《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 教案》由會(huì)員分享,可在線閱讀,更多相關(guān)《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 教案(5頁(yè)珍藏版)》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段教學(xué)設(shè)計(jì)教學(xué)目標(biāo)(一)知識(shí)與技能1、了解PCR技術(shù)的基本操作2、理解PCR的原理3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用(二)過(guò)程與方法在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,應(yīng)避免外源DNA污染,嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件(三)情感、態(tài)度與價(jià)值觀通過(guò)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果分析,培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實(shí)事求是的科研精神教學(xué)重難點(diǎn)教 學(xué)重點(diǎn):PC R的原理和PCR的基本操作教學(xué)難點(diǎn):PCR的原理教學(xué)工具多媒體教學(xué)過(guò)程(一)引入新課在現(xiàn)代生物技術(shù)中,DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類(lèi)基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測(cè)、古生物鑒定等都離不開(kāi)對(duì)DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序
2、列,就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢?今天我們來(lái)研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)PCR技術(shù)。(二)進(jìn)行新課1基礎(chǔ)知識(shí)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程,與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程類(lèi)似:11細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析:12細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程(1)DNA的反向平行結(jié)構(gòu):(結(jié)合投影圖)核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性:(分子結(jié)構(gòu)模式圖)由核苷酸通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長(zhǎng)鏈:(模式圖,體現(xiàn)方向性)。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu):(2)DNA的復(fù)制過(guò)程:解 旋:解旋酶、ATP,DNA兩條鏈打開(kāi),形成兩條DNA單鏈。引物結(jié)合:在DNA單鏈3端與DNA反向配對(duì)結(jié)合,確保引物3端與DNA單鏈準(zhǔn)
3、確配對(duì)。DNA聚合酶結(jié)合:子鏈合成:DNA聚合酶從引物3端開(kāi)始,將配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)。后續(xù)加工:DNA聚合酶I將引物切去,并合成空缺處的DNA單鏈,再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(lái)(半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈,滯后鏈)子鏈合成特點(diǎn):不能從頭合成;合成方向?yàn)椤?3合成”。感悟生命的神秘:DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成,還具有校對(duì)功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次,只有堿基配對(duì)無(wú)誤后才能繼續(xù)往下聚合,它不能從頭合成。RNA聚合酶沒(méi)有校對(duì)功能,因此RNA的合成不需要引物,而是從頭合成的,它的錯(cuò)配可能性較大,在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去,代之以高保真的DNA
4、鏈。思考DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些?DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板;堿基互補(bǔ)配對(duì);DNA聚合酶的復(fù)查功能。思考細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的?RNA合成、蛋白質(zhì)合成。13DNA分子復(fù)制的人工控制解開(kāi)螺旋:在80100時(shí),DNA雙螺旋打開(kāi),形成兩條DNA單鏈,稱為變性?;謴?fù)螺旋:在50左右時(shí),兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu),稱為復(fù)性。復(fù)制條件:緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。反應(yīng)場(chǎng)所:PCR儀(自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié))。思考緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分?(核基質(zhì))14PCR的反應(yīng)過(guò)程 變性:在95時(shí)DNA解旋復(fù)性:在50時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合延伸:在72時(shí)合成DNA子鏈
5、(兩個(gè)引物間的序列)2實(shí)驗(yàn)操作21 PCR反應(yīng)體系:緩沖液、DNA模板,四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物,水22 實(shí)驗(yàn)操作步驟23 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液;(2)將PCR反應(yīng)體系50L用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管(0.5mL)中;(3)將微量離心管放到PCR儀中;(4)設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。(5)DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。24 水浴法:將微型離心管依次在95、55、72的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。3實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)31避免外源DNA污染:所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。32緩沖液和酶分裝成小份,20低溫保存。33每添加一種反應(yīng)成分,更換一個(gè)移液器的
6、槍頭。34混勻后離心處理,使反應(yīng)液集中在離心管底部。4結(jié)果分析與評(píng)價(jià)41反應(yīng)液稀釋:取2uLPCR反應(yīng)液,添加98uL蒸餾水;2分光光度計(jì)調(diào)零:將100uL蒸餾水添加到比色杯中,在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。42將100uL反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中,測(cè)定在260nm處的光吸收值。43計(jì)算:DNA含量50光吸收值稀釋倍數(shù)課后小結(jié)課后習(xí)題1DNA分子復(fù)制時(shí),解旋的兩條鏈中( )A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子D兩條鏈作為模板,各自合成一條子鏈,然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來(lái)的雙螺旋分子,兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA
7、分子2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過(guò)程的正確順序是( )互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)子鏈與母鏈盤(pán)旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A B C D3.下列各項(xiàng)過(guò)程中,遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有( )DNA復(fù)制RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A B C D4.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是( )酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A B C D5.利用PCR技術(shù),把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代,經(jīng)過(guò)3次循環(huán),在第四代DNA分子中,有幾條第一代脫氧核苷酸的長(zhǎng)鏈?( )A 2 B 4 C 8 D 16,答案: CDADA