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1、第七章 放射免疫分析試劑盒的制備,一、概要 二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術(shù) 三、典型放射免疫分析試劑盒的制備 四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展,一、 概要,放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測(cè)量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測(cè)生物體內(nèi)成百上千種活性物質(zhì)，是現(xiàn)代生物、醫(yī)學(xué)和臨床診斷的重要手段。,1 概念與原理,以放射性核素（主要為125I, 57Co, 3H, 14C等）標(biāo)記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經(jīng)過(guò)不同的結(jié)合反應(yīng)（競(jìng)爭(zhēng)或非競(jìng)爭(zhēng)性的），再將結(jié)合和未結(jié)合的標(biāo)記物分開(kāi)，測(cè)量其放射性活度，從而計(jì)算各種生物活性物質(zhì)的含量。,基本原理,抗原(Antig

2、en)：能刺激動(dòng)物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與其發(fā)生特異性反應(yīng)（結(jié)合）的物質(zhì)。一般為異種或異體物質(zhì)（即機(jī)體的免疫活性細(xì)胞從未接觸過(guò)的異物）。 完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨(dú)能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，又能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合生成抗原-抗體復(fù)合物。大多為大分子量的蛋白質(zhì)。 半抗原(Half Antigen, Hapten)：?jiǎn)为?dú)不能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，但能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞起特異性結(jié)合反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物的物質(zhì)。與載體結(jié)合后注入動(dòng)物體內(nèi)能誘導(dǎo)抗體形成，即成為完全抗原。,抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種血

3、清球蛋白，與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。,特異性(Specificity)：抗體抗原反應(yīng)具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合，不能與其它無(wú)關(guān)的抗原（抗體）結(jié)合。,主要的放射免疫分析方法,放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA） 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA） 受體放射性配體結(jié)合分析（Receptor Radio-ligand Bonding Assay, PRLBA） 放射受體分析（Radio-Receptor Assay, RRA）,2 主要的放射標(biāo)記免疫分析方法,1958-1960年由Yalow RS

4、 and Breson SA創(chuàng)建，為最早的放射標(biāo)記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）。 原理：用放射性核素標(biāo)記抗原，標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物（如抗體）上有限的結(jié)合位點(diǎn)。然后將結(jié)合與未結(jié)合的游離抗原分離，測(cè)定其放射性分布，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中待測(cè)物的含量。,1) 放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA）,Ag* +Ag+ Ab Ag*-Ab + Ag-Ab,游離物（F） 復(fù)合物（B）,對(duì)于RIA，應(yīng)滿足以下條件：, 抗原是純一的，只由一種化學(xué)成分組成； 抗體也僅由一種化學(xué)成分組成； 抗原與抗體均為單價(jià)，即一分子抗原只能和一分子抗體反應(yīng)； 標(biāo)記的和未標(biāo)

5、記的抗原具有相同的物理-化學(xué)性質(zhì)； 抗原-抗體反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律； 反應(yīng)達(dá)到平衡； 結(jié)合抗原和未結(jié)合的游離抗原能完全分開(kāi)，且不破壞反應(yīng)平衡； 能準(zhǔn)確測(cè)量結(jié)合抗原和游離抗原之比，或結(jié)合抗原與總抗原之比。,K1,Ag + Ab AgAb k-1,K（親和常數(shù)）= =(AgAb）/ Ag Ab k-1,b/f =（AgAb）/ ( Ag)=K(Ab) b/f=K(AbT-B),K1,放射免疫分析的Scatchard圖,2) 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA）,在RIA基礎(chǔ)上建立起來(lái)的標(biāo)記免疫分析方法。 原理：用放射性核素標(biāo)記抗體，以過(guò)量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)

6、合建立的方法.,免疫放射量度分析原理示意圖,IRMA劑量反映曲線,RIA反映曲線,RIA與IRMA反應(yīng)式比較,RIA與IRMA的工作原理主要區(qū)別,3 放射標(biāo)記免疫分析方法的特點(diǎn),二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù),（一）標(biāo)記物的制備技術(shù),可用于放射免疫分析的放射性核素,Bolton-Hunter（BH）方法 其它間接標(biāo)記法,1 125I的標(biāo)記,2 標(biāo)記物的分離純化,3 標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定,4 標(biāo)記物的穩(wěn)定性及貯存條件,多肽類(lèi)標(biāo)記物通常采用冷凍干燥方法貯存; 小分子化合物及單抗標(biāo)記物可以液體狀態(tài)貯存; 標(biāo)記物通常在2-8條件下保存，有效期約周。,（二）抗原和抗體的制備技術(shù),免疫原（抗原）的制

7、備,免疫原的制備,采用生化技術(shù)提取(人體器官或體液） 采用偶聯(lián)技術(shù)制備,2 抗體制備, 動(dòng)物種屬選擇, 免疫增強(qiáng)劑,凡可增強(qiáng)被免疫動(dòng)物免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)均可稱(chēng)為免疫增強(qiáng)劑， 其種類(lèi)眾多。, 免疫,抗血清的質(zhì)量鑒定,抗體貯存,抗血清加入0.1%-0.2%防腐劑，按需要量分裝、凍干，-50貯存。,（三）單克隆抗體的制備,1975年由Kohler和Milsten采用雜交瘤技術(shù)第一次獲得。 基本原理：利用動(dòng)物脾細(xì)胞即淋巴細(xì)胞可以分泌特異抗體，而骨髓瘤能夠在體外連續(xù)培養(yǎng)的性質(zhì)，將兩種細(xì)胞在融合劑（通常為PEG）的作用下進(jìn)行融合，獲得既可分泌特異抗體又可在體外連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞。因此，這種雜交瘤細(xì)胞

8、就能在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生大量單一類(lèi)型的高純度抗體。,單克隆抗體是僅由一種類(lèi)型的細(xì)胞制造出來(lái)的抗體，對(duì)應(yīng)于多克隆抗體/多株抗體由多種類(lèi)型的細(xì)胞制造出來(lái)的一種抗體。,制備過(guò)程,與多克隆抗體比較,（四）分離劑,分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部分進(jìn)行有效的分離，直接影響RIA測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。,（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備,1 標(biāo)準(zhǔn)品,2 參考血清,一般含一個(gè)或幾個(gè)分析物，是免疫分析中用來(lái)比較和評(píng)價(jià)不同測(cè)定系統(tǒng)的偏倚和重復(fù)性的血清，也是用于內(nèi)部或外部質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要試劑。,（六）數(shù)據(jù)處理與分析方法的有效性評(píng)估,三、幾種典型放射免疫分析試劑盒的制備,（一）甲狀腺素放射免疫分析試劑盒的制備,（二）游離

9、甲狀腺素FT4試劑盒的制備,（三）人血清促甲狀腺激素免疫放射分析試劑盒的制備,四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展,國(guó)際市場(chǎng) 市場(chǎng)規(guī)模接近300億美元，近期每年增長(zhǎng)率在7-9%左右。,特點(diǎn) 檢測(cè)品種多，達(dá)近千種，并且還在持續(xù)增加； 同一公司有多個(gè)產(chǎn)品技術(shù)平臺(tái)； 多種免疫分析方法并存，相互競(jìng)爭(zhēng)，相互補(bǔ)充； 大公司產(chǎn)品系列全，小公司產(chǎn)品有特色； 高度集成、自動(dòng)化的儀器診斷與簡(jiǎn)單、快速便于普及的快速診斷。,國(guó) 內(nèi) 200余廠家； 北京北方生物技術(shù)研究所 濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司 北京科美東雅生物技術(shù)有限公司 原子高科股份有限公司 100余種系列產(chǎn)品； 市場(chǎng)規(guī)模40億元（國(guó)內(nèi)與國(guó)外各占一半）； 年增長(zhǎng)率10-16%；,面臨的挑戰(zhàn), 酶免疫分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 時(shí)間分辨熒光免疫分析 (Time-resolved Fluoroimmunoassay, TRF) 化學(xué)發(fā)光免疫分析 (Chemiluminesent immunoassay, CLIA）,放射免疫分析和非放射免疫分析技術(shù)性能比較,傳統(tǒng)的RIA使用市場(chǎng)可能會(huì)逐漸縮??！,預(yù)計(jì)在未來(lái)十年中，體外診斷技術(shù)將會(huì)快速發(fā)展，并出現(xiàn)放免、酶免、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光以及金標(biāo)試紙條、生物芯片等多種體外診斷試劑優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，各自在不同領(lǐng)域廣泛應(yīng)用共存，國(guó)內(nèi)和國(guó)外廠家紛爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)局面。,