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1、課題 1.2基因工程的基本操作程序 學(xué)習(xí)目標(biāo):簡述基因工程的原理和技術(shù). 理解基因操作的工具和基本程序及應(yīng)用。 學(xué)習(xí)重點(diǎn)和難點(diǎn)： 重點(diǎn)：提取目的基因的方法。 難點(diǎn)：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的途徑。 自學(xué)測(cè)評(píng)： 基因工程的基本操作程序主要包括4個(gè)步驟：①目的基因的— ② 的構(gòu)建； ③ 將目的基因 ④ 目的基因的 。 一、 目的基因的獲?。? 1、 目的基因:符合人們需要的，編碼蛋白質(zhì)的 。 2. 獲取目的基因的方法 （1） 從基因文庫中獲取目的基因 ① 基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多 ，導(dǎo)人受體菌的群體中—,各 個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫.

2、'基因組文庫：含有一種生物的 基因 ② 種類 （CDNA文庫：含有一種生物的 基因 ③ 目的基因的獲取 根據(jù)基因的有關(guān)信息：基因的 序列、基因在 上的位置、基因的— 產(chǎn)物mRNA、基因的， 產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性獲取目的基因。 （2） 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 ① PCR：是一項(xiàng)在生物體外 特定DNA片段的核酸合成技術(shù). ② 過程：目的基因DNA受熱形成 ，與 結(jié)合,然后在 的作用下進(jìn)行延 伸形成DNA. ③ 方式：指數(shù)擴(kuò)增= （n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)） （3）化學(xué)方法人工合成:基因較 ，核苷酸序列 。 二、 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1、 表達(dá)載體的組成：目的基因+ + +標(biāo)記

3、基因+ 。 2、 啟動(dòng)子：位于基因的 ，它是 結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)生mRNA。 3、 終止子：位于基因的 ，終 。 4、 標(biāo)記基因： 受體細(xì)胞是否含有目的基因. 5、 表達(dá)載體的功能：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并 給下一代;使目的 基因 —和發(fā)揮作用。 6、 不同的受體細(xì)胞及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法 ，基因表達(dá)載體的構(gòu)建上也會(huì)有 所差別. 三、 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)人受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和 的過程。 （二）方法 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 ① 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染 植物和裸子植物，對(duì) 植物

4、沒有感染力; Ti質(zhì)粒的 可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。 ② 轉(zhuǎn)化：目的基因插人 進(jìn)入〉農(nóng)桿菌一導(dǎo)入植物細(xì)胞一目的基因 整合到植物細(xì)胞染色體上一目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá) (2) 基因槍法： 植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。 (3) 花粉管通道法 2. 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 (1) 方法: 。 (2) 操作程序：目的基因表達(dá)載體 一取 一顯微注射一注射了目的基 因的受精卵移植到 性動(dòng)物的 內(nèi)發(fā)育一新性狀動(dòng)物。 3. 將目的基因?qū)宋⑸锛?xì)胞 (1) 原核生物特點(diǎn):繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等. (2) 轉(zhuǎn)化： 處理細(xì)

5、胞一 細(xì)胞一表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合一— 細(xì)胞吸收DNA分子。 合作探究、精講點(diǎn)撥： 某生物體內(nèi)全部DMA 栗種生物呆個(gè)時(shí)期的mRNA 探究一目的基因的獲取 ]限制酶 1反轉(zhuǎn)錄 1、基因文庫 ? 許參DMA片段 eDNA 勺運(yùn)載體連接 [hl運(yùn)栽體連接 1導(dǎo)入 J■導(dǎo)入 文庫 文庫 2.原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) (1)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定 類型 步驟 檢測(cè)內(nèi)容 方法 結(jié)果顯示 水 平檢測(cè) 第一步 目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞 是否成功顯示出雜交帶 第二步 目的基因是否轉(zhuǎn)

6、錄出mRNA 是否成功顯示出雜交帶 第三步 目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 是否成功顯示出雜交帶 水平鑒定 ——非編碼區(qū)——； 編碼區(qū) 非編碼區(qū)- 與RNA糜含酸 ； 結(jié)合位點(diǎn) ； (2)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 編瑪區(qū) 非編碼區(qū)? 11 ii ^RNA聚合酹 結(jié)合位點(diǎn) /卜顯子\處顯子/艸顯子J : '內(nèi)含子‘ : 3. PCR技術(shù) 原理： 前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序

7、列合 條件： 過程： a.變性（ b退火（ °C）：目的基因DNA受熱變性后接連為單鏈 C): 與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合 C.延伸（ C):在 的作用下進(jìn)行延伸 Taq酶的特點(diǎn)是 PCR擴(kuò)增技術(shù)與DNA復(fù)制的比較 PCR技術(shù) DNA復(fù)制 相同點(diǎn) 原理 DNA復(fù)制（堿基互補(bǔ)配對(duì)） 不 同 占 八、、 解旋方式 DNA在 條件下變性解旋 催化 場(chǎng)所 復(fù)制（PCR擴(kuò)增儀） 主要在 內(nèi) 酶 酶 細(xì)胞內(nèi)含有的 能量 結(jié)果 在短時(shí)間內(nèi)形成大量的 形成整個(gè) 探究二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1 ■1 1

8、卜 m jj ■ ii li i 1?? 1 I爪彈逢農(nóng)瞬 用一定的 切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出 。用 切斷目的基因，使其產(chǎn) 生 。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的 處，再加入適量 ，形成了一個(gè) 重組DNA分子（重組質(zhì)粒） 探究三目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——轉(zhuǎn)化 細(xì)胞類型 常用方法 轉(zhuǎn)化過程 植物細(xì)胞 將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上一轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌一導(dǎo)入植物細(xì)胞一 整合到受體細(xì)胞的DNA上一表達(dá) 動(dòng)物細(xì)胞 將含有目的基因的表達(dá)載體提純一取卵（受精卵）一顯微注射一早期 胚胎培養(yǎng)一胚胎移植一發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物 微生物 用Ca2處理細(xì)胞一感

9、受態(tài)細(xì)胞一重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì) 胞混合一感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 探究四目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢査是否成功 問題1： 受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎? 問題2.試分析真核生物的基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞后，不能正常發(fā)揮功效的可能原因有哪些? 拓展提高、達(dá)標(biāo)測(cè)評(píng)： 1．下列正確表示基因操作“四部曲"的是 （ ） A. 提取目的基因一目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞一基因表達(dá)載體的構(gòu)建一目的基因的檢測(cè)和鑒定 B. 目的基因的檢測(cè)和鑒定一提取目的基因一基因表達(dá)載體的構(gòu)建一目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 C. 提取目的基因一基因表達(dá)載體的構(gòu)建一目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞一目的基因的檢測(cè)

10、和鑒定 D. 基因表達(dá)載體的構(gòu)建一提取目的基因一目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞一目的基因的檢測(cè)和鑒定 2. 下列不.屬.于.獲得目的基因的方法的是 （ ） A. 利用DNA連接酶復(fù)制目的基因 B.利用DNA聚合酶復(fù)制目的基因 C.從基因文庫中獲取目的基因 D.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 3. PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA，需要的條件是 （ ） ①目的基因②高溫③四種脫氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖體 A. ①②③④ B.②③④⑤ C.①③④⑤ D.①②③⑥ 4. 根據(jù)mRNA的信息推出獲取目的基因的方法是 （） A. 用DNA探針測(cè)出目的基因 B.用mRNA探針測(cè)出目的基因 C.

11、用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成目的基因 D.用PCR技術(shù)擴(kuò)增mRNA 5. 在已知某小片段基因堿基序列的情況下,獲得該基因的最佳方法是 （ ） A. 用mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA B. 以4種脫氧核苷酸為原料人工合成 C. 由蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測(cè)mRNA D. 將供體DNA片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，再進(jìn)一步篩選 6. 在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是 460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是 （ ） A. 540 個(gè) B.8100 個(gè) Co 17280 個(gè) D。7560 個(gè) 7. 下列不.屬.于.

12、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合過程的是 （ ） A. 用一定的限制酶切割質(zhì)粒露出黏性末端 B. 用同種限制酶切割目的基因露出黏性末端 C. 將切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒切口處 D. 將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增 8. 下列哪項(xiàng)不.是.基因表達(dá)載體的組成成分 （ ） A.啟動(dòng)子 B.終止密碼子 C.標(biāo)記基因 D.復(fù)制原點(diǎn) 9o 在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，所需要的酶是 （ ） ①限制酶 ②DNA連接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶 A.①② B.①②③ C.①②④ D.①②③④ 10. 植物學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，對(duì)目的基因作適當(dāng)修飾，使目的基因在棉花植株的整個(gè)生長 發(fā)育期都表達(dá)，以防

13、止害蟲侵害，這種對(duì)目的基因所作的修飾發(fā)生在（ ） A.終止子 B.引物 C.標(biāo)記基因 D.啟動(dòng)子 11. 下列哪項(xiàng)不.是.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 （ ） A.基因槍法 B.顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D.花粉管通道法 12. 在基因工程操作的基本步驟中，不.進(jìn).行.堿基互補(bǔ)配對(duì)的是 （ ） A.人工合成目的基因 B. 目的基因與載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)與鑒定 13. 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞之前，要用Ca2處理細(xì)胞，處理過的細(xì)胞叫（ ） A.感受態(tài)細(xì)胞 B.敏感性細(xì)胞 C.吸收性細(xì)胞 D.接受細(xì)胞 14?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)移目的基因進(jìn)入受體

14、細(xì)胞，目的基因的最終位置是 （ ） A. Ti質(zhì)粒上 B.受體細(xì)胞染色體上 C.裸露細(xì)胞核中 D.存在細(xì)胞質(zhì)中 15. 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測(cè) 才能知道。下列屬于目的基因檢測(cè)和鑒定的是 （ ） ①檢測(cè)受體細(xì)胞是否有目的基因 ②檢測(cè)受體細(xì)胞是否有致病基因 ③ 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄mRNA ④檢測(cè)目的基因是否翻譯蛋白質(zhì) A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④ 16. 要檢測(cè)目的基因是否成功地插入了受體 DNA中，需要用基因探針，基因探針是指 （ ） A. 用于檢測(cè)疾病的醫(yī)療器械 B. 用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的

15、目的基因 C. 合成B-球蛋白的DNA D. 合成苯丙羥化酶的DNA片段 17. （多選）用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述正確的是（） A. 常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒 B. DNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必須的工具酶 C. 可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒 D. 導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá) 18. （多選）我國科學(xué)家運(yùn)用基因工程技術(shù)將蘇云金芽抱桿菌的抗蟲基因?qū)朊藁?xì)胞并成 功表達(dá)，培育出了抗蟲棉。下列敘述正確的是 （ ） A. 基因非編碼區(qū)對(duì)于抗蟲基因在棉花細(xì)胞中的表達(dá)不可缺少 B. 重組D

16、NA分子中增加一個(gè)堿基對(duì)，可能導(dǎo)致毒蛋白的毒性喪失 C. 抗蟲棉的抗蟲基因可通過花粉傳遞至近緣作物，從而造成基因污染 D. 轉(zhuǎn)基因棉花是否具有抗蟲特性是可以通過檢測(cè)棉花對(duì)抗生素抗性來確定的 19. （多選）科學(xué)家通過基因工程的方法，能使馬鈴薯塊莖內(nèi)含有人奶主要蛋白。以下有關(guān) 該基因工程的敘述，正確的是 （ ） A. 采用反轉(zhuǎn)錄的方法得到目的基因有內(nèi)含子 B. 基因非編碼區(qū)對(duì)于目的基因在塊莖中表達(dá)是不可缺少的 C. 馬鈴薯的葉肉細(xì)胞可作為受體細(xì)胞 D. 用同一種限制性內(nèi)切酶分別處理質(zhì)粒和含目的基因的DNA，可產(chǎn)生黏性末端而形成重 組DNA分子 20. 人體受到病毒刺激后可以產(chǎn)生

17、干擾素干擾素分為a.B. Y三類。1980年生物學(xué)家成 功地破譯了a干擾素的全部遺傳信息。并運(yùn)用插入質(zhì)粒的方法。用大腸桿菌生產(chǎn).得到的干 擾素可以用于治療肝炎和腫瘤?回答下列問題： （1） 上述材料中涉及到的現(xiàn)代生物技術(shù)有 。 （2） 人體中能合成干擾素的細(xì)胞 ,合成的場(chǎng)所是細(xì)胞中的 。 （3） 在利用大腸桿菌生產(chǎn)干擾素過程中，目的基因 ，所用的運(yùn)載體是 （4） 目的基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)必須經(jīng) 和 過程。 21. 資料顯示，近十年來，PCR技術(shù)(DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù))成為分子生物實(shí)驗(yàn)的一種 常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制的特性,在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如下圖)

18、， 在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使分子生物實(shí)驗(yàn)所需的遺傳物質(zhì)不再 受限于活的生物體。請(qǐng)據(jù)圖回答： 謡討|棊門一門一開 D砒單鏈 引物DNA單鏈與 游離脫氧核 2條完幕的 模板通過堿基互 昔酸注按到雙鏈D魁分子 祁配對(duì)結(jié)合 DHA單璉上 (1)加熱至94°C的目的是使DNA樣品中的 鍵斷裂，該過程在生物體細(xì)胞內(nèi)是通過 酶的作用完成的。分析可知新合成DNA分子中A=T，C=G，這說明DNA分子的合 成遵循 。 (2) 與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比,PCR技術(shù)所需要的DNA聚合酶的最適溫度比較 (高、低)。 (3) 通過PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制時(shí)，若將一

19、個(gè)用15N標(biāo)記的模板DNA分子(第一代) 放入試管中，以頑標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制到第五代時(shí)，含咽標(biāo)記的DNA分子 單鏈數(shù)占全部DNA總單鏈數(shù)的比例為 。 (4) PCR技術(shù)不僅為遺傳病的診斷帶來了便利，而且改進(jìn)了檢測(cè)細(xì)菌和病毒的方法。若要檢 測(cè)一個(gè)人是否感染了艾滋病病毒，你認(rèn)為可以用PCR擴(kuò)增血液中的( ) A.白細(xì)胞DNA B.病毒蛋白質(zhì) C.血漿抗體 D.病毒核酸 加｛羊囚 22. 下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，請(qǐng)回答下列問題： Fomll 1 Hind IU 1 Smu I 說別庫貿(mào)尺 切割碰點(diǎn) C*GATCC CCTAG^G A^A

20、GCTT TTCGA^l ATTC CT TAA^C} CCCXiGG 林 LINA (1) 一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒經(jīng)Sma I切割前后，分別含有 個(gè)游離的磷酸基團(tuán). (2)若對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Sma I酶切位點(diǎn)越多，其熱穩(wěn)定性越 。 (3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaI切割，原因 (4) 與只使用EcoR I相比較，使用BamH I和Hind III兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA 的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止 。 (5) 為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加 酶。 (6) 重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 。 (7) 為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的 大腸桿菌突變體，然后在 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因 表達(dá)的初步檢測(cè)。