生命科學(xué)領(lǐng)域的新工具SELDI蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對 臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,20世紀(jì)90年代，隨著全球基因組計劃的推進(jìn)，人類對生命科學(xué)的認(rèn)識達(dá)到了新的未有的深度和高度。人類基因組工作草圖公布后，標(biāo)志著基因框架已經(jīng)繪就，人類染色體總DNA有32億堿基對，包含有3萬個左右基因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于原有約10萬個基因的估計。但是，由于真核生物中基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及現(xiàn)有基因識別技術(shù)發(fā)展的嚴(yán)重不足，所以適用范圍僅限于原核生物或低等真核生物，此情況進(jìn)一步表明人類對自身基因組的所有基因及其間隔序列還沒有完全確定。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的問世,加之mRNA自身在貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、翻譯調(diào)空以及產(chǎn)物的翻譯后加工，難以準(zhǔn)確地反映基因功能的真正執(zhí)行體的質(zhì)與量。而功能性蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行體，能直接反應(yīng)基因給予的信息，后基因時代便接踵而來。以蛋白質(zhì)作為研究對象，對正常細(xì)胞及變異細(xì)胞功能進(jìn)行分析，從而可以尋找疾病的特異性標(biāo)志物；也可以利用尋找終末點(diǎn)的方法來對化學(xué)制劑和藥物毒副作用進(jìn)行評估。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的問世,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,Enabling Proteomics,美國Ciphergen生物公司生產(chǎn)的SELDI-TOF MS（surface enhanced laser desorprion/ionization-time of flight mass）主要包括三個基本部分： 特殊材料制成的固相載體，即蛋白芯片陣列，組成芯池的特殊材料是根據(jù)要捕獲蛋白質(zhì)的屬性而設(shè)計的，概括起來可歸納為兩大類型：a.化學(xué)型材料；b.生物化學(xué)型材料。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,二、SELDI蛋白質(zhì)芯片儀的組成及工作原理,蛋白質(zhì)芯片解讀儀（proteinchip reader）， 蛋白質(zhì)芯片解讀儀是安裝有脈沖式紫外線/氮激光光源的解析離子化（laser desorption ionization，LDI）時間-飛行質(zhì)譜儀（TOF MS）。基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離，經(jīng)解析/離子化過程而形成氣化離子狀態(tài)，它們進(jìn)入TOF-MS區(qū)域飛行。根據(jù)蛋白質(zhì)通過離子室的飛行速度，得出每個蛋白質(zhì)的質(zhì)量/電荷比（m/z），其公式為：E1/2mv2ZV；M/ZK*t2（其中Z為電荷數(shù)，V為 電壓，v為飛行速度，K為一常數(shù)）。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,用蛋白質(zhì)芯片儀測定 Detection Using the ProteinChip System,用激光解吸電離發(fā)法將保留在芯片上的蛋白質(zhì)洗脫下來 Retained proteins are “eluted” from the ProteinChip Array by Laser Desorption and Ionization 電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時間質(zhì)譜儀精確地測定它們的質(zhì)量 Ionized proteins are detected and their mass accurately determined by Time-of-Flight Mass Spectrometry,蛋白質(zhì)芯片軟件控制分析系統(tǒng)（Software） SELDI TOF-MS 控制分析軟件，由Ciphergen公司研發(fā)，軟件控制分析系統(tǒng)使整個操作過程變的自動化、簡捷化、人性化。目前所用的軟件系統(tǒng)為proteinchip software 3.11版本，它主要包括：a.數(shù)據(jù)庫的建立；b.內(nèi)部信息及外部信息的校準(zhǔn)；c.數(shù)據(jù)處理與分析。二維凝膠電泳（2-DE）是經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對樣品的要求以及對樣品的處理大大簡化SELDI蛋白質(zhì)芯片儀最適合分析多肽及蛋白質(zhì)混合物，它是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀，能夠?qū)O微量樣品進(jìn)行分析。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,Protein Discovery and Characterization ProteinChip Advantages 蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜的技術(shù)優(yōu)勢,從未經(jīng)提純的生物或臨床樣品中直接捕獲, 檢測和分析蛋白質(zhì), 不需任何標(biāo)記或加尾. 超高的檢測靈敏度 (1-50 fmole的蛋白質(zhì)) 從超小樣品體積(0.5 l)到大體積(400 l)的靈活選用 小型實驗或高通量篩選的自由選擇: 每次可準(zhǔn)備8, 16, 96, or 192 個樣品 快速獲取實驗結(jié)果 超精確的蛋白質(zhì)分子量,在識別特定蛋白質(zhì)表達(dá)物，細(xì)胞株肽庫的建立，完成腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的篩選和鑒定，從蛋白質(zhì)水平上對藥物毒性和安全性的評價等方面均證實蛋白質(zhì)芯片是一種高通量、高靈敏度、高特意性且微型化的蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和證實 疾病監(jiān)測 (藥物療效的追蹤等) 毒理學(xué) 臨床診斷 藥物動力學(xué),免疫方法設(shè)計與篩選 受體配體反應(yīng) 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 DNA-蛋白質(zhì)相互作用,純化策略的設(shè)計與純化過程的監(jiān)測 蛋白質(zhì)身份檢索 蛋白質(zhì)修飾分析 (磷酸化, 糖基化等) 抗原決定位點(diǎn)分析,蛋白質(zhì)指紋圖譜分析,蛋白質(zhì)的純化與分析,分子識別,ProteinChip Applications 蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜的應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,由于新的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能快速方便地找出痕量存在的蛋白質(zhì)，因此可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。Diamord DL等將Epstein-Barr病毒基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)，利用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測B細(xì)胞所分泌微量球蛋白的變化，精確篩選靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，達(dá)到預(yù)期試驗?zāi)康摹ELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正如基因芯片、組織芯片等生物芯片為生物信息時代的發(fā)展注入了活力。,1.在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,Ad是神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退變而形成的一種疾病，它是癡呆性疾病中最常見的一種。AD突出的特點(diǎn)表現(xiàn)在大腦組織中出現(xiàn)退化斑塊及神經(jīng)纖維聯(lián)系混亂。Huw Davies等人利用SELDI蛋白質(zhì)芯片儀對患者腦脊液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了-淀粉樣蛋白肽（Amyloid peptide，A），可導(dǎo)致人腦產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變；該研究小組還論證了A的差異性變體A1-42對大腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：老年癡呆癥（AD）,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,前列腺癌在西方國家發(fā)病率較高，美國前列腺癌的發(fā)病率占男性惡性腫瘤第一位。由于血清中PSA的低特異性，導(dǎo)致許多假陽性和假陰性的發(fā)生，說明PSA作為前列腺癌早期診斷及前列腺內(nèi)皮細(xì)胞惡變初期的檢測指標(biāo)不甚令人滿意，GL Wright Jr等人運(yùn)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)不但快速、準(zhǔn)確地檢測到未被檢測出的前列腺癌患者的PSA，而且在前列腺癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)三種具有免疫球蛋白捆綁因子活性的蛋白質(zhì)，對前列腺癌的早期診斷有重要意義。Adam運(yùn)用同樣的技術(shù)在前列腺癌患者的尿液中發(fā)現(xiàn)9個蛋白質(zhì)與正常人及前列腺增生患者尿液中的蛋白質(zhì)含量不同，其靈敏度可達(dá)83，特異性為97，陽性預(yù)測率值為96。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：前列腺癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,膀胱腫瘤在歐美一些國家的發(fā)病率僅次于前列腺癌，在我國是泌尿生殖系中最常見的腫瘤。Vlahou A等學(xué)者收集94份尿液樣本，其中包括膀胱移行細(xì)胞腫瘤患者（transitional cell carcinoma of the bladder，TCC），正常人和泌尿系其它良性疾病。TCC病人組中發(fā)現(xiàn)5個新的特異性蛋白標(biāo)志物和7個蛋白質(zhì)簇（分子量范圍在3.3133kd）。利用SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，檢測TCC蛋白標(biāo)志物的靈敏度為87，特異性達(dá)66。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：膀胱癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,乳腺癌是女性腫瘤死因的重要?dú)⑹种?。Paweletz CP等應(yīng)用SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對乳頭吸取液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢查，在對12個乳腺癌患者及15個健康對照者的檢查對比中，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者4,233kd和9,470kd分子量的蛋白質(zhì)含量明顯增高。Li J等將乳腺癌患者進(jìn)行臨床分期：0期4人，期38人，期37人，期24人，并設(shè)立對照組41人，其中25人為乳腺其它良性病變，其余為健康者。他們抽取患者血清利用IMAC3鎳螯合金屬芯片，發(fā)現(xiàn)0期和期患者血清中有3種蛋白質(zhì)含量明顯不同于無瘤者和期、期患者，為早期診斷乳腺癌提供了可靠依據(jù)。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：乳腺癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,目前尋找胰腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物尤顯重要。Christophe Rosty等應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對抽取的胰液樣本進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)胰腺腫瘤患者及其它胰腺疾病患者都存在一種特異性蛋白質(zhì)，分子量為16,570D，該蛋白質(zhì)在胰腺腫瘤患者中的檢出率為67（10/15），在其它胰腺疾病患者中的檢出率為14（1/7），經(jīng)證實該蛋白質(zhì)為肝-腸-胰相關(guān)蛋白（HIP/PAP-）。胰腺腫瘤患者組與對照組相比，HIP/PAP-在胰液中及血清中的水平都明顯增高（P0.001）。他們進(jìn)一步研究得出：胰液中HIP/PAP-水平升高尤為明顯，當(dāng)濃度20g/ml時，患胰腺癌的可能性較濃度20g/ml的高出21.9倍。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：胰腺癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,手術(shù)治療早期大腸癌的5年生存率可達(dá)99，效果良好，但由于各種原因的影響對高危人群的篩選及對大腸癌的早期診斷率只有37，所以對大腸癌的早期診斷尤顯重要。Roboz等分析大腸癌患者（34例）與正常對照組（14例）之間的血清蛋白圖譜的差異，其中大腸癌患者高表達(dá)8.9425.3kD蛋白質(zhì)，而9.3kD的蛋白質(zhì)呈低表達(dá)，正常對照組上述兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況與患者組正好相反。實驗結(jié)果表明8.9kD和9.3kD蛋白質(zhì)可作為檢測大腸癌的腫瘤標(biāo)記物。,2.在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：大腸癌,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在歐美地區(qū)的發(fā)病率及死亡率明顯高于亞非等國家。在我國，隨著人民生活水平的不斷提高，大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，這已引起人們的廣泛關(guān)注。目前臨床上缺乏早期診斷大腸癌的特異性標(biāo)記物，因此從血清中尋求特異性標(biāo)記物，用于大腸癌的早期診斷成為了急需解決的問題。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,我們應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，利用IMAC3-Cu芯片對146例確診為大腸癌患者，62例正常人及32例大腸良性疾病患者的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者血清中蛋白質(zhì)在4476 Da至15122Da間有十個蛋白質(zhì)含量有差異，靈敏度和特異性分別為97.26與95.92。同時用血清中CEA 做對照檢測，靈敏度不高，特異性僅為37。下一步的實驗中，我們將對檢測出的特異性標(biāo)記物蛋白，進(jìn)行分離純化，將對其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，進(jìn)一步明確其結(jié)構(gòu)和大腸癌形成發(fā)展過程中的詳細(xì)功能。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)問世以來，為研究蛋白質(zhì)的特征、屬性、功能提供了快速、準(zhǔn)確、高效的技術(shù)平臺。目前，SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、工業(yè)制藥、食品衛(wèi)生、生物工程等廣闊領(lǐng)域。這項技術(shù)結(jié)合對基因組知識的認(rèn)知，必將為疾病的早期診斷、療效監(jiān)測、生物及免疫治療提供了強(qiáng)有力武器，它將為人類的健康事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)。,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)及對臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的影響,SEDLI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)應(yīng)在不斷實踐工作中進(jìn)行改進(jìn)，如：加大芯片攝取蛋白質(zhì)的數(shù)目和種類，盡可能多的捕獲蛋白質(zhì)信息；簡化操作過程，縮短試驗成果向臨床實際應(yīng)用轉(zhuǎn)化的步驟和時間，切實做到快速準(zhǔn)確；加強(qiáng)計算機(jī)技術(shù)對蛋白質(zhì)獲得信息的處理進(jìn)程，減少手工圖譜處理；降低工作成本，便于推廣。對蛋白質(zhì)的研究將成為新世紀(jì)最大戰(zhàn)略投入，蛋白質(zhì)組學(xué)必將成為后基因時代的“中流砥柱”。,