《實驗八不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《實驗八不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（35頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、實驗八：不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,賈躍騰 羅世翔,實驗八：不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,賈躍騰 羅世翔,一、 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 實驗操作及注意事項 （P138）,實驗分組（每人做一管，每組配一份膠） 認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用） 封管 分離膠配制與灌膠（濃度為6%，化學聚合，A1C2H2G5，每組總體積為10ml，灌膠高度為7-8cm） 封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出現折光線時可進行下一步操作）,1.1 分離膠的配制,注意事項： 1、封管要嚴，防止漏液。 2、固定玻璃管要豎直，防止夾碎。 3、每組配一份膠，試劑與移液管對號，準確加量。 4、配膠后立即灌膠（用滴管灌膠

2、，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁緩緩加入,濃縮膠配制（濃度為3%，光聚合，B1D2E1F4，每組總體積為8ml） 倒掉正丁醇 灌濃縮膠（灌膠高度為1.5cm,上面留1cm空隙加樣） 封正丁醇3mm（觀察界面，10分鐘左右出現折光線時可倒去正丁醇）,1.2 濃縮膠的配制,注意事項： 1、倒掉正丁醇，用濾紙吸干再灌濃縮膠。 2、配膠后立即灌膠（用滴管） 3、灌膠后立即清洗滴管，防止膠凝固于管中。 4、撕掉封口膜，用膠塞將玻璃管固定于電泳槽上（豎直，防漏） 5、加電極緩沖液（注意液面）,安裝電泳槽（結構、原理、電流及電極的方向、不漏水、除氣泡）加buffer（沒過上下管口）樣品處理并加樣（20ul

3、）電泳（6mA/管，距底1cm時停止）剝膠 固定（時間5min）染色（時間2min）漂洗脫色至背景透亮,1.3 安裝、加樣、電泳,二、電泳基本原理及相關知識,2.1 電泳的概念,帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質中向與其電荷性質相反的電極方向定向泳動的現象。 廣泛應用于生物大分子的分離和鑒定.,2.2 電泳的基本原理,利用物質的兩個差異來分離物質,1.電荷差異 (1)電荷性質 (2)電荷數量,2.分子差異 (1)分子大小 (2)分子形狀,2.3 電泳分離蛋白質的原理,蛋白質兩性解離與等電點 若向蛋白質溶液中加入適量的酸或堿，使羧基和氨基的解離度相同，此時溶液的 pH 值稱為

4、該蛋白質的等電點（PI）。 2. 溶液pH與蛋白質等電點決定蛋白質電荷性質與數量 3. 不同蛋白質分子大小和分子形狀的差異,2.4 實驗室中常用到的電泳方法 （以介質分類）,1. 紙電泳：是最早使用的一種電泳技術，濾紙為支持物 2. 醋酸纖維膜電泳：醋酸纖維膜為其支持物 3. 凝膠電泳 （1）瓊脂糖凝膠電泳 （2）聚丙烯酰胺凝膠電泳,三、聚丙烯酰胺凝膠電泳,3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。 1、聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲基雙丙烯酰胺聚合

5、而形成的三維網狀結構，聚合過程由自由基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。 (1)在化學聚合過程中，以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑, TEMED催化AP產生自由基； (2)在光聚合過程中，以核黃素為催化劑，光催化核黃素產生自由基。自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲基雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲基鍵交聯(lián)，從而形成三維網狀結構。,3.2 聚丙烯酰胺凝膠的特性 (1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好； (2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶； (3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4)幾乎無吸附和電滲作用，只

6、要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好； (5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g (6)凝膠孔徑可調節(jié)，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑； (7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類 1. 根據其有無濃縮效應，分為： （1）連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應 （2）不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒

7、在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 2. 根據蛋白質樣品變性與否，分為： （1）變性電泳也就是SDS-PAGE，蛋白質失去二三級結構； （2）非變性電泳 蛋白質能夠保持完整狀態(tài)，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。 3.根據電泳槽體系的類型，分為： （1）圓盤電泳 （2）板狀電泳 兩者電泳原理完全相同。,四、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）,SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離

8、子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀湓碓谟冢?1.去電荷：由于SDS（十二烷基硫酸鈉）產生的十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質-SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別； 2.破壞結構：SDS能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶； 3.統(tǒng)一構象：SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改變，蛋白質-SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SD

9、S復合物的短軸長度都一樣，約為18A； 這樣的蛋白質-SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原來的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小。,SDS-PAGE的原理,四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,4.1 不連續(xù)PAGE的原理,三個不連續(xù) 三個效應,凝膠孔徑不同 緩沖液pH不同 緩沖液離子成分不同,濃縮效應 電荷效應 分子篩效應,4.2 不連續(xù)體系的組份 不連續(xù)體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。 1. 濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。 2. 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。 3. 電極緩沖液是

10、pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。 2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。,4.3 樣品濃縮效應 1.凝膠孔徑不連續(xù)性； 2.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性； 在pH6.7的凝膠緩沖體系中 前導離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度) 當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質； 3.電位梯度的不連續(xù)性。,Gly

11、 -,Pro -,Cl-,Gly -,Pro -,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro -,Pro -,Pro -,Gly -,Gly -,Gly -,pH為8.3的電泳緩沖液（Tris-Gly）,pH為6.7的濃縮膠,pH為8.9的分離膠,有效泳動率： MCl- M Pro- M Gly-,6%膠,3%膠,有效泳動率： MCl- M Gly- M Pro-,五、實驗結果的分析,5.1 相關理論,表-1 血清中各蛋白質的相關特性,種 類,分子量(萬）,PI,分 布(%),清蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,6.9,5.0,9.0,13.0,11.0,6.1,7.3,6.8,7.6,8.0,55,2.130.8,4.172.5,1.225,15.6,前清蛋白,清蛋白,2-球蛋白 1-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,5.2 結果示意圖,謝謝！,