測(cè)定的以下敘述，不正確的是(　　) A．所用的試劑是二苯胺，該試劑分為A液和B液 B．在測(cè)定時(shí)應(yīng)將0.1 mLB液加入10 mLA液中混勻后使

28、用 C．在常溫條件下進(jìn)行測(cè)定，注意觀察顏色的變化 D．根據(jù)藍(lán)色的深淺，能粗略地比較出擴(kuò)增前后溶液中DNA含量變化 【解析】　測(cè)定DNA分子應(yīng)在沸水浴加熱條件下進(jìn)行，不能在常溫條件下進(jìn)行。 【答案】　C 10．在遺傳病及刑事偵破案件中常需要對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題： (1)在相應(yīng)的橫線上寫出引物Ⅱ，并在復(fù)性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。 (2)在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。 (3)若將作為原料的4種脫氧核

29、苷酸用32P標(biāo)記，請(qǐng)分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點(diǎn)： ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________， 循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為________。 (4)PCR反應(yīng)過程的前提條件是________，PCR技術(shù)利用DNA的_____

30、___原理解決了這個(gè)問題。 (5)在對(duì)樣品DNA分析的過程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是________。 【解析】　(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，所以引物就提供了3′端，子鏈延伸方向?yàn)?′→3′，引物Ⅰ與b鏈部分堿基互補(bǔ)，引物Ⅱ則與a鏈部分堿基互補(bǔ)，且連接到a鏈的3′端，故引物Ⅱ的結(jié)構(gòu)為5′—G—A—OH，復(fù)性結(jié)果為： HO—A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′。 (2)經(jīng)過一次循環(huán)后，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA分子分別含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作為原料的4種脫氧核苷酸被32P標(biāo)記，所以新合成的子鏈均含有放射性，

31、一次循環(huán)后的兩個(gè)DNA中各有一條鏈含32P，若復(fù)制n次，共產(chǎn)生子鏈2n×2，其中只有DNA母鏈不含32P，則其所占比例為2/(2n·2)＝1/2n。(4)DNA復(fù)制是以兩條母鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行的。因此，首先要解旋，使兩條母鏈的堿基暴露出來，才能按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則把相應(yīng)的堿基一個(gè)個(gè)地連接起來。DNA分子在80～100 ℃的溫度范圍內(nèi)變性，雙鏈解開成單鏈，當(dāng)溫度慢慢降低時(shí)，又能重新結(jié)合形成雙鏈。(5)本題考查了DNA中雜質(zhì)蛋白質(zhì)的去除，利用酶的專一性，應(yīng)加入蛋白酶。 【答案】　(1)5′—G—A—OH　將HO—A—G—5′ 填在復(fù)性步驟中5′—G—G……T—C—3′的上面

32、(2)3′—C—C……A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′ 5′—G—G……T—C—3′ 3′—C—C……A—G—5′ (3)每個(gè)DNA分子各有一條鏈含32P　1/2n (4)DNA解旋　熱變性　(5)蛋白酶 [能力提升] 11．DNA擴(kuò)增過程中，DNA片段經(jīng)若干次擴(kuò)增，與其數(shù)目的理論值變化相符的圖是(　　) 【解析】　PCR反應(yīng)中DNA的擴(kuò)增數(shù)目和生物體內(nèi)的DNA復(fù)制是類似的，即1個(gè)DNA分子復(fù)制1次，產(chǎn)生2個(gè)DNA分子，復(fù)制2次，產(chǎn)生4個(gè)DNA分子，呈指數(shù)擴(kuò)增，開始有1個(gè)DNA分子為模板，經(jīng)過n次復(fù)制后得到的DNA分子的數(shù)量為2n，與曲線C相符合。 【答案】　C

33、 12．PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是 (　　) ①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA ②PCR過程不需要DNA聚合酶 ③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的 ④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制 A．③④ B．①② C．①③ D．②④ 【解析】　PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比，主要有兩點(diǎn)不同：一是PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長度通常為20～30個(gè)核苷酸。二是在PCR過程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的。

34、 【答案】　C 13．復(fù)性溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40～60 ℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。PCR的結(jié)果可不考慮原來解旋開的兩個(gè)DNA模板鏈的重新結(jié)合，原因不包括(　　) 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：67850059】 A．由于模板DNA比引物復(fù)雜得多 B．引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞 C．加入引物的量足夠多而模板鏈數(shù)量少 D．模板鏈加熱解旋已經(jīng)變性，不可能再次結(jié)合 【解析】　DNA分子在80～100 ℃的溫度范圍內(nèi)雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，雙鏈打開，在DNA分子復(fù)制時(shí)提供模板，這個(gè)過程稱為變性。當(dāng)溫度緩慢降低到50 ℃左右時(shí)，兩條解旋的單鏈重新

35、結(jié)合成雙鏈，稱為復(fù)性，故D項(xiàng)闡述錯(cuò)誤。 【答案】　D 14．PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，如圖表示合成過程，請(qǐng)據(jù)圖分析回答問題。 (1)A過程高溫使DNA變性解旋，對(duì)該過程的原理敘述正確的是(　　) A．該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B．該過程用到耐高溫的解旋酶酸二酯鍵 C．該過程不需要解旋酶的作用 D．該過程與人體細(xì)胞的過程完全相同 (2)C過程要用到的酶是__________。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)可以__________加入，__________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反應(yīng)除提

36、供酶外，還需滿足的基本條件有： ____________________________________________________________ ____________________________________________________________。 (3)如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不做標(biāo)記，控制“94 ℃→55 ℃→72 ℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占__________。 【解析】　PCR技術(shù)用高溫使DNA兩條鏈解開，該過程不需要解旋酶的作用。C過程是鏈的延長，需要DNA聚合酶參與；PCR反應(yīng)除

37、提供酶外，還需要滿足的基本條件有DNA模板、分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行等。循環(huán)3次共形成8個(gè)DNA分子，其中兩個(gè)DNA分子含15N標(biāo)記，占總數(shù)的25%。 【答案】　(1)C　(2)DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行　(3)25% 15．請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如圖所示)。 圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。①從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)

38、物中含有引物A的DNA片段所占的比例為________。 ②在第________輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。 (2)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請(qǐng)分別說明理由。 ①第1組：______________________________________； ②第2組：______________________________________。 (3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開_________________________

39、____。 【解析】　(1)①從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。 【答案】　(1)①15/16?、谌? (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 ②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 (3)DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 14