熒光定量PCRreal time-PCR,1,定量PCR反應(yīng)體系,2,定量與常規(guī)PCR的差別,常規(guī)PCR技術(shù)： 對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析,定量PCR技術(shù)： 通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析,三個(gè)關(guān)鍵詞： 實(shí)時(shí)，定量，熒光,3,PCR分四個(gè)階段,4,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。,5,定量原理,確定初始模板的濃度,初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量,6,7,起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量,8,熒光化學(xué),SYBR Green 1,TaqMan,9,TaqMan,10,SYBR Green I 工作原理,。 SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光,未結(jié)合SYBR Green 1 dye,變性: 無熒光信號,11,SYBR Green I 應(yīng)用范圍,起始模板濃度定量 融解曲線分析 -可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體 基因型分析,12,SYBR Green I 優(yōu)點(diǎn),SYBR Green I 缺點(diǎn),13,14,PCR程序指南,15,UNG酶使用原理,16,金牌Tag酶活性,17,參比熒光：管家熒光ROX,18,ROX校正效果,19,96孔板設(shè)置舉例,20,PCR曲線,21,標(biāo)準(zhǔn)曲線,22,