第二章 蛋白質,一、蛋白質的分類 二、蛋白質的組成單位-氨基酸 三、肽 四、蛋白質的結構 五、蛋白質的結構與功能 六、蛋白質的性質與分離分析技術,本章內容,蛋白質是有許多-氨基酸按一定序列通過以酰胺鍵(肽鍵)縮合而成的,具有穩(wěn)定的構象并具有一定生物功能的生物大分子。 蛋白質是一切生物細胞和組織的主要組成部分，是生命活動所依據的物質基礎。,一、蛋白質的分類,C H O N S （ 50%55%） （6%8%） （20523%） （15%17%） （03%）,Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I,磷 銅 鐵 鋅 錳 鈷 硒 碘,蛋白質氮元素的含量都相當接近，一般在15%17，平均為16。這是凱氏定氮法測定蛋白質含量的計算基礎。,蛋白質的元素組成：,6 .25 16的倒數(shù)，每測定g 氮相當于6 .25g的蛋白質。也就是1 g 氮所代表的蛋白質量（克數(shù)）,蛋白質含量蛋白氮6 .25,1.按分子的形狀或空間構象分類 A.纖維狀蛋白 分子很不對稱，形狀類似纖維。 一般不溶于水。典型的有：膠原蛋白質、彈性蛋白質、角蛋白質、絲蛋白質等 B.球狀蛋白質 分子的形狀接近球形，空間構象比纖維狀蛋白復雜。 球狀蛋白質的溶解性較好，能結晶，生物體內的蛋白質大多數(shù)屬于這一類。 典型的有：胞質酶類等 C. 膜蛋白質 一般折疊成近球形。生物膜的多數(shù)功能是通過膜蛋白實現(xiàn)的。,2.按組成成分分類 A .簡單蛋白質單純蛋白不含有非蛋白質部分。這類蛋白質水解后的最終產物只有氨基酸。 簡單蛋白質按其溶解性又可分為: 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、組蛋白以及硬蛋白等,參見P18 表2-1,B.結合蛋白質結合蛋白是指由單純 蛋白和非蛋白成分結合而成的蛋白質。 按其非氨基酸成分又可分為： 核蛋白、糖蛋白與蛋白聚糖、脂蛋白、色蛋白（血紅素蛋白、黃素蛋白）、磷蛋白、金屬蛋白,3. 按功能分類 酶（催化功能）；調節(jié)蛋白；貯存蛋白質；轉運蛋白質；運動蛋白；防御蛋白和毒蛋白；受體蛋白；支架蛋白；結構蛋白；異常蛋白。,（一）-氨基酸結構通式,二、蛋白質的組成單位-氨基酸,氨基酸是含有氨基及羧基的有機化合物。 氨基酸是蛋白質的基本組成單位。從細菌到人類，所有蛋白質都由20種標準氨基酸組成,構型：根據甘油醛構型確定D型和L型,1.根據甘油醛原則確定構型 2.自然界的氨基酸有兩種構型，構型和旋光方向沒有必然聯(lián)系。 3.組成蛋白質的氨基酸都是L型，除甘氨酸外都有旋光性。LAA,據R基團化學結構分類,一氨基一羧基（中性AA、含羥基或巰基AA）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met,芳香族A(Phe、Tyr),雜環(huán)(His、Trp);雜環(huán)亞(Pro);,據R基團極性分類,極性R基團AA,非極性R基團AA（8種） Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,不帶電荷（7種） Gly、Ser、Thr、Asn 、Gln 、 Tyr、Cys,帶電荷：正電荷（種）His、 Lys、Arg 負電荷（種）Asp、Glu,據氨基、羧基數(shù)分類,一氨基二羧基(酸性AA及其酰胺）Glu、 Gln、Asp、Asn,二氨基一羧基(堿性AA）Lys、Arg,人的必需氨基酸 Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr Arg、His（半必需）,(二) 氨基酸的分類,參見表2-2,脂肪族AA,氨基酸的結構、代號,1 氨基酸的兩性解離性質及等電點,pH = pI 凈電荷=0,pH pI 凈電荷為正,pH pI 凈電荷為負,(pK1),(pK2),當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelectric point，pI)。,（三）氨基酸的重要理化性質,用標準NaOH和HCI進行滴定，用NaOH和HCI的摩爾數(shù)對pH值作圖,規(guī)律,pHpI aa “” pHpI aa “” pH=pI aa “0”,表觀解離常數(shù) 以丙氨酸為例:,參見P26,對側鏈R基不解離的中性氨基酸來說，其等電點是它的pKl和pK2的算術平均值。,pI=(pK1+pK2)/2,對多氨基和多羧基氨基酸的解離 解離原則：,先解離COOH，隨后其他COOH； 然后解離NH3+，隨后其他NH3+ 一般pI值等于兩個相近pK值之和的一半,谷氨酸（A）和賴氨酸（B）滴定曲線和等電點計算,中性氨基酸：pK1為羧基的解離常數(shù)，pK2為氨基的解離常數(shù)。 pI=(pK1+pK2)/2 酸性氨基酸：pK1為羧基的解離常數(shù)，pK2為側鏈羧基的解離常數(shù)。 pI=(pK1+pK2)/2 堿性氨基酸： pK2為氨基的解離常數(shù)，pK3為側鏈氨基的解離常數(shù)。 pI=(pK2+pK3)/2,總結,1.某氨基酸的等電點即為該氨基酸兩性離子兩邊的pK值和的一半。 2.在氨基酸等電點以上任何pH，AA帶凈的負電荷，在電場中向陽極移動；在氨基酸等電點以下任何pH，AA帶凈的正電荷，在電場中向陰極移動。 3.在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點愈遠，AA帶凈電荷愈多。,小結,(1)與茚三酮反應 茚三酮在弱酸性溶液中與-氨基酸共熱，氨基酸被氧化脫氨、脫羧反應生成醛、CO2和NH3，最后茚三酮與反應產物氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成藍紫色化合物。 兩個亞氨基酸脯氨酸和羥脯氨酸 與茚三酮反應并不釋放NH3，而直接形成 黃色化合物。,2 氨基酸的化學性質,茚三酮,+,氨基酸與茚三酮反應,水合茚三酮,(2) 與甲醛的反應,氨基可以與甲醛反應，生成羥甲基化合物。 由于氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸堿滴定測定含量。與甲醛反應后，氨基酸不再是偶極離子，其滴定終點可用一般的酸堿指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測定氨基酸。,(3) 與2，4-二硝基氟苯的反應 (Sanger反應） 在弱堿性溶液中，氨基酸的- 氨基很容易與2，4-二硝基氟苯（DNFB）作用，生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯基氨基酸（簡寫為DNP-氨基酸）。,+,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,氨基酸,DNP-AA(黃色),（sanger反應）,+ HF,與丹磺酰氯反應（DNS） 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱,+,HCI,有熒光,(4) 與異硫氰酸苯酯反應（Edman反應） 在弱堿性條件下，氨基酸中的-氨基還可以與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，產生相應的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在無水酸中，PTC-氨基酸即環(huán)化為苯硫乙內酰脲（PTH），后者在酸中極穩(wěn)定。 這個反應首先被Edman用于鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸。,+,PITC,苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）,（Edman反應）,苯硫乙內酰脲(PTH-AA),兩個相鄰氨基酸的羧基和氨基之間脫水縮和形成的酰胺鍵稱 為肽鍵。 氨基酸形成肽鍵后，稱為氨基酸殘基。 肽鍵連接氨基酸殘基形成二肽、寡肽、多肽鏈和蛋白質。,（一）肽與肽鍵的結構,三、肽,肽鍵,N=C 0.127nm 鍵長=0.132nm N-C 0.148nm,肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。 在大多數(shù)情況下，以反式結構存在。,參見p32,肽平面或酰胺平面：,組成肽單位的4個原子和2個相鄰的碳原子都處于同一個平面內，此剛性結構的平面稱為肽平面或酰胺平面。,肽單位：實際就是一個肽平面,（二）肽單位 肽鍵的四個原子和與之相連的兩個-碳原子所組成的基團。,參見p32,酰胺平面與-碳原子之間形成的二面角 （ 和 ）,（三）肽鏈中AA的排列順序和命名,通常在多肽鏈的一端含有一個游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如下面的五肽可表示為： Ser-Gly-Tyr-Val-Leu,參見p31,多肽鏈結構示意圖,（四）天然存在的活性肽,自然界中有自由存在的活性肽，主要有： 1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（GluCysGly），含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內重要的還原劑，保護某些蛋白質或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。,分子中具有一個由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基脫水縮合的-肽鍵,2.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用，它們在中樞神經系統(tǒng)中形成，是體內自己產生的一類鴉片劑。,Met-腦啡肽 H Tyr Gly Gly PheMetOH Leu-腦啡肽 H Tyr Gly Gly phe LeuOH,3.牛催產素與加壓素： 均為九肽，分子中含有一對二硫鍵，兩者結構類似。前者第八位為Leu，后者為Arg。前者可刺激子宮的收縮，促進分娩。后者可促進小動脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調節(jié)。 牛催產素 S S CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH2 牛加壓素 S S CysTyrPheGlnAsnCysProArgGly-NH2,四 蛋白質的結構,蛋白質與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質。,定義 1969年，國際純化學與應用化學委員會（IUPAC） 規(guī)定： 蛋白質的一級結構指蛋白質多肽鏈中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。,(一)蛋白質的一級結構,2.一級結構的意義,一級結構 高級結構 功能,決定,決定,例：牛胰島素的一級結構,蛋白質的空間結構又稱蛋白質的構象或高級結構，是指蛋白質分子中所有原子在三維空間的分布和肽鏈的走向。 蛋白質的高級結構包括二級結構、超二級結構、結構域、三級結構和四級結構等。,(二)蛋白質的空間結構,1 維持蛋白質構象的作用力 維持蛋白質空間構象的作用力主要是次級鍵，即氫鍵和鹽鍵等非共價鍵，以及疏水作用力和范德華力等。 氫鍵： x H y 離子鍵（鹽鍵）：它是由帶相反電荷的兩個基團 間的靜電吸引所形成的 疏水作用力（疏水鍵）：是指非極性基團即疏水基團為 了避開水相而群集在一起的集合力 范德華力：在物質的聚集狀態(tài)中，分子與分子之 間存在著一種較弱的作用力 二硫鍵 ：是兩個硫原子之間所形成的共價鍵,蛋白質的二級結構是指多肽鏈的主鏈本身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構象. 它只涉及肽鏈主鏈的構象及鏈內或鏈間形成的氫鍵。(注:二級結構不涉及側鏈的構象) 主要有-螺旋、-折疊、-轉角、無規(guī)卷曲。,2 蛋白質的二級結構,多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉，形成螺旋結構，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm; 每個aa殘基沿軸旋轉100度. 肽鏈內形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個氨基酸殘基的N-H氫形成氫鍵。 絕大多數(shù)天然蛋白質中的-螺旋幾乎都是右手螺旋。 -螺旋都是由L-型氨基酸構成的（Gly除外）。,、 -螺旋及結構特點,(1)-螺旋結構,螺距0.54nm,每殘基的 軸向高度,0.15nm,每殘基繞軸 旋轉100 o,、-螺旋結構形成的限制因素:,凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒有H,不可能形成氫鍵。 靜電斥力。若一段肽鏈有多個Glu或Asp相鄰,則因pH=7.0時都帶負電荷,防礙螺旋的形成;同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內,正電荷相斥,也防礙螺旋的形成。 位阻。如Asn、Leu側鏈很大，防礙螺旋的形成。,(2) -折疊（-pleated sheet）,-折疊或-折疊片也稱-結構或-構象，它是蛋白質中第二種最常見的二級結構。 -折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構象,-折疊結構幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。 -折疊有兩種類型： 一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。 另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反,-折疊的特點,N,N,N,平行式,N,C,N,反平行式,蠶絲心蛋白,-回折（或發(fā)夾結構） 在-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個氨基酸殘基的 -C=O 和第四個殘基的 N-H 之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結構。 這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。 其特點是肽鏈回折180度,(3) -轉角,目前發(fā)現(xiàn)的-轉角多數(shù)都存在蛋白質分子表面，它們的含量相當豐富，約占全部AA殘基的1/4。,(4) 無規(guī)卷曲,肽段在空間的不規(guī)則排布稱為無規(guī)則卷曲。 在一般球蛋白分子中，往往含有大量的無規(guī)則卷曲，它使蛋白質肽鏈從整體上形成球狀構象。,無規(guī)則卷曲示意圖,細胞色素C的三級結構,無規(guī)則卷曲,3 超二級結構,（1）超二級結構指蛋白質中相鄰的二級結構單位（-螺旋或-折疊或-轉角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認的二級結構組合體。 （2）超二級結構的基本類型： 、 、,超二級結構類型, , ,-曲折,-螺旋,定義：對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結構，這種相對獨立的三維實體稱結構域。 現(xiàn)在,結構域的概念有三種不同而又相互聯(lián)系的涵義:即獨立的結構單位、獨立的功能單位和獨立的折疊單位。,4 結構域,類型： -螺旋域； -折疊域； +域； /域；無規(guī)則卷曲+-回折域； 無規(guī)則卷曲+ -螺旋結構域,結構域1,結構域2,-折疊,-轉角,二硫鍵,-螺旋,卵溶菌酶的三級結構中的兩個結構域,兩個鐵原子,蚯蚓血紅蛋白中四個-螺旋組成的結構域 -螺旋域；,免疫球蛋白VL -折疊結構域 -折疊域；,定義 多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構象和側鏈構象相互作用，沿三維空間多方向卷曲，進一步盤曲折疊形成特定的球狀分子結構。 在三級結構中，具有極性側鏈基團的AA殘基幾乎全部在分子的表面,而非極性殘基則被埋于分子內部,不與水接確.而形成疏水的核心。,5 蛋白質的三級結構,木瓜蛋白酶,組織蛋白酶B,-螺旋,維持三級結構的作用力,氫鍵 范德華力 疏水鍵（疏水相互作用） 離子鍵（鹽鍵） 二硫鍵 疏水鍵，在蛋白質三級結構中起著重要作用，它是使蛋白質多肽鏈進行折疊的主要驅動力。,三級結構的特征： 含多種二級結構單元； 有明顯的折疊層次； 是緊密的球狀或橢球狀實體； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水側鏈埋藏在分子內部， 親水側鏈暴露在分子表面。 實例：肌紅蛋白,肌紅蛋白的結構與功能,（1）肌紅蛋白的功能： 哺乳動物肌肉中儲存氧并運輸氧的蛋白。 （2）肌紅蛋白的結構特點：1963年，Kendrew a .一條多肽鏈，153個氨基酸殘基，一個血紅素輔基，分子量17600道爾頓。 b.肌紅蛋白的整個分子具有外圓中空的不對稱結構，肽鏈共折疊成8段長度不等的-螺旋體（A-H），最長的有23個氨基酸殘基，最短的有7個氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。 c.具有極性側鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側鏈的氨基酸殘基多分布于分子內部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。,肌紅蛋白,血紅素輔基,抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級結構,6 蛋白質的四級結構,四級結構是指由兩 個或兩個以上具有三級結構的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構象的蛋白質分子。其中每條多肽鏈稱為亞基。 通常亞基只有一條多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，這些多肽鏈間多以二硫鍵相連,亞基單獨存在時無生物學活性。 一般來說具有四級結構的蛋白屬于寡聚蛋白。,定義,維持蛋白質四級結構的主要作用力,在蛋白質四級結構中，亞基之間的作用力主要包括：氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水鍵。即亞基之間主要是通過次級鍵彼此締合在一起。 疏水鍵是最主要的作用力。,血紅蛋白的結構與功能,（1）血紅蛋白的結構特點： a.是四個亞基的寡聚蛋白，574個AA殘基，分子量65000 b.是由相同的兩條鏈和兩條鏈組成四聚體22，成人的血紅蛋白為22、胎兒的血紅蛋白為22 c. 鏈由141AA殘基組成， 鏈由146AA殘基組成。 四條肽鏈的三級結構與肌紅蛋白相似，各自內部有一個血紅素輔基。 （2）血紅蛋白的功能：存在于動物血液的紅細胞中，具有運輸O2和CO2的功能；血紅蛋白還能和H+結合，從而可以維持體內pH.,血紅蛋白四級結構,血紅素輔基,化學鍵,共價鍵,次級鍵,肽鍵,二硫鍵,氫鍵,疏水鍵,鹽鍵,范德華力,一級結構,二、三、四級結構,三、四級結構,蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵,(一) 蛋白質一級結構與功能的關系 1.同功蛋白質一級結構的種屬差異性 細胞色素C是真核細胞線粒體內膜上一種含F(xiàn)e的蛋白質，在生物氧化中起傳遞電子的作用。通過植物、動物和微生物等數(shù)百種生物的細胞色素C一級結構的研究表明： （1）親緣關系越近，AA順序的同源性越大。 （2）盡管不同生物間親緣關系差別很大，但與細胞色素C功能密切相關的AA順序卻有共同之處，即保守順序不變,五 蛋白質的結構與功能,不同生物與人的細胞色素C相比較AA差異數(shù)目 黑猩猩 0 雞、火雞 13 牛豬羊 10 海龜 15 狗驢 11 小麥 35 粗糙鏈孢霉43 酵母菌 44,生物 與人不同的AA數(shù)目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、豬、羊 10 狗 11 馬 12 雞、火雞 13 響尾蛇 14 海龜 15 金槍魚 21 角餃 23 小蠅 25 蛾 31 小麥 35 粗早鏈孢霉 43 酵母 44,不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目,圓圈代表分歧點,2.蛋白質一級結構的變異與分子病 分子病指蛋白質分子中由于AA排列順序與正常蛋白質不同而發(fā)生的一種遺傳病(基因突變造成的)。 鐮刀形貧血?。?病因：血紅蛋白AA順序的細微變化,-鏈N端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,鐮刀形貧血病：病人體內血紅蛋白的含量乃至紅細胞的量都較正常人少，且紅細胞的形狀為新月形，即鐮刀狀。此種細胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生溶血；再者，發(fā)生鐮變的細胞粘滯加大，易栓塞血管；由于流速較慢，輸氧機能降低，使臟器官供血出現(xiàn)障礙，從而引起頭昏、胸悶而導致死亡。,谷氨酸在生理pH值下為帶負電荷R基氨基酸，而纈氨酸卻是一種非極性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷電性發(fā)生改變，引起等電點改變，溶解度降低，使之不正常地聚集成纖維狀血紅蛋白，致使紅細胞變形成鐮刀狀,輸氧功能下降,細胞脆弱易溶血.,3.一級結構的局部斷裂與蛋白質的激活,胰島素原與胰島素（牛胰島素原的激活）,(二) 蛋白質的高級結構與功能的關系,蛋白質的功能通常取決于它的特定構象。 某些蛋白質表現(xiàn)其生物功能時，構象發(fā)生改變，從而改變整個分子的性質，這種現(xiàn)象稱為別構效應。 如血紅蛋白是四個亞基的寡聚蛋白，其與氧的結合存在別構效應。而肌紅蛋白只有一個亞基，不存在別構效應。,6.1 蛋白質的性質 （一）蛋白質的相對分子量（自學） （二）蛋白質的兩性電離性質和等電點 （三）蛋白質的變性與復性 （四）蛋白質膠體性質 (五) 蛋白質的沉淀 (六）蛋白質呈色反應 （七）蛋白質的測定 6.2 蛋白質的分離、分析技術（自學）,六 蛋白質的性質與分離、分析技術,(二) 蛋白質的兩性電離及等電點,蛋白質的等電點：當溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中即不向陽極移動也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質的等電點（pI）。在等電點時，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。 在外液pH低于等電點的溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動；在外液pH高于等電點的溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質電泳帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象。,參見p50,6.1 蛋白質的性質 （一）蛋白質的相對分子量（自學）,參見p51,電泳,蛋白質在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。 利用蛋白質的電泳現(xiàn)象，可以將不同帶電性質和不同大小、形狀的蛋白質分子進行分離純化。 根據蛋白質凈電荷的差異來分離蛋白質的一種方法是電泳法。,(三) 蛋白質的變性與復性 A、蛋白質的變性定義 天然蛋白質因受物理、化學因素的影響，使蛋白質分子的構象發(fā)生了異常變化，從而導致生物活性的喪失以及物理、化學性質的異常變化。但一級結構未遭破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性。,參見p52,B、引起蛋白質變性的主要因素：,1.物理因素： 加熱、高壓、紫外線照射、X-射線、超聲波、劇烈振蕩和攪拌等 2.化學因素： 強酸、強堿、脲、去污劑（十二烷基硫酸鈉（SDS）、重金屬鹽、三氯醋酸、濃乙醇等。,C、蛋白質的變性后的表現(xiàn),生物活性喪失；溶解度降低，對于球狀蛋白粘度增加；光吸收系數(shù)增大；生物化學性質改變。 組分和分子量不變。,D、蛋白質變性的本質： 分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結構不破壞。 變性后的蛋白質在結構上雖有改變，但組成成分和相對分子質量不變。,E、蛋白質的復性,定義：如果引起變性的因素比較溫和，蛋白質構象僅僅是有些松散時，當除去變性因素后，可根據熱力學原理緩慢地重新自發(fā)折疊恢復原來的構象，這種現(xiàn)象稱作復性。,核糖核酸酶變性與復性作用,天然狀態(tài)，有催化活性,非折疊狀態(tài)，無活性,變性,天然狀態(tài) S-S-鍵恢復 而且是正確配對,如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當與水接確時，極易吸附水分子，使蛋白質顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。,(四)蛋白質膠體性質,由于蛋白質分子量很大，在水溶液中形成直徑1-100nm之間的顆粒，已達到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。 蛋白質的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因： 、蛋白質多肽鏈上含有許多極性基團。 2、蛋白質是兩性電解質，在非等電狀態(tài)時，相同蛋白質顆粒帶有同性電荷，與周圍的反離子構成穩(wěn)定的雙電層。使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白質溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對穩(wěn)定的。,參見p54,蛋白質膠體性質的應用,由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。 透析法：以半透膜提純蛋白質的方法叫透析法 半透膜：只允許溶劑小分子通過，而溶質大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等,(五)蛋白質的沉淀,蛋白質在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的。如果加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產生沉淀。 定義：蛋白質在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質就會從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質的沉淀作用。,參見p54,1 可逆沉淀,定義：在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。 在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。 可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。,(1)鹽析 在蛋白質的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。 而低濃度的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋白質的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。 鹽析的機理： 破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷。 鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法，該方法不會使蛋白質產生變性。,各種蛋白質的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質所需中性鹽濃度也有不同，只要調節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析。,(2)弱酸或弱堿沉淀法(等電點沉淀） 用弱酸或弱堿調節(jié)蛋白質溶液的pH處于等電點處，使蛋白質沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法機理： 破壞蛋白質表面凈電荷。,酸,酸,堿,堿,堿,酸,溶液中蛋白質的聚沉,(3) 有機溶劑沉淀法： 在蛋白質溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質產生沉淀。 有機溶劑沉淀法的機理： 破壞蛋白質的水化膜。 注意：有機溶液沉淀蛋白質通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產生的溶解熱會使蛋白質產生變性。,2 不可逆沉淀,定義：在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。 如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響電荷）、重金屬鹽沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。,(1)重金屬鹽沉淀(條件：pH 稍大于pI為宜) 當pH 稍大于pI時，蛋白質顆粒帶負電荷這樣就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而沉淀。 重金屬沉淀法的機理： 重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結合。,(2)生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI） 生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質。 能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質的機理： 在酸性條件下，蛋白質帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結合而產生沉淀。 例如：“柿石癥”,(3)加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固。少量鹽促進蛋白質加熱凝固。 當?shù)鞍踪|處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速. 如：煮雞蛋,(六) 蛋白質的顏色反應 (自學),雙縮脲反應 酚試劑反應 蛋白質定量、定性 茚三酮反應 測定常用方法,另外還有：蛋白黃色反應、米倫氏反應、乙醛酸反應等。,參見p55,雙縮尿在堿性溶液中能與硫酸銅發(fā)生反應，產生紅紫色絡合物，此反應稱為雙縮脲反應。,紅紫色絡合物,180C,雙縮脲反應,蛋白質在遠紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質進行定性定量鑒定。,測定范圍：0.10.5mg/ml,(七) 蛋白質的含量測定 (自學),考馬斯亮藍染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等,參見p55-56,本章總結,蛋白質的分類。蛋白質的功能 蛋白質的組成（元素組成、化學組成）及蛋白質含量的測定 20種氨基酸的結構、分類及名稱（三字縮寫符、單字縮寫符） 氨基酸的重要理化性質：兩性解離、茚三酮顯色、與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應、與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應 蛋白質的一級結構：肽、肽鍵、活性多肽及一級結構的測定 蛋白質的空間結構：二級結構單元（ -螺旋、-折疊、 -轉角、無規(guī)卷曲）、三級與四級結構（超二級結構、結構域、亞基）及結構與功能的關系 蛋白質的性質：大分子性質、蛋白質分子量的測定（離心法、凝膠過濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、兩性電離（等電點、電泳、離子交換）、膠體性質、蛋白質沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白質變性、紫外吸收及顏色反應 8. 蛋白質的分離、分析技術,課外作業(yè) P61-62思考題 ：3、4、6、8,