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1、緒論 【目的與要求】 1.????? 熟悉生物化學(xué)的含義、研究對(duì)象、研究?jī)?nèi)容。 2.????? 了解生物化學(xué)的發(fā)展過(guò)程。 3.????? 了解生物化學(xué)與其它學(xué)科的關(guān)系特別是生物化學(xué)在生命科學(xué)中的重要意義。 4.????? 了解生物化學(xué)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活中的應(yīng)用。 5.????? 了解生物化學(xué)的課程特點(diǎn)與學(xué)習(xí)方法。 一. 生物化學(xué)的含義、研究對(duì)象、研究?jī)?nèi)容 生物化學(xué)即可認(rèn)為是生命的化學(xué)。它是用化學(xué)的理論與方法來(lái)研究生命現(xiàn)象，闡明生命現(xiàn)象的化學(xué)本質(zhì)的學(xué)科。 生物化學(xué)的研究對(duì)象：一切生物有機(jī)體，包括動(dòng)物、植物、微生物和人體。研究它們的化學(xué)組成及其化學(xué)變化的規(guī)律。 生物化學(xué)的研

2、究?jī)?nèi)容，包括四個(gè)部分： 1. 構(gòu)成生物有機(jī)體的物質(zhì)基礎(chǔ)，即靜態(tài)生物化學(xué)。 2. 生物物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，即動(dòng)態(tài)生物化學(xué)或新陳代謝的規(guī)律。 3. 生物物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、代謝與整個(gè)生命現(xiàn)象的關(guān)系，即機(jī)能生物化學(xué)。 4. 生物信息的傳遞及其對(duì)物質(zhì)代謝的調(diào)控，包括生物體內(nèi)各種物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)控制以及遺傳基因信息的傳遞和調(diào)控，即信息生物化學(xué)。 二. 生物化學(xué)的發(fā)展過(guò)程 1. 早期生物化學(xué)的發(fā)展：二十世紀(jì)前，主要是靜態(tài)生物化學(xué)的成果。 (1) 早期生物化學(xué)的發(fā)展動(dòng)力來(lái)自于醫(yī)藥實(shí)踐和發(fā)酵工業(yè)的興起。 (2) 歐洲十七十八世紀(jì)工業(yè)的飛速發(fā)展也對(duì)生物化學(xué)這門學(xué)科的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用。 (3

3、) 十九世紀(jì)初，隨著物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)的巨大發(fā)展，影響和促進(jìn)了生物化學(xué)理論體系的形成與發(fā)展。 2. 動(dòng)態(tài)生物化學(xué)的發(fā)展：二十世紀(jì)初到二十世紀(jì)五十年代，主要是動(dòng)態(tài)生物化學(xué)飛速發(fā)展時(shí)期。 3. 分子生物學(xué)的興起：二十世紀(jì)中葉開始，生物化學(xué)進(jìn)入分子水平。 4. 生物技術(shù)與生物工程的興起：以生物化學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)。 5. 現(xiàn)代生物化學(xué)的發(fā)展：人類基因組計(jì)劃、后基因組計(jì)劃。 三. 生物化學(xué)與其它學(xué)科的關(guān)系、生物化學(xué)在生命科學(xué)中的地位。 四. 生物化學(xué)與工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)系、生物化學(xué)的應(yīng)用。 五. 生物化學(xué)的特點(diǎn)與學(xué)習(xí)方法。 第一章 蛋白質(zhì)化學(xué) 【目的與要求】 1、 1、 了解蛋白質(zhì)對(duì)

4、生物體的重要意義。 2、 2、 了解蛋白質(zhì)的分類，掌握蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)。 3、 3、 掌握蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單體：氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從各氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上理解氨基酸的分類。 4、 4、 掌握氨基酸的理化性質(zhì)，重點(diǎn)掌握兩性電離與等電點(diǎn)含義、茚三酮反應(yīng)及其應(yīng)用。 5、 5、 掌握蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念；了解蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法與思路，學(xué)會(huì)分析簡(jiǎn)單多肽的氨基酸順序。 6、 6、 理解并掌握蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念；二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型：α—螺旋及β—折疊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；了解幾種常見纖維狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性；了解超二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域的概念。 7、 7、 了解蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的概念及穩(wěn)定因素。

5、 8、 8、 充分理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；從核糖核酸酶的變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)理解一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系；以細(xì)胞色素C等為例充分理解一級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的關(guān)系；從血紅蛋白與肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)特性理解蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的關(guān)系。 9、 9、 掌握蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：膠體性質(zhì)、兩性電離與等電點(diǎn)、沉淀作用、變性作用以及這些性質(zhì)的生理意義及實(shí)踐意義。 10、了解蛋白質(zhì)分離提純的常用方法及基本原理。 第一節(jié) 通論 一、蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義 （一）、蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ) ????生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)是除水以外，機(jī)體組織中最多的組分，占人體干重的45%。占細(xì)菌干重的50——70%。 （?

6、二）、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能 ????1、作為生物催化劑：在體內(nèi)催化各種物質(zhì)代謝反應(yīng)的酶幾乎都是蛋白質(zhì)。 ????2、調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)：一些激素是蛋白質(zhì)或肽，如胰島素、生長(zhǎng)素。 ????3、運(yùn)輸載體：如紅細(xì)胞中運(yùn)輸O2、CO2要靠Hb（Hemoglobin血紅蛋白）、運(yùn)輸脂類物質(zhì)的是載脂蛋白、運(yùn)鐵蛋白等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或叫載體蛋白。 ????4、參與機(jī)體的運(yùn)動(dòng)：如心跳、胃腸蠕動(dòng)等，依靠與肌肉收縮有關(guān)的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白。 5、參與機(jī)體的防御：機(jī)體抵抗外來(lái)侵害的防御機(jī)能，靠抗體，抗體也稱免疫球蛋白，是蛋白質(zhì)。 6、接受傳遞信息：如口腔中的味覺(jué)蛋白、視網(wǎng)膜中的視覺(jué)蛋白。 7、調(diào)節(jié)或控

7、制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遺傳信息的表達(dá)。 8、其它：如雞蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是營(yíng)養(yǎng)和儲(chǔ)存蛋白；膠原蛋白、纖維蛋白等屬于結(jié)構(gòu)蛋白。還有甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特異的生物學(xué)功能。 所以，我們不難理解，為什么說(shuō)沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。 二、蛋白質(zhì)的分類 1、 1、??????????? 根據(jù)分子形狀分：球狀蛋白質(zhì)、纖維狀蛋白質(zhì)。 2、 2、??????????? 根據(jù)功能分：活性蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。 3、 3、??????????? 根據(jù)組成分： （1）簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、組蛋白、精蛋白、硬蛋白。 （2）結(jié)合蛋白質(zhì)：色素蛋白、金屬蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋

8、白、糖蛋白。 4、 4、??????????? 根據(jù)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分：完全蛋白質(zhì)、不完全蛋白質(zhì)。 三、蛋白質(zhì)的水解： 蛋白質(zhì)——→蛋白胨——→多肽——→二肽——→氨基酸 Mr： 〉104 〉2x103 1000—500 200 100 1、 1、??????????? 酸水解 條件：5—10倍的20%的鹽酸煮沸回流16—24小時(shí)，或加壓于120℃水解2小時(shí)。 優(yōu)點(diǎn)：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為L(zhǎng)—α—氨基酸，產(chǎn)物單一，無(wú)消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：色氨酸破壞，并產(chǎn)生一種黑色的物質(zhì)：腐黑質(zhì)，水解夜呈黑色。 2、 2、??????????? 堿水解 條

9、件：4mol/L Ba(OH)2 或6mol/L NaOH煮沸6小時(shí)。 優(yōu)點(diǎn)：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解夜清亮。 缺點(diǎn)：產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，破壞的氨基酸多，一般很少使用。 3、 3、??????????? 蛋白酶水解 條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫37—40℃，pH值5—8 優(yōu)點(diǎn)：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：水解不完全，中間產(chǎn)物多。 蛋白質(zhì)酸堿水解常用于蛋白質(zhì)的組成分析，而酶水解用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成——氨基酸 一、蛋白質(zhì)的元素組成 ???? 蛋白質(zhì)是有機(jī)化合物，離不開C、H、O三種元素，還含有N、P、S、金屬元素等。 含量%

10、 50—55 6—7 20— 23 15—17 0.3—3 微量或無(wú) 元素組成 C H O N S 其它 ????蛋白質(zhì)中N是特征元素，且含量恒定，為16%左右 ，即16克氮/100克蛋白質(zhì)，故可以用定氮法測(cè)量蛋白質(zhì)含量，即：每100克蛋白質(zhì)含氮16克，100/16=6.25克蛋白質(zhì)含氮1克。所以，每克樣品含氮量×6.25×100=100克樣品蛋白質(zhì)含量（克%）。 ????有些蛋白質(zhì)含有其他微量元素：P、Fe、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、I等。 二、蛋白質(zhì)分子的基本組成單位--氨基酸 （一）、

11、氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：如下圖所示： ? 從氨基酸的結(jié)構(gòu)通式可以看出： 1、 1、????????????? 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均為L(zhǎng)—α—氨基酸。 2、 2、????????????? 除R為H（甘氨酸）外，其余氨基酸均具有旋光性。 3、 3、????????????? 各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)基R基上。 （二）氨基酸的構(gòu)型： 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸除甘氨酸外，均含有α—碳原子，在空間各原子有兩種排列方式：L—構(gòu)型與D—構(gòu)型，它們的關(guān)系就像左右手的關(guān)系，互為鏡像關(guān)系，下圖以丙氨酸為例： （三）、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類 1、按氨基酸分子中羧基與氨基的數(shù)目分： （1）、酸性氨基酸：一

12、氨基二羧基氨基酸，有天冬氨酸、谷氨酸、 （2）、堿性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸 ，有賴氨酸、精氨酸、組氨酸 （3）、中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸，有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸。 2、按側(cè)基R基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分： （1）、脂肪族氨基酸 （2）、芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 （3）、雜環(huán)氨基酸：脯氨酸、組氨酸 3、按側(cè)基R基與水的關(guān)系分： （1）、非極性氨基酸：有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸。 （2）、極

13、性不帶電氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸。 （3）、極性帶電氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸。 4、 4、???????????? 按氨基酸是否能在人體內(nèi)合成分： （1）、必需氨基酸：指人體內(nèi)不能合成的氨基酸，必須從食物中攝取，有八種：賴氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、笨丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸。 （2）、非必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成的氨基酸。有十種。 （3）、半必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成但合成量不能滿足人體需要（特別是嬰幼兒時(shí)期）的氨基酸，有兩種：組氨酸、精氨酸。 二十種氨基酸的名稱和結(jié)構(gòu)如圖所示: 注：二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 支鏈氨

14、基酸有：纈氨酸、亮氨酸，異亮氨酸 含羥基的氨基酸有：絲氨酸、蘇氨酸 含硫的氨基酸有：半胱氨酸（含巰基）、甲硫氨酸（含硫甲基） 含苯環(huán)的氨基酸有：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 含胍基的氨基酸有：精氨酸 含咪唑基的氨基酸有：組氨酸 亞氨基酸有：脯氨酸 含酰胺的氨基酸有：天冬酰胺、谷氨酰胺 含吲哚基的氨基酸有：色氨酸 含ε-氨基的氨基酸有：賴氨酸 （四）蛋白質(zhì)中不常見的氨基酸 羥—脯氨酸、羥—賴氨酸、r—羧基谷氨酸、6—氮—甲基賴氨酸 （五）非蛋白氨基酸 鳥氨酸、胍氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、β—丙氨酸、γ—氨基丁酸等 三.氨基酸的理化性質(zhì) （一）物理性質(zhì) 1．

15、 1． 形態(tài)：均為白色結(jié)晶或粉末，不同氨基酸的晶型結(jié)構(gòu)不同。 2． 2． 溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀堿中溶解性好。 3． 3． 熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)一般都比較高，一般都大于200℃，超過(guò)熔點(diǎn)以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。 4． 4． 光吸收：氨基酸在可見光范圍內(nèi)無(wú)光吸收，在近紫外區(qū)含苯環(huán)氨基酸有光的吸收。 5． 5． 旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。 （二） （二）? 化學(xué)性質(zhì)： 1． 1． 氨基酸的兩性電離及等電點(diǎn)： 氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可電離出H+，所以氨基酸具有酸堿兩性性質(zhì)。通常情況下，氨基酸以兩性離子的形式存在

16、，如下圖所示： 從上圖可知：氨基酸在酸性環(huán)境中，主要以陽(yáng)離子的形式存在，在堿性環(huán)境中，主要以陰離 子的形式存在。在某一pH環(huán)境下，以兩性離子（兼性離子）的形式存在。該pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。所以氨基酸的等電點(diǎn)可以定義為：氨基酸所帶正負(fù)電荷相等時(shí)的溶液pH。 氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可被堿滴定，應(yīng)該具有兩性電離的性質(zhì)，現(xiàn)以甘氨酸為例來(lái)說(shuō)明氨基酸兩性電離的特點(diǎn)。下圖是甘氨酸的電離酸堿滴定曲線，從左向右是用NaOH滴定的曲線，溶液的pH由小到大逐漸升高；從右向左是用HCL滴定的曲線，溶液的pH由大到小逐漸降低。曲線中從左向右第一個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸羧基解離50%的狀態(tài)，第二個(gè)拐點(diǎn)是

17、氨基酸的等電點(diǎn)，第三個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸氨基解離50%的狀態(tài)。 通過(guò)氨基酸的滴定曲線，可用下列Henderson—Hasselbalch方程求出各解離基團(tuán)的解離常數(shù)（pK，）： 根據(jù)pK，可求出氨基酸的等電點(diǎn)，可由其等電點(diǎn)左右兩個(gè)pK，值的算術(shù)平均值求出。 中性及酸性氨基酸： pI=(pK1，+pK2，)/2 中性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為α—氨基的解離常數(shù)。 酸性氨基酸： pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為側(cè)鏈羧基的解離常數(shù)。 堿性氨基酸： pI=(pK2，+pK3，)/2 其中：pK2，為α—氨基的解離常數(shù)，pK3，為側(cè)鏈氨基的解離常數(shù)。

18、 二十種氨基酸的pK，及等電點(diǎn)： 2.由α—氨基參加的反應(yīng)： （1） （1）????? 亞硝酸反應(yīng)：放出氮?dú)?，氮?dú)獾囊话雭?lái)自氨基氮，一半來(lái)自亞硝酸，在通常情況下測(cè)定生成的氮?dú)獾捏w積量可計(jì)算氨基酸的量，此反應(yīng)可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度。 （2） （2）????? 與甲醛的反應(yīng)：用過(guò)量的中性甲醛與氨基酸反應(yīng)，可游離出氫離子，然后用NaOH滴定，從消耗的堿量可以計(jì)算出氨基酸的含量。此法稱為間接滴定法。 （3） （3）????? 與2，4—二硝基氟苯（2，4—DNFB）的反應(yīng)（Sanger反應(yīng)）：生成黃色的二硝基苯—氨基酸衍生物。 （4） （4）????? 與苯異硫氰酸酯（PITC

19、）反應(yīng)（Edman反應(yīng)）：生成苯乙內(nèi)酰硫脲—氨基酸。 （5） （5）????? 與丹磺酰氯（DNS—Cl）的反應(yīng)：生成熒光物質(zhì)DNS—氨基酸。 （4）（5）（6）反應(yīng)用于蛋白質(zhì)的N—末端的測(cè)定。 3.α—羧基參加的反應(yīng)： （1） （1）????? 與堿反應(yīng)成鹽： （2） （2）????? 與醇反應(yīng)成酯： 4.α—氨基與α—羧基共同參加的反應(yīng) 與茚三酮的反應(yīng)：除脯氨酸與羥脯氨酸外，可與其它氨基酸生成藍(lán)紫色化合物。 脯氨酸與羥脯氨酸為黃色化合物。 5.側(cè)鏈反應(yīng)（顏色反應(yīng)）： （1） （1）????? Millon反應(yīng)：檢測(cè)Tyr或含Tyr的蛋白

20、質(zhì)的反應(yīng)。 Millon試劑：汞的硝酸鹽與亞硝酸鹽溶液。 產(chǎn)物：紅色的化合物。 （2） （2）????? Folin反應(yīng)：檢測(cè)Tyr或含Tyr的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 Folin試劑：磷鉬酸、磷鎢酸混合溶液。 產(chǎn)物：藍(lán)色的鉬藍(lán)、鎢藍(lán)。 （3） （3）????? 坂口反應(yīng)：檢測(cè)Arg或含Arg的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 坂口試劑：α—萘酚的堿性次溴酸鈉溶液。 產(chǎn)物：磚紅色的沉淀。 （4） （4）????? Pauly反應(yīng)：檢測(cè)His、Tyr及含His、Tyr蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 試劑：對(duì)氨基苯磺酸鹽酸溶液、亞硝酸鈉、碳酸鈉混合溶液 產(chǎn)物：橘紅色的化合物。 （5）乙醛酸的反應(yīng)：檢測(cè)Trp或含Trp

21、蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 當(dāng)Trp與乙醛酸和濃硫酸在試管中疊加時(shí)，產(chǎn)生分層現(xiàn)象，界面出現(xiàn)紫色環(huán)。 （5） （5）????? Cys的反應(yīng)：Cys或含Cys蛋白質(zhì)與亞硝基亞鐵氰酸鈉在稀氨的溶液中，產(chǎn)生一種紅色的化合物。 四.氨基酸的分離測(cè)定 （一）.層析法 層析法是利用被分離樣品混合物中各組分的化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，這兩個(gè)相一個(gè)為固定相，另一個(gè)為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流進(jìn)固定相時(shí)，由于各組分在兩相中的分配情況不同或電荷分布不同或離子親和力不同等，而以不同的速度前進(jìn)，從而達(dá)到分離的目的。 常見的層析法有： 1.濾紙層析 2.薄層層析 3.離子交換層析 4.親和層析

22、 （二）.電泳法 電泳是指帶電的顆粒在電場(chǎng)中向著以其顆粒所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有多種結(jié)構(gòu)層次，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)又稱為構(gòu)象?？臻g結(jié)構(gòu)包括二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。在二級(jí)與三級(jí)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域這兩個(gè)結(jié)構(gòu)層次。 一. 一.? 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（Primary structure）又稱為共價(jià)結(jié)構(gòu)、化學(xué)結(jié)構(gòu)。它是指蛋白質(zhì)中的氨基酸按照特定的排列順序通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的多肽鏈結(jié)構(gòu)。 （一）、肽鍵與肽鏈 肽鍵：一個(gè)氨基酸的a-COOH 和相鄰的另一個(gè)氨基酸的a-NH2脫水形成共價(jià)鍵?！救鐖D所示】

23、 氨基酸借肽鍵連接起來(lái)叫肽，肽是一大類物質(zhì)，即： ????1.兩個(gè)氨基酸組成的肽叫二肽； ????2.三個(gè)氨基酸組成的肽叫三肽； ????3.多個(gè)氨基酸組成的肽叫多肽； ????4.氨基酸借肽鍵連成長(zhǎng)鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有自由-NH2和-COOH，自由-NH2端稱為N-末端（氨基末端），自由-COOH端稱為C-末端（羧基末端）； ????5.構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基； ????6.肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2端開始，由N指向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。 肽鍵和肽的結(jié)構(gòu)如圖所示: （二）天然活性肽 自然界中有自由存在的活性肽，主要

24、有： 1. 1.?????? 谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu—Cys—Gly），廣泛存在于生物細(xì)胞中，含有自由的巰基，具有很強(qiáng)的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。 ? 2. 促甲狀腺素釋放激素：三肽（焦谷氨酰組氨酰脯氨酸），可促進(jìn)甲狀腺素的釋放。 3. 短桿菌素S：環(huán)十肽，含有D-苯丙氨酸、鳥氨酸，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌有破壞作用，主要作用于細(xì)胞膜。 4. 青霉素：含有D—半胱氨酸和D—纈氨酸的二肽衍生物 。主要破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁粘肽的合成引起溶菌。 5. 牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽，分子中含有一對(duì)二硫鍵，兩者結(jié)構(gòu)類似。前者第九

25、位為Gly或Lys或Phe，后者為Arg。前者可刺激子宮的收縮，促進(jìn)分娩。后者可促進(jìn)小動(dòng)脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)節(jié)。 牛催產(chǎn)素 S S Cys·Tyr·Ile·Gln·Asn·Cys·Pro·Leu·Gly-NH2 ? 牛加壓素 S S Cys·Tyr·Phe·Gln·Asn·Cys·Pro·Ary·Gly-NH2 ? 6. 腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。 （三）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究 一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究包括：蛋白質(zhì)的氨基酸組成測(cè)定，肽鏈數(shù)目的確

26、定，末端氨基酸種類測(cè)定，氨基酸的排列順序測(cè)定，二硫鍵位置的測(cè)定，酰胺位置的確定。大致步驟如下： 1. 1.?????????????? 獲取一定量純的蛋白質(zhì)樣品，測(cè)其分子量，然后將樣品完全水解，確定該蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)目及每種氨基酸的含量。 2. 2.?????????????? 進(jìn)行末端測(cè)定，確定該蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目，N-端和C-端是什么氨基酸。 N-末端測(cè)定法：常采用2，4—二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。 C-末端測(cè)定法：常采用肼解法、羧肽酶法。 3. 3.?????????????? 肽鏈的拆分 經(jīng)末端的分析，若該蛋白質(zhì)含有兩條以上的肽鏈，而且肽鏈之間是通過(guò)非

27、共價(jià)鍵連接，使用蛋白質(zhì)變性劑將其變性后分開；若蛋白質(zhì)肽鏈之間通過(guò)共價(jià)鍵相連，則可采取過(guò)甲酸氧化法或巰基乙醇還原法將其分開。 4. 4.?????????????? 各肽鏈中氨基酸排列順序的測(cè)定 使用兩種以上的方法將肽鏈部分水解成肽段，測(cè)各肽段的氨基酸順序，然后使用片段重疊法推測(cè)出完整肽鏈的氨基酸順序。 5. 5.?????????????? 確定二硫鍵和酰胺的位置 (四)胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu) 二. 二.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) （一） （一）??????????? 構(gòu)型與構(gòu)象 構(gòu)型：指一個(gè)不對(duì)稱的化合物中不對(duì)稱中心上的幾個(gè)原子或基團(tuán)的空間排布方式。如單糖的α—、β—構(gòu)型，氨基酸的

28、D—、L—構(gòu)型。當(dāng)從一種構(gòu)型轉(zhuǎn)換成另一種構(gòu)型的時(shí)候，會(huì)牽涉及共價(jià)鍵的形成或破壞。 構(gòu)象：指一個(gè)分子結(jié)構(gòu)中的一切原子繞共價(jià)單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的不同空間排列方式。一種構(gòu)象變成另一種構(gòu)象不涉及共價(jià)鍵的形成或破壞。 （二） （二）??????????? 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念： 多肽鏈在一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，按照一定的方式有規(guī)律的旋轉(zhuǎn)或折疊形成的空間構(gòu)象。其實(shí)質(zhì)是多肽鏈在空間的排列方式。 1. 1.????? 蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的立體化學(xué)原則 Linus Pauling和Robert Corey于20世紀(jì)40年代末至50年代初，應(yīng)用X—射線衍射法（X—ray diffraction）技術(shù)對(duì)α

29、—角蛋白等研究結(jié)果，提出了蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的立體化學(xué)原則，要點(diǎn)如下： （1）肽鏈空間構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位為肽平面或肽單位。所謂的肽平面是指肽鏈中從一個(gè)Cα原子到另一個(gè)Cα原子之間的結(jié)構(gòu)，共包含6個(gè)原子（Cα、C、O、N、H、Cα），它們?cè)诳臻g共處于同一個(gè)平面。如下圖所示： （2）肽鍵上的原子呈反式構(gòu)型 （3）肽鍵C-N鍵長(zhǎng)為0.132nm,比一般的C—N單鍵（0.147nm）短，比C=N雙鍵（0.128nm）要長(zhǎng)，具有部分雙鍵的性質(zhì)（partial double-bond character），不能旋轉(zhuǎn)。而?Cα-COOH、C-NH2，為真正單鍵（pure single bond），可以

30、旋轉(zhuǎn)。 （3） （3）?????? 相鄰肽平面構(gòu)成二面角 ：一個(gè)Cα原子相連的兩個(gè)肽平面，由于N1—Cα和Cα—C2（羧基碳）兩個(gè)鍵為單鍵，肽平面可以分別圍繞這兩個(gè)鍵旋轉(zhuǎn)，從而構(gòu)成不同的構(gòu)象。一個(gè)肽平面圍繞N1—Cα（氮原子與α—碳原子）旋轉(zhuǎn)的角度，用Φ表示。另一個(gè)肽平面圍繞Cα—C2（α—碳原子與羧基碳）旋轉(zhuǎn)的角度，用Ψ表示。這兩個(gè)旋轉(zhuǎn)角度叫二面角（dihedral angle）。通常二面角（Φ，Ψ）確定后，一個(gè)多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)就確定了。 ? 2. 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要類型有：a-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角 ???a-螺旋（a-Helix） 又稱為3.613螺旋，Φ= -57。，Ψ= -

31、47。 結(jié)構(gòu)要點(diǎn)： (1)、多個(gè)肽鍵平面通過(guò)α－碳原子旋轉(zhuǎn)，主鏈繞一條固定軸形成右手螺旋。 (2)、每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm。 （3）、相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中C＝O和N-H形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個(gè)氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個(gè)殘基的C＝O之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定α－螺旋的主要鍵。 (4)肽鏈中氨基酸側(cè)鏈R，分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響α－螺旋的形成。 影響—螺旋穩(wěn)定的因素： 酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于α－螺旋形成；較大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸)集中的區(qū)域，也妨礙α－螺旋形成；脯氨酸因其α－碳原子位于五元環(huán)上

32、，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，故不易形成上述α－螺旋；甘氨酸的R基為H，空間占位很小，也會(huì)影響該處螺旋的穩(wěn)定。 ?a-螺旋在許多蛋白中存在，如α—角蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白等，主要由a-螺旋結(jié)構(gòu)組成。 螺旋的結(jié)構(gòu)通常用“SN”來(lái)表示，S表示螺旋每旋轉(zhuǎn)一圈所含的殘基數(shù)，N表示形成氫鍵的C=O與H-N原子之間在主鏈上包含的原子數(shù)。 結(jié)構(gòu)如圖所示 β-折疊（ β-pleated sheets）又稱β—片層、β—結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)要點(diǎn)如下： （1）、多肽鏈呈鋸齒狀（或扇面狀）排列成比較伸展的結(jié)構(gòu)； （2）、相鄰兩個(gè)氨基酸殘基的軸心距離為0.35nm，側(cè)鏈R基團(tuán)交替地分布在片

33、層平面的上下方，片層間有氫鍵相連； （3）、有平行式和反平行式兩種，平行式的折疊其Φ=–119。，Ψ=+113。。反平行折疊其Φ=–139。，Ψ=+135。。 這種片層在絲心蛋白里大量存在。 結(jié)構(gòu)如圖所示 β-轉(zhuǎn)角 又稱β-彎曲，β-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。指蛋白質(zhì)的多肽鏈在形成空間構(gòu)象時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)180。的回折，回折處的結(jié)構(gòu)就稱為β-轉(zhuǎn)角。一般由四個(gè)連續(xù)的氨基酸組成，第一個(gè)氨基酸的羧基與第四個(gè)氨基酸的氨基形成氫鍵。也有一些是由第一個(gè)氨基酸的羧基與第三個(gè)氨基酸的氨基形成氫鍵。 結(jié)構(gòu)如圖所示 維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵 ㈡超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域 1． 1．???????????

34、?? 超二級(jí)結(jié)構(gòu) 超二級(jí)結(jié)構(gòu)（Super-secondary structure）的概念是M.Rossmann于1973年提出來(lái)的。蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈在三維折疊中往往形成有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體，在球蛋白中充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。常見的有：αα、ββ、βαβαβ等。 如圖所示： 2． 2．????????????? 結(jié)構(gòu)域（structural domain） 在一些相對(duì)較大的蛋白質(zhì)分子中，在空間折疊時(shí)往往先分別折疊成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域，再組裝成更復(fù)雜的球狀結(jié)構(gòu)，這種在二級(jí)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的特定區(qū)域稱為結(jié)構(gòu)域。它的結(jié)構(gòu)層次介于超二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間。如圖所示： ??三.蛋

35、白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) ????一條多肽鏈中所有原子在三維空間的整體排布，稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)，是包括主、側(cè)鏈在內(nèi)的空間排列。大多數(shù)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)為球狀或近似球狀。在三級(jí)結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)的親水的R側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的表面，而疏水的R側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，形成疏水的核心。 三級(jí)結(jié)構(gòu)主要靠次級(jí)鍵（非共價(jià)鍵，noncovalent）維系固定，主要有： 氫鍵、離子鍵（鹽鍵）、疏水的相互作用（疏水鍵）、范德華力、配位鍵，另外二硫鍵（共價(jià)鍵）也參與維系三級(jí)結(jié)構(gòu)。 ?? ? ??三級(jí)結(jié)構(gòu)形成后，生物學(xué)活性必需基團(tuán)靠近，形成活性中心或部位，即蛋白質(zhì)分子表面形成了某些發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域。 結(jié)構(gòu)如圖所示:

36、 ??四.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) ?二個(gè)或二個(gè)以上具有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈（亞基），彼此借次級(jí)鍵相連，形成一定的空間結(jié)構(gòu)，稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)。 ???? 具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位，稱為亞基或亞單位（subunit），亞基可以相同，亦可以不同。四級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)是亞基在空間排列的方式。 ????單獨(dú)亞基，多無(wú)生物學(xué)功能，二個(gè)以上亞基聚合成為有完整四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，才有功能。 血紅蛋白結(jié)構(gòu)如圖所示: 第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ⒈一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) ????RNase是由124氨基酸殘基組成的單肽鏈，分子中 8 個(gè)Cys的-SH構(gòu)成4對(duì)二硫

37、鍵，形成具有一定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。在蛋白質(zhì)變性劑（如8摩爾的尿素）和一些還原劑（如巰基乙醇）存在下，酶分子中的二硫鍵全部被還原，酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈完全伸展，酶的催化活性完全喪失。當(dāng)用透析的方法除去變性劑和巰基乙醇后，發(fā)現(xiàn)酶大部分活性恢復(fù)，所有的二硫鍵準(zhǔn)確無(wú)誤地恢復(fù)原來(lái)狀態(tài)。若用其他的方法改變分子中二硫鍵的配對(duì)方式，酶完全喪失活性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定它的空間結(jié)構(gòu)，而特定的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)具有生物活性的保證。 如圖所示: ⒉前體與活性蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系 ????由108個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原pre-proinsulin），在合成的時(shí)候完全沒(méi)有活性，當(dāng)切去N

38、-端的24個(gè)氨基酸信號(hào)肽，形成84個(gè)氨基酸的胰島素原（proinsulin），胰島素原也沒(méi)活性，在包裝分泌時(shí)，A、B鏈之間的33個(gè)氨基酸殘基被切除，才形成具有活性的胰島素。如圖所示: ????⒊蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化 ????對(duì)于不同種屬來(lái)源的同種蛋白質(zhì)進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定和比較，發(fā)現(xiàn)存在種屬差異，這種差異可能是分子進(jìn)化的結(jié)果但與活性和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的氨基酸殘基高度保守。 ????總之，蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能。功能不同的蛋白質(zhì)總是有著不同的序列；比較種屬來(lái)源不同而功能相同的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可能有某些差異，但與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)也總是相同。若一級(jí)結(jié)構(gòu)變化，蛋白

39、質(zhì)的功能可能發(fā)生很大的變化。 ????⒋蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病 ????現(xiàn)知幾乎所有遺傳病都與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，都稱之為分子病。例如鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的β-亞基上的第六位氨基酸由谷氨酸變成了纈氨酸，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運(yùn)輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細(xì)胞呈鐮刀狀。 二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ????以血紅蛋白（Hb）為例加以說(shuō)明（Hb的結(jié)構(gòu)如圖所示） ????Hb由4條肽鏈組成：2α、2β，功能是運(yùn)載O2;在去氧Hb亞基中有下列幾對(duì)鹽鍵： ????α1-α2：α2亞基Arg141-COOH-α1亞基Val1-NH2 ????α1-α2：α

40、2 亞基Arg141 -胍基-α1亞基Asp126-COOH ????α1-β2：a1亞基Lys40的ξ-NH2-β2亞基 His146-COOH ????β1-β2：β2亞基 His146-咪唑基-β1亞基Asp94-β-COOH ???由于血紅蛋白亞基之間存在大量鹽鍵，使其構(gòu)象呈緊張態(tài)，對(duì)氧的親和力很低，第一個(gè)亞基與O2結(jié)合時(shí)，鹽鍵的破壞較難，所需要的能量較多。當(dāng)血紅蛋白的一個(gè)亞基結(jié)合氧之后引起它的構(gòu)象從緊張態(tài)變成松弛態(tài)，其它的鹽鍵也依次破壞，此時(shí)破壞鹽鍵所需要的能量也少，構(gòu)象的變化導(dǎo)致血紅蛋白對(duì)氧的親和力大大增強(qiáng)，因此第四個(gè)亞基結(jié)合氧的能力比第一個(gè)大幾百倍。 血紅蛋白分子中的鹽鍵

41、如圖所示: ??上述Hb與O2結(jié)合后，Hb的構(gòu)象發(fā)生變化，這類變化稱為變構(gòu)效應(yīng)，即通過(guò)構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。像血紅蛋白這種具有變構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)稱為變構(gòu)蛋白（allosteric protein）。血紅蛋白的這種變構(gòu)效應(yīng)能更有效地行使其運(yùn)氧的生物學(xué)功能。 總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化 一、 一、???? 蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有

42、的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。 二、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì) ????蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，如：擴(kuò)散慢、易沉降、 粘度大、不能透過(guò)半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。 ????蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。 三、蛋白質(zhì)的沉淀作用 ????使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有： 1. 1.?????? 鹽析：在蛋白質(zhì)的水

43、溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。 鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。 鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。 ?2.?有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。 有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。 ????3.重金屬鹽沉淀（條件：pH 稍大于pI為宜）：在

44、蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會(huì)使蛋白質(zhì)沉淀。 重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。 重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長(zhǎng)期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對(duì)機(jī)體的損害。 ??4.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI） 生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。 “柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有

45、大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”。 5.弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。 ????四、蛋白質(zhì)的變性作用、結(jié)絮和凝固 ??蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱為蛋白質(zhì)的變性。 使蛋白質(zhì)的變性因素： 1）物理因素：高溫、高壓、射線等 ????2）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等 變性的本質(zhì)： 分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無(wú)序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。

46、 ???蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)： 1）生物學(xué)活性消失 ????2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)酶的作用敏感，易被水解。 ????五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) ????蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測(cè)定有關(guān)： 茚三酮反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能與之反應(yīng)生成藍(lán)色化合物。 雙縮脲反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑反應(yīng)，隨著肽鍵的數(shù)目越多，顏色依次為粉紅、紫紅、紫、藍(lán)。 酚試劑反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)與酚試劑生成藍(lán)色的化合物。 另外，前面提到的氨基酸顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)都具有。 ????六、蛋白質(zhì)的紫外吸收特征 ???蛋白質(zhì)溶液能吸收一定波長(zhǎng)的紫外線，主要是由帶芳香環(huán)

47、的氨基酸決定的。其對(duì)紫 外光吸收能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋荷═rp）>酪（Tyr）>苯丙（Phe）。 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的分離、純化與測(cè)定 一. 一.?????? 分離純化蛋白質(zhì)的意義 研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性； 提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)； 作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。 二.蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 材料的選擇→原料的預(yù)處理→蛋白質(zhì)的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)→純化→蛋白質(zhì)的結(jié)晶 1. 1.?????? 原料的選擇：要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉價(jià)，易得，容易收集，新鮮無(wú)腐敗。 2. 2.?????? 原料的預(yù)處理：如果待分離蛋白質(zhì)為胞外蛋白質(zhì)，材料破碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；若待分離蛋白質(zhì)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)，則需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷? 3. 3.?????? 從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法。 4. 4.?????? 純化：將沉淀的蛋白質(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)募兓椒ǎ玫郊兌缺容^高的蛋白質(zhì)溶液。 純化方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過(guò)濾法、離子交換層析、吸附層析法、超速離心法等。 5. 5.?????? 蛋白質(zhì)的結(jié)晶：從溶液中重新沉淀蛋白質(zhì)。 幾種常見的純化蛋白質(zhì)的方法如下圖所示： 凝膠電泳法： ????離子交換層析 凝膠過(guò)濾層析 ?