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1、1,2010年版中國藥典微生物檢查法,別小琳 四川省食品藥品檢驗所 2010年4月,主要內(nèi)容,一、中國藥典2010年版微生物限度檢查法增修訂內(nèi)容簡介 二、培養(yǎng)基適用性實驗的實施與操作 三、白色念珠菌的檢查 四、微生物限度檢查方法驗證試驗 五、微生物限度檢查面臨的問題,3,(一)中國藥典2010年版微生物限度檢查法增修訂內(nèi)容簡介,4,中國藥典2010年版框架(衛(wèi)),中國藥典2010年版框架(衛(wèi)) 無菌檢查法 微生物限度檢查法 滅菌法 抑菌效力檢查法指導原則 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則 微生物限度檢查法應用指導原則 藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則,5,2010年版微生物限度檢查法修訂,201

2、0年版中國藥典微生物限度檢查法 附錄XIII C（一部） 附錄XI J （二部） 引入培養(yǎng)基適用性實驗 增加白色念珠菌檢查法 貼膏劑檢查方法的改進 限度標準表示方法改變,6,2010年版微生物限度檢查法修訂,1、附錄107頁，微生物限度檢查法 供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物（的生長和存活無影響）無毒性。 除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌及控制菌培養(yǎng)溫度為3035；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328（；控制菌培養(yǎng)溫度為3537）。 檢驗結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。,7,2010年版微生物限度檢查

3、法修訂,2、附錄107頁，檢驗量 除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；（中藥）膜劑為（50）100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗 ）。,8,2010年版微生物限度檢查法修訂,3、附錄107頁，膜劑供試品 取供試品（50）100cm2，剪碎，加（50ml或）100ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為110（或120）的供試液。,9,2010年版微生物限度檢查法修訂,4、附錄108頁，新增：貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的

4、保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。 5、附錄108頁，修訂：離心沉淀法 取一定量供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細菌檢查。 6、附錄108頁，增加：計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查,10,2010年版微生物限度檢查法修訂,7、附錄109頁，增加：表1常見干擾物的中和劑或滅活方法,11,2010年版微生物限度檢查法修訂,8、附錄109頁，增加： 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，

5、那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。然而，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。 計數(shù)方法驗證時，若采用上述計數(shù)方法總存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢測。,12,2010年版微生物限度檢查法修訂,9、附錄109頁，修訂：供試品檢

6、查（法） （取按驗證的方法制備的均勻供試液，）按計數(shù)方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成110、1102、1103等稀釋級。 1.平皿法 （采用平皿法進行菌數(shù)測定時，應取適宜的連續(xù)23個稀釋級的供試液。）,13,2010年版微生物限度檢查法修訂,10、附錄109頁，修訂：培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)（48小時）3天，逐日點計菌落數(shù)，一般以（48小時）3天的菌落數(shù)報告；霉菌、酵母菌培養(yǎng)（72小時）5天，逐日點計菌落數(shù)，一般以（72小時）5天的菌落數(shù)報告；必要時，可適當延長培養(yǎng)時間至（5）7天進行菌落計數(shù)并報告。,14,2010年版微生物限度檢查

7、法修訂,11、附錄109頁，修訂：菌數(shù)報告規(guī)則 細菌、酵母菌宜選取（細菌、酵母菌平均菌落數(shù)在30300之間）小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)（在30100之間）小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、1mL或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。,15,2010年版微生物限度檢查法修訂,12、附錄109頁，修訂：薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大于0.45m，直徑（約）一般為50mm，若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調(diào)整?？倹_洗量不得超過1000ml(每片濾膜的總過濾量不宜過大)，以避免濾膜上的微生物受損傷。 1

8、3、附錄110頁，增加：控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查,16,2010年版微生物限度檢查法修訂,14、附錄111頁，修訂：控制菌檢查方法的驗證 刪除陰性菌對照組 15、附錄113頁，修訂：梭菌 上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的（0.1%新鮮庖肉）梭菌增菌培養(yǎng)基中，（各培養(yǎng)基管在）置厭氧條件下培養(yǎng)（7296）48小時。（如試驗管不出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌；否則，應取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在置厭氧條件下培養(yǎng)4872小時。 16、附錄111頁，增加：白色念珠菌的檢查,17,二、培養(yǎng)基適用性實驗的實施

9、與操作,1.計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 （一）應用范圍;細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。 （二）菌種及菌液制備 驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Ca

10、ndida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003 菌液制備同微生物限度檢查方法學驗證,18,二、培養(yǎng)基適用性實驗的實施與操作,（三）操作 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 用相應的對照培養(yǎng)基同法操作 對照培養(yǎng)基：由中檢所研制并分發(fā) （四)結(jié)果判定 被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落大小形態(tài)一致,19,二、培養(yǎng)基適用性實驗的實施與操作,2、控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)

11、基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。 菌種 對試驗菌種的要求同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 094 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941 白色念珠菌（Candida albi

12、cans）CMCC（F） 98 001,20,二、培養(yǎng)基適用性實驗的實施與操作,增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應生長良好。 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗菌各0.1ml（50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板中，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，計數(shù)。被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比應不小于70%，且生長的菌落形態(tài)應一致。 培養(yǎng)基抑制能力檢查：劃線接種試驗菌（見表2）

13、于被檢培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間下培養(yǎng)，試驗菌應不得生長。 培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種少量試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中試驗菌生長的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致。,21,21,22,三、白色念珠菌的檢查,取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生

14、長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選23個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。 若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時。取培養(yǎng)物進行染色，鏡檢及芽管試驗。 芽管試驗挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載

15、玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置3537、13h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。 若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。,23,四、微生物限度檢查方法驗證試驗,24,關于方法驗證,中國藥典2005版首次引入方法驗證要求； 中國藥典2010版無菌檢查法和微生物限度檢查法延續(xù)了2005版方法驗證要求； 中國藥典2010版微生物限度檢查法應用指導原則（一部附錄XVIII F、二部附錄XIX P）第五條。,25,關于方法驗證,為什么驗證? 驗證什么? 怎么驗證? 何時驗證？,26,什么時候驗證？,當建立藥品的方法時，應進行方法的驗證；

16、 若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。,27,怎么驗證,1.驗證思路 （1）選擇敏感菌株 間接方法文獻、技術資料（可靠） 直接方法預實驗及體外抑菌實驗 參考選擇： 一般中藥選擇枯草和金葡； 一般抗生素根據(jù)抗菌譜選擇。,28,選擇敏感菌株,29,怎么驗證,（2）驗證方法的選擇 由簡到繁、由易到難 根據(jù)藥品的理化性質(zhì)選擇適宜的方法,30,怎么驗證,（3）驗證盡可能做到標準化操作，使操作簡便、結(jié)果重現(xiàn)性好。 菌液制備及放置時間 常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法操作注意事項 薄膜過濾法操作注意事項,31,驗證以后怎么辦？,無菌檢查：進行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法

17、相同。,微生物限度：檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌酵母菌菌數(shù)的測定；供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。,檢驗方法的各論化！,32,方法驗證實驗工作的完善和發(fā)展,一方面以驗證實驗為手段和契機，充分完善和細化我國無菌和微生物限度檢查方法，建立起完備的SOP體系。 另一方面集中力量盡快完成我國數(shù)以千計的品種的檢驗方法的初步驗證實驗，并收集、整理、分析已有驗證資料，指出各品種驗證實驗的發(fā)展方向。 通過方法驗證促進我國藥品微生物檢驗工作全面發(fā)展。,33,五、微生物限度檢查面臨的問題,34,1、技術現(xiàn)狀與標準化,1）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基質(zhì)量標準

18、。 固體培養(yǎng)基的靈敏度、專屬性,35,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性,當染菌較多時，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基生長大量的細菌，給結(jié)果判斷帶來困難。,36,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性,以中檢所玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：050428 ）與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：050523 ）比較，加入50100cfu陽性菌在相同條件培養(yǎng)觀察，見下表9：,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基專屬性實驗結(jié)果,37,1、技術現(xiàn)狀與標準化,2）、自動化程度低，仍然依賴大量的人工 以方法驗證為基礎，引入更為便捷的供試品前處理技術，規(guī)范供試品前處理 有條件的地方可以考慮引入自動稀釋、自動接種、儀器判讀結(jié)果等設備和技術 3）、75mm薄膜過濾器的研制 征對

19、我國中成藥品種多、情況復雜,已開發(fā)研制的75mm薄膜過濾器在目前的驗證工作中發(fā)揮了重要作用。,38,3、微生物限度檢查的幾個問題,原料藥的微生物標準問題； 藥材原粉的界定問題； 含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的中成藥制劑標準問題； 純化水微生物限度檢查問題；,39,原料藥的微生物標準問題,原料藥是藥品生產(chǎn)過程中引入微生物污染的重要來源之一，雖然一些藥品在生產(chǎn)過程或終產(chǎn)品階段可以采取一些滅菌措施殺滅污染微生物，但可能因為由此引入的死菌體、毒素等無法消除而危害患者，而原料藥過高的微生物荷載可能直接挑戰(zhàn)一些滅菌措施的有效性，造成滅菌失敗，使藥品存在更大的安全隱患。所以世界各國藥典均規(guī)定應對原料藥進行微生物檢

20、查，以消除或控制其對藥品引入的微生物污染。 在嚴格執(zhí)行藥品GMP的前提下，國外藥典更為重視原料藥的微生物檢查，尤其是對一些非滅菌制劑，甚至僅僅對原料藥有微生物限度控制要求，而對制劑沒有強制要求。中國藥典2005版參考了國外藥典的這一發(fā)展趨勢，對于化學藥品的片劑、膠囊劑、顆粒劑等6個主要口服制劑在各論和制劑通則中均未做微生物限度檢查的強制要求，僅在附錄中做出通用性要求，但很多企業(yè)不清楚這一變化的背景和兩個必要前提，即嚴格的原料藥微生物控制和嚴格的GMP管理，從而放松了對這些產(chǎn)品的微生物控制，可能會存在潛在風險。 中國藥典規(guī)定，對藥品原輔料藥的微生物檢查參照相應用途的藥品進行，即用于非滅菌制劑生產(chǎn)

21、的原料藥應按相應制劑的微生物限度標準進行微生物限度控制；而用于滅菌制劑的原料藥一般應符合無菌要求?？紤]到生產(chǎn)過程中污染微生物可能發(fā)生的變化，國外企業(yè)通常在生產(chǎn)上自覺執(zhí)行比制劑要求更為嚴格的原料藥微生物。,40,原料藥的微生物標準問題,（1）重視不夠 目前一些企業(yè)對原料藥微生物控制的重要性和意義認識不夠，對源頭上的問題解決不好，加之GMP執(zhí)行流于形式，造成了頻繁的藥品微生物污染事故發(fā)生。 （2）標準依據(jù)不清楚 目前中國藥典絕大多數(shù)藥品原輔料各論項下沒有明確的微生物檢查標準，而是需要根據(jù)實際用途去確定相應的控制標準。 （3）抽樣不正確 原料藥微生物檢查的抽樣除了應參照相應的抽樣原則，還應強調(diào)的一點

22、是抽樣的環(huán)境要求和無菌操作要求，不當?shù)某闃臃椒ú粌H可以使得樣本對總體沒有代表意義、抽取的樣本被污染，甚至可因抽樣而污染原料。 （4）方法不合理 對于原料藥微生物檢查方法驗證應與藥品制劑微生物檢查方法驗證同等重視，否則同樣存在檢驗方法不合理、不科學，檢驗結(jié)果沒有意義的問題。,41,藥材原粉的界定問題,生藥原粉；2010年版一部對動物類原藥材粉作了明確規(guī)定，利于標準的正確理解和執(zhí)行。具體規(guī)定如下： 含動物類原藥材粉的口服中藥制劑要求不得檢出沙門菌。其中的動物類原藥材粉是指除蜂蜜、王漿、動物角、阿膠外的所有動物類原藥材粉，如牡蠣、珍珠等貝類，海蜇等水產(chǎn)品，冬蟲夏草、人工牛黃等。,含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的中成藥制劑標準問題,42,純化水問題,2005版二部P303 2010版二部P412 純化水（Purified Water） 【檢查】微生物限度 取本品，采用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄XI J），細菌、霉菌和酵母菌總數(shù)每1ml不得過100個。 這一標準源于國外，在其需氣菌培養(yǎng)基統(tǒng)一規(guī)定的情況下簡單易行。但我國引入后，造成企業(yè)大量的意見。在藥典現(xiàn)有條件下實際采用2ml實驗，1ml測定細菌數(shù)、1ml測定霉菌和酵母菌數(shù)，再加合起來作為一個檢驗結(jié)果。 主要問題還是培養(yǎng)基和檢驗體系的差異。,43,謝謝大家！,