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1、DNA瓊脂糖凝膠電泳,實 驗 二,學(xué)時：3,1、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理和方法。 2、學(xué)習核酸染色的方法。,一、實驗?zāi)康模?（一）電泳技術(shù)： 1、電泳定義：是指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。 根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，可分為濾紙，醋酸纖維薄膜，淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛，從分離小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒的分離鑒定都依賴于電泳技術(shù)。,二、實驗原理:,（1）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快； （2）顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快； （3） 溶液的粘

2、度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快； （4）溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點越近，電泳速度越慢，反之越快；,2、影響電泳的主要因素：,（5）電場強度：電場強度越小，電泳速度越慢，反之越快； （6）離子強度：離子強度越大，電泳速度越慢，反之越快； （7）電滲現(xiàn)象：電場中，液體相對于固體支持物的相對移動； （8）支持物篩孔大?。嚎讖叫。娪舅俣嚷?，反之則快。,瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法之一。 瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來的，由半乳糖和3.6-脫水- 半

3、乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠，電泳中具有分子篩效應(yīng)。,（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：,DNA分子在pH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動（電荷效應(yīng)） 。 DNA分子泳動速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)外，還與DNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的分子篩效應(yīng)）。 電泳時，用溴酚藍做前沿指示劑，指示DNA樣品在凝膠中的確切位置。 溴乙啶是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個堿基對之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。這次實驗使用溴乙啶替代品（DNAgreen）,DNAgreen核酸染料,D

4、NAgreen是一種花箐類染料，具有安全、靈敏作為各種核酸電泳的染色劑。 DNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm還有一個吸收峰，與核酸結(jié)合后發(fā)射綠色熒光，因此在紫外凝膠透射儀上可以檢測出DNA樣品。 作為EB的一種替代品。,（1）核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 凝膠中，DNA片段遷移率與DNA分子大小成反比( 20kb) ，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。 （2）核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA(當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA不能進

5、入膠中)。 （3）不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。瓊脂糖濃度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：DNA片段在5-500bp之間時，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行電泳分離。,（三）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素,（1）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性能好、電泳速度快、分離DNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電泳。（2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可

6、直接用紫外光檢測及定量測定。（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法之一， DNA樣本的分離、純化、鑒定以及相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。,（四）瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點：,DNA Marker,熒光染料EB染色后，在紫外燈(305nm)下觀察到的電泳結(jié)果：,1、實驗材料：提取的小麥苗中的DNA 2、儀器： (1)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (2)可調(diào)微量移液器 (3)水平電泳槽 （4）暗箱紫外透射儀等。 3、試劑： （1）電泳緩沖液：Tris-硼酸EDTA（50TBE）pH8.3。 （2）加樣緩沖液：

7、0.25%溴酚藍（BPB），40%蔗糖，DNAgreen。 (4)瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%。,三、實驗材料、儀器和試劑：,1、凝膠板的制備： （1）取瓊脂糖0.7 g，加1TBE緩沖溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的瓊脂糖膠液。 （2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8mm高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺面上。 （3）插入梳子，梳齒下端離板底0.51mm。 （4）當瓊脂糖膠液溫度降到60的時候,將60凝膠不間斷倒入膠床，高34mm，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固。 （5）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面12mm，從一頭輕輕斜拉 梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。,四、實驗步驟：

8、,3、加樣： 將樣品DNA溶液與加樣緩沖液以5 ：1的體積比混合，用微量進樣器加樣，每加完一個樣品，沖洗三次。加樣量1520 l （加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部）。 4、電泳： 為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）開始時用較高電壓(80V)，樣品一進入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5V/cm 。當染料前沿移至底邊1-2mm時，電泳畢。 5、染色、觀察、顯微照相與記錄： 關(guān)閉電源，取出膠床，浸入0.5g/mL的EB溶液中，30min后取出。在紫外檢測儀下觀察凝膠中的DNA（紅橙色熒光），并進行顯微照相。最后要求繪制DNA電泳圖譜。,五、思考

9、題：,影響電泳的主要因素?,* 熒光染料EB染色的原理和優(yōu)點是什么？ 1、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽(Ethidium Bromide)。 EB是一種扁平分子，它可以嵌入核酸相鄰的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。 溴化乙錠嵌入堿基分子中，導(dǎo)致DNA在復(fù)制過程中錯配 。 所以溴化乙錠是一種強誘變劑，具有高致癌性。在實驗過程一定要帶上手套！,2、優(yōu)點： （1）染色比較簡便、快捷，一般在1015min就可反應(yīng)。 （2）EB對核酸分子無破壞作用，這是其它染料所不能做 到的。 （3）EB靈敏度高，可檢測出10ng或更少的D

10、NA含量。 （4）既可用于DNA也可用于RNA的檢測。 （5）EB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外 燈檢測電泳的進程和效果。 （6）EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光比游離的EB強10倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的EB也可檢測出DNA的條帶。,3、缺點： 溴乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配制試劑時應(yīng)戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進行處理。 （1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭； （2）室溫下放置1小時，不時的搖動； （3）用新華一號濾紙過濾，棄濾液； （4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。 *溴乙啶在260分解，在標準條件下進行焚化后不會有危險性。,終于下課了！,