| 1 高質(zhì)量流感疫苗 是怎樣“煉”成的？ -流感疫苗的生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制 舒儉德 MD MBA 賽諾菲巴斯德 | 2 主要內(nèi)容 流感疫苗研發(fā)歷史 生產(chǎn)步驟和質(zhì)量要求 從雞蛋選擇開始 質(zhì)量是做出來的， 不是檢出來的 生物安全和上市后的藥物警戒 o1933年：首次在雪貂身上分離到甲型流感病毒 o1936年：雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功 o1941年：全病毒滅活流感疫苗在美國首次獲得批準(zhǔn) o1945年：在美國開始廣泛應(yīng)用，由位于賓夕法尼亞州Swiftwater的Pocono生物制 藥公司生產(chǎn) o1968年：流感病毒裂解疫苗上市，由法國巴斯德研究所和梅里厄研究所生產(chǎn) 流感疫苗研發(fā)歷史 張延齡等 疫苗學(xué) 科學(xué)出版社 1176頁 | 3 脂質(zhì)層 血凝素(HA ) 神經(jīng)氨酸酶(NA ) 核衣殼 基質(zhì)蛋白 全病毒疫苗 亞單位疫苗 裂解疫苗 流感疫苗種類 | 4 外抗原 內(nèi)抗原 | 5 主要內(nèi)容 流感疫苗研發(fā)歷史 生產(chǎn)步驟和質(zhì)量要求 從雞蛋選擇開始 質(zhì)量是做出來的， 不是檢出來的 生物安全和上市后的藥物警戒 雞胚接種和孵化 滅活流感疫苗的三大生產(chǎn)步驟 原液生產(chǎn)和檢定分裝和包裝 | 6 疫苗生產(chǎn)的特點(diǎn)及其質(zhì)量控制原則 | 7 特點(diǎn)為什么如何質(zhì)量控制 成分的多樣性 不同種類的疫苗（如流感疫苗）含有不同的成分，有 時(shí)難以用理化方法定量和定性，用生物學(xué)技術(shù)和分析 方法檢測的結(jié)果，變異范圍往往大于理化測定方法 通過測定生物學(xué)效價(jià)來測定其抗原含量 建立方法的標(biāo)準(zhǔn)化，并用同一參照品校 準(zhǔn) 生產(chǎn)起始物料的生 物活性 病毒種子：其固有的可變性和生產(chǎn)過程中可能引起的 變化，會(huì)直接或間接影響疫苗的質(zhì)量 毒種篩選原則：安全性、免疫原性、遺 傳學(xué)穩(wěn)定性和生產(chǎn)適用性（由WHO推薦 和提供流感疫苗毒株） 細(xì)胞培養(yǎng)：可能存在動(dòng)物原性病原體的污染風(fēng)險(xiǎn)，如 雞胚細(xì)胞可能被污染禽白血病病毒 原材料質(zhì)量控制（專屬養(yǎng)雞場和現(xiàn)代化 管理） 細(xì)胞培養(yǎng)基：動(dòng)物來源原材料存在潛在安全隱患，如 牛血清的瘋牛病治病因子風(fēng)險(xiǎn) 改用人工合成無動(dòng)物蛋白（APF）培養(yǎng) 基 生產(chǎn)過程的復(fù)雜性 可能的污染物（外源的）： 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中可 能搜到病毒、細(xì)菌、真菌和支原體污染 嚴(yán)格的生產(chǎn)過程質(zhì)量控制（GMP） 可能的殘留雜質(zhì)（內(nèi)生的）：細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中 可能 含有DNA、宿主蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素和細(xì)胞代謝產(chǎn)生的蛋 白質(zhì) 嚴(yán)格的產(chǎn)品質(zhì)量控制（對原液、半成品 和終成品的檢定） 流感疫苗生產(chǎn)用雞 胚的要求 毒種傳代和制備用雞胚應(yīng)來源于SPF雞群 疫苗生產(chǎn)用雞胚（蛋）應(yīng)來源于封閉式房舍內(nèi) 飼養(yǎng)的健康雞群 選用911日齡無畸形、血管清晰、活動(dòng)雞胚 專屬農(nóng)場飼養(yǎng)+現(xiàn)代化管理 全程跟蹤的雞群健康監(jiān)控計(jì)劃 先進(jìn)的雞胚孵化中心 資料來源： 王軍志 疫苗的質(zhì)量控制與評價(jià) 人民衛(wèi)生出版社 2013版 第13頁 | 8 主要內(nèi)容 流感疫苗研發(fā)歷史 生產(chǎn)步驟和質(zhì)量要求 從雞蛋選擇開始 質(zhì)量是做出來的， 不是檢出來的 生物安全和上市后的藥物警戒 “三代單傳”的優(yōu)種雞胚 | 9 流感疫苗的生產(chǎn)從選擇雞蛋開始 流感疫苗生產(chǎn)工藝 運(yùn)輸 疫苗工廠 祖父母代雞群選種 （種蛋） 上游供應(yīng)商 父母代雞苗 父母代母雞 （受精） 父母代產(chǎn)受精蛋 （25周） 胚蛋孵化 （9-11天齡） 雞蛋供應(yīng)商 飼養(yǎng)階段生產(chǎn)階段孵化 選種優(yōu)良 品系證明 祖父母代 無禽白血病污染雞苗 專屬農(nóng)場飼養(yǎng)+現(xiàn)代化管理 全程跟蹤的雞群健康監(jiān)控計(jì)劃 先進(jìn)的雞胚孵化中心 專屬農(nóng)場+現(xiàn)代化管理 | 10 要求如何做為什么 專屬農(nóng)場 雞場選址在與世隔絕的山區(qū)，方圓幾公里內(nèi)沒有 其他禽類農(nóng)場，也沒有池塘和湖 降低外部環(huán)境污染養(yǎng)雞場的風(fēng)險(xiǎn) 全封閉式雞場：對雞舍的封閉和對飼養(yǎng)人員的封 閉管理 避免與外界病原體接觸（如禽流感） 現(xiàn)代化 管理 自動(dòng)化環(huán)境監(jiān)控溫度、通風(fēng)系統(tǒng)提高雞群生活舒適度 大籠3平米養(yǎng)40只雞，一只雞有720cm2 自然交配人性化飼養(yǎng)，避免因人工受精而造成交叉污染 定時(shí)燈光管理調(diào)整“體成熟”和“性成熟”時(shí)間，保證母雞在 正確的時(shí)間（25周）產(chǎn)下符合標(biāo)準(zhǔn)的受精蛋 全程跟蹤的雞群健康監(jiān)控計(jì)劃和孵化工藝 | 11 要求如何做為什么 全程跟蹤的雞群健康監(jiān)控 計(jì)劃 定時(shí)體檢（每周取樣) 雞群的疫苗接種計(jì)劃保證雞群健康雞新城疫 雞傳染性氣管炎 禽腦脊髓炎 雞傳染性喉氣管炎 雞馬立克病 雞毒支原體 沙門菌 雞白痢 禽滑液囊支原體 禽流感 先進(jìn)的孵化工藝 孵化中心啟用前要采取相應(yīng)監(jiān)控措施（如確保無沙門氏菌方可 接收種蛋） 從雞舍收集的雞蛋在雞舍要進(jìn)行福爾馬林熏蒸 送到孵化中心還要進(jìn)行一次篩選（剔除臟蛋，裂紋蛋，輕重蛋 ） 對孵化過程全程記（溫濕度、翻蛋等） 保證生物安全，確?？?追溯性 在養(yǎng)雞場對雞胚100%全檢 外觀、潔凈度、無微生物污染 蛋殼完整性、氣室位置、雞胚活力 胚齡、胚胎發(fā)育情況、胚重 胚蛋重量及蛋殼表面微生物 確保與歐盟同等質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn) | 12 主要內(nèi)容 流感疫苗研發(fā)歷史 生產(chǎn)步驟和質(zhì)量要求 從雞蛋選擇開始 質(zhì)量是做出來的， 不是檢出來的 生物安全和上市后的藥物警戒 流感疫苗生產(chǎn)流程 6個(gè)階段22個(gè)步驟， 用于質(zhì)控的時(shí)間70%1 每個(gè)批號100多個(gè)檢測點(diǎn) 400多個(gè)檢測參數(shù)2 1.Sanofi Pasteur internal data. 2.Data on file Sanofi Pasteur. 病毒培養(yǎng) 病毒收獲 純化 裂解 滅活 終過濾 單價(jià)流感原液 QC QC QC QC QC QC QC | 13 優(yōu)化純化、裂解和滅活工藝，提高產(chǎn)品安全性 先純化后裂解再滅活工藝，降低因滅活致白蛋白結(jié)構(gòu)改變而產(chǎn)生致敏性的風(fēng) 險(xiǎn) 獨(dú)特的二次區(qū)帶離心技術(shù)，利用病毒顆粒與雜質(zhì)在介質(zhì)中的不同分布，以蔗糖密 度梯度離心方式純化病毒1（如去除流感病毒脂質(zhì)層） 應(yīng)用辛苯醇醚-9（Triton X-100）作為裂解劑，有助于去除內(nèi)毒素，充分優(yōu)化疫 苗的安全性和免疫效果2 采用甲醛滅活：甲醛對病毒核酸和病毒蛋白質(zhì)都有破壞作用,它使分子間產(chǎn)生共 價(jià)鍵，使蛋白分子無法再改變其空間構(gòu)型,這使病毒無法感染新的細(xì)胞及復(fù)制3 1.王軍志：疫苗的質(zhì)量控制與評價(jià) 人民衛(wèi)生出版社 2013版 第642頁 2. Delore V,et al. Vaccine 2006; 24(10):1586-92 3.疫苗滅活http:/ | 14 不同工藝的比較 1 王軍志 疫苗的質(zhì)量控制與評價(jià) 人民衛(wèi)生出版社 2013版 第642頁 2. Delore V,et al. Vaccine 2006; 24(10):1586-92 3.滅活劑百度文庫： http:/ | 15 工藝技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn) 生產(chǎn)流程1 先滅活后純化首先滅活病毒和污染的其它微生 物，然后在較為安全的條件下進(jìn) 行后續(xù)工藝 滅活劑用量大，增加去除殘余量難 度；可能與其它分子也形成共價(jià)鍵 而產(chǎn)生大分子結(jié)構(gòu)在后續(xù)的純化中 難以去除 先純化后滅活經(jīng)純化和裂解后的病毒更加容易 滅活，滅活劑用量少 先純化時(shí)可能損失有用抗原，故需 要生產(chǎn)的抗原量大，成本高 裂解劑2 聚山梨酸酯80 （吐溫80） 裂解效果良好有機(jī)溶劑，需要使用乙醚，乙醚不 穩(wěn)定，易揮發(fā)，易爆（工業(yè)風(fēng)險(xiǎn)） 三硝甲基苯 （Triton X- 100) 非離子型表面活性劑，裂解效果 良好，工業(yè)操作容易，且對去除 內(nèi)毒素有幫助 無資料 滅活劑3 -丙內(nèi)酯在液體中完全水解，無殘留不穩(wěn)定，易揮發(fā)，在空氣中有毒性 甲醛滅活效果良好，工藝成熟需要嚴(yán)格去除殘留游離甲醛 “有圖有真相” | 16 裂解前：可見完整病毒裂解后：病毒完全分解，蛋 白片段均勻分布于介質(zhì)中， 未見蛋白聚合體 過程控制：嚴(yán)格控制批內(nèi)差異和批間差異 | 17 中國藥典與歐洲藥典比較（摘要） （資料來源：王軍志 疫苗的質(zhì)量控制與評價(jià) 人民衛(wèi)生出版社 2013版 第646頁） 項(xiàng)目（成品中）中國藥典歐洲藥典/SP標(biāo)準(zhǔn) 總蛋白含量400g/ml300g/ml 卵清蛋白含量500ng/ml400ng/ml 硫柳汞（防腐劑）含量100g/ml無（SP標(biāo)準(zhǔn)） 抗生素殘留量50ng/劑50ng/劑（SP標(biāo)準(zhǔn)） 鑒別 試驗(yàn) 病毒滅 活驗(yàn)證 血凝素 含量 無菌 檢查 內(nèi)毒素 含量 蛋白質(zhì) 含量 裂解劑 殘留量 卵清蛋 白含量 游離甲 醛含量 抗生素 殘留量 異常毒 性檢查 單價(jià) 原液 + 半成品 + 終成品 + （資料來源：SP流感疫苗鑒定規(guī)程） SP內(nèi)部放行檢測 | 18 主要內(nèi)容 流感疫苗研發(fā)歷史 生產(chǎn)步驟和質(zhì)量要求 從雞蛋選擇開始 質(zhì)量是做出來的， 不是檢出來的 生物安全和上市后的藥物警戒 生物安全和環(huán)境保護(hù) 生物安全 BSL2（生物安全二級標(biāo)準(zhǔn)）的廠房設(shè)計(jì)，確 保流感病毒不會(huì)釋放到周邊環(huán)境中 采用多組HVAC空調(diào)系統(tǒng)分區(qū)管理，通過氣壓 設(shè)計(jì)合理設(shè)計(jì)氣流流向，有效防止污染和交 叉污染 FM Global公司 的“HPR”認(rèn)證（可以承受 八級地震，十二級臺風(fēng)的侵襲） | 19 環(huán)境保護(hù) 自建廢水處理站 所有BSL2區(qū)域產(chǎn)生的廢棄物（廢雞蛋）經(jīng)過 熱處理殺滅病毒，再由環(huán)保部門指定專業(yè)公 司做焚毀處理 | 20 疫苗上市后不良反應(yīng)監(jiān)測和評價(jià) 疫苗上市后不良反應(yīng)監(jiān)測必要性1 上市前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性 : 動(dòng)物無法反應(yīng)人體的自覺反應(yīng)，毒理試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，人與動(dòng)物模型的差異 上市前臨床試驗(yàn)研究的局限性： 病例數(shù)少，研究時(shí)間短，受試人群范圍較窄 1.王軍志 疫苗的質(zhì)量控制與評價(jià) 人民衛(wèi)生出版社 2013版 第340頁. 2.武文娣等 中國2011年疑似預(yù)防接種異常反應(yīng)監(jiān)測數(shù)據(jù)分析 中國疫苗和免疫 2013年4月第19卷第2期 第97-109頁 AEFI非嚴(yán)重AEFI嚴(yán)重AEFI一般反應(yīng)異常反應(yīng) 例數(shù)發(fā)生率例數(shù)發(fā)生率例數(shù)發(fā)生率例數(shù)發(fā)生率例數(shù)發(fā)生率 流感 疫苗 200 316.15197 115.89320.26182 014.6711725.39 DTaP29 26741.0829 14640.911210.1727 93539.211 1871.67 2011年流感疫苗AEFI報(bào)告例數(shù)和報(bào)告發(fā)生率2 （/10萬劑） 最常見癥狀（/10萬劑）： 過敏性皮疹 （0.74），血管性水腫（0.12），熱性驚厥（0.06），過敏性紫癜（0.06），ITP（0.02） ，GBS（0.02），過敏性休克（0.01），喉頭水腫（0.01），無菌性膿腫（0.01），淋巴管炎 （ 0.01），ADEM（0.01） | 21 全球及中國的定期安全性更新報(bào)告（PSUR） 在全球（含中國），自2007年5月1日至2012年4月30日， Vaxigrip的銷量約3億4千萬劑 共收到不良事件報(bào)告3295例，不良事件報(bào)告率為9.7/100萬* 其中嚴(yán)重不良事件1495例，非嚴(yán)重不良事件1800例 沒有任何安全性問題或可疑的安全信號被提出 *Sanofi Pasteur Period Safety Update Report *武文娣等 中國2011年疑似預(yù)防接種異常反應(yīng)監(jiān)測數(shù)據(jù)分析 中國疫苗和免疫 2013年4月第19卷第2期 第97-109頁 在中國，自2007年1月1日至2011年12月31日，進(jìn)口銷售凡爾靈疫 苗約2千7百萬劑 公司藥物警戒部門共計(jì)收到不良事件書面報(bào)告153例，不良事件報(bào)告 率為5.6/100萬*（中國流感疫苗AEFI報(bào)告發(fā)生率161.5/100萬*） 最常見的接種后不良事件是輕中度的一過性發(fā)熱、局部紅腫、疼痛等 ，皮疹及過敏反應(yīng)次之。 大多不良事件的程度均為輕微和中等，通常在接種后一天發(fā)生，三天 內(nèi)恢復(fù)。 | 22 全球及中國開展的上市后臨床試驗(yàn) 在全球(除中國），自2001年以來，共有41項(xiàng)含有Vaxigrip 的研究 ，在22個(gè)國家開展： 法國 (18), 比利時(shí)(4), 德國 (4), 英國(4) 意大利 (1), 西班牙 (1), 瑞士 (5), 芬蘭 (3), 立陶宛 (4), 捷克 (1), 奧地利 (1), 俄羅斯 (1), 烏克蘭 (1), 波蘭 (1), 加拿大 (1), 巴西 (1), 澳大利亞 (5), 新西蘭(1), 新加坡 (1), 菲律賓 (1), 韓國 (1), 南非(1) Data on file Sanofi Pasteur. 在中國，自2002年以來，已發(fā)表的 含有凡而靈的研究32項(xiàng)，其中： 免疫原性和安全性研究20項(xiàng) 安全性考核3項(xiàng) 有效性評價(jià)9項(xiàng) | 23 臨床安全性也是做出來的， 不是考察出來的。 產(chǎn)品質(zhì)量是做出來的， 不是檢出來的。 | 24 “讓人類不再因疫苗 可預(yù)防的疾病而遭受 痛苦甚至死亡?！?路易-巴斯德 1822-1895