《PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒.ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒.ppt（19頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、實(shí)驗(yàn)三：PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒,乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發(fā)病率很高 ，HBV的檢測(cè)極其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動(dòng)機(jī) 。,PCR技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理 2.熟悉PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒的基本操作過程。,二、實(shí)驗(yàn)原理 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction) 簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對(duì)引物間的特

2、異性DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)基本過程：,1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?2.退火：急速降溫使引物和互補(bǔ)模板 在局部形成雜交鏈 3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物為起始點(diǎn)的 延伸反應(yīng),模板DNA,高溫變性,低溫退火,引物,適溫延伸,經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增2n倍,兩條子代DNA,一 次 循 環(huán),Tap酶,5,3,3,5,3,5,5,3,5,3,三、主要器材及試劑 1.主要器材：,9700型PCR儀,電泳槽、電泳儀,紫外分析儀,臺(tái)式高速離心機(jī),2.主要試劑：,四、操作步驟 1.標(biāo)本處理：取患者血清40l，加入DNA提取液40l，沸水浴10分鐘，1

3、0000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4l做PCR反應(yīng)。,2.加樣： 加入提取好的標(biāo)本4l，6000轉(zhuǎn)離心10秒。,三個(gè)擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間,循環(huán)次數(shù)：25次,3.PCR儀上擴(kuò)增：,PCR儀上擴(kuò)增,加入標(biāo)本,離心,6000轉(zhuǎn)離心10秒,4.電泳檢測(cè)： 制備2%瓊脂糖凝膠,2%瓊脂糖的制備：,電泳槽的準(zhǔn)備：,稱取 0.8g瓊 脂糖,40mlTBE 電泳緩沖液 （PH8.0) 煮沸溶解,加入,冷卻,60左右,加入 溴乙啶 EB20l,倒膠,加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物10 ul點(diǎn)樣于凝膠孔,取樣,點(diǎn)樣,電泳：點(diǎn)樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。 五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性,HBV陽性,HBV陰性,HBV陽性對(duì)照,HBV陰性對(duì)照,正極,負(fù)極,點(diǎn)樣孔,五、注意事項(xiàng) 1. 試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)本及DNA提取液使用前需充分融化離心。 2. 反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反應(yīng)管底部吸液。 3. EB為強(qiáng)致癌物，操作過程應(yīng)注意防護(hù)。 4. 注意無菌操作，以免出現(xiàn)假陽性。,Thank you!,