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1、第三節(jié) 原位雜交組織化學(xué)標(biāo)本的制備 一、取材 用于原位雜交反應(yīng)的組織應(yīng)盡可能新鮮，這就要求取材迅速。由于很多RNA極易降解，因此取得的組織應(yīng)盡可能迅速固定或冷凍。為了避免外援性RNA酶引起靶組織中RNA的丟失，取材時(shí)應(yīng)戴手套，所用的器械、容器都要經(jīng)高壓消毒，或清潔后用經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的滅菌蒸餾水清洗。此外，要避免用含RNA酶很豐富的手直接接觸組織、器械、容器和溶液等。,二、 固定 在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個(gè)方面，即保持良好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平及使探針易于進(jìn)入細(xì)胞。,（一）固定劑 化學(xué)固定劑有沉淀固定劑和交聯(lián)固定劑兩類。常用

2、的沉淀固定劑有乙醇和丙酮等，經(jīng)用沉淀固定劑固定的組織通透性較好，利于探針穿入組織。但沉淀固定劑可能引起RNA的丟失，而且組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)保存也不十分理想。,交聯(lián)固定劑有多聚甲醛、戊二醛等。醛類交聯(lián)固定劑可較好地保存組織中的RNA，對(duì)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的保存也優(yōu)于沉淀固定劑。但由于戊二醛這樣的強(qiáng)交聯(lián)固定劑固定后的組織通透性很低，探針較難進(jìn)入其中。一般認(rèn)為，4多聚甲醛對(duì)檢測(cè)mRNA的組織固定較為理想，它既能有效地保存靶組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，又可使組織具有一定的通透性。,（二）固定方法 先行灌注固定，然后取材并將取下的組織浸入固定液中再行浸漬固定。經(jīng)固定和漂洗后的組織也可在15蔗糖磷酸緩沖液中于40C下保存12

3、個(gè)月。新鮮組織也可以在取材后直接以液氮或干冰速凍，冰凍切片后再浸入4多聚甲醛固定1030分鐘，干燥后立即進(jìn)行雜交或保存在-700C冰箱內(nèi)。如果冰箱溫度恒定，可保存數(shù)月之久。,三、 切片 在原位雜交中，以冰凍切片最常用。在切片時(shí)，要盡量避免RNA酶污染，操作時(shí)要戴手套，用70酒精或10SDS擦洗工作臺(tái)、切片機(jī)刀架、搖柄和載物臺(tái)等手常接觸的部位以及其它器械。切片厚度可根據(jù)具體情況而定。如靶組織中待測(cè)mRNA的量較少，所采用的原位雜交技術(shù)敏感性較低，為了能得到較多的信號(hào)，切片可厚些（約1520m），反之，則可薄一些（約510m）。,如果細(xì)胞直接生長(zhǎng)在載玻片或蓋玻片上，則可將長(zhǎng)有細(xì)胞的載玻片或蓋玻片直

4、接固定，再按上述方法漂洗、干燥、儲(chǔ)存。,第四節(jié) 雜交前處理 雜交前處理主要包括增強(qiáng)組織的通透性、減低背景染色兩個(gè)方面。 一、增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的通透性 增強(qiáng)組織通透性常用去污劑或某些消化酶處理，通過(guò)這種處理，可廣泛地去除蛋白質(zhì)而增強(qiáng)組織的通透性和探針的穿透性。,常用的去污劑是Triton-X100，一般都將切片浸入含0.20.5% Triton X-100的PBS內(nèi)15min 。 蛋白酶K的消化作用在原位雜交中十分重要。 蛋白酶K還具有消化包圍靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。,二、 減低背景染色 （一）酸酐和稀酸處理 稀酸處理能使堿性蛋白變性，如再結(jié)合蛋白酶消化，

5、即可將堿性蛋白移除，這樣不僅能增強(qiáng)靶核酸探針的可及性，也可避免堿性蛋白與核酸之間的非特異性結(jié)合，達(dá)到解降低背景的目的。,（二）預(yù)雜交 以阻斷標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景染色的目的。 （三）內(nèi)源性生物素和酶的抑制 組織中內(nèi)源性生物素、過(guò)氧化物酶或AKP則應(yīng)事先阻斷。 標(biāo)本可用不標(biāo)記的卵白素生物素孵育，以阻斷內(nèi)源性生物素。,適宜的雜交前蛋白酶消化有利于消除內(nèi)源性生物素的干擾。 用5脫脂奶粉緩沖鹽液來(lái)稀釋標(biāo)記的卵白素以及將標(biāo)記標(biāo)本浸于含2牛血清白蛋白的緩沖液，均可防止或抑制標(biāo)記的卵白素與組織標(biāo)本之間的非特異性結(jié)合。,第五節(jié)雜交反應(yīng) 雜交液的成分與預(yù)雜交液基本相同，所不同的

6、是加入了標(biāo)記的核酸探針。雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)。,一、 雙鏈DNA探針和靶DNA變性 進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)，探針與靶核酸都必須是單鏈。 探針和靶核酸一旦變性，要馬上進(jìn)行雜交反應(yīng)，否則，解鏈的核酸又會(huì)重新復(fù)性。 如果用單鏈探針檢測(cè)靶RNA，一般不需變性。,微波爐處理不僅能使雙鏈的探針和靶核酸有效地變性，而且還能使雜交信號(hào)增加。 二、雜交液 雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外，還含有較高濃度的鹽、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA和RNA等。 Na+可使雜交率增加，還可減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。,甲酰胺可使Tm值降低； 硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高

7、探針有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的。 牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。,三、探針的長(zhǎng)度 探針的最佳長(zhǎng)度應(yīng)在30100堿基之間。探針短，易于進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。 四、探針的濃度 探針的濃度遠(yuǎn)比組織中靶核酸的濃度要高。一般為0.55.0g/ml，通常建議放射性同位素探針濃度為0.5g/ml，非放射性探針為2g/ml。,過(guò)量的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，反而導(dǎo)致高背景染色等不良反應(yīng)。 五、雜交溫度和時(shí)間 雜交溫度應(yīng)低于雜交體的融解或解鏈溫度（Tm）2030,大約在3060之間,因?yàn)樵谶@一溫度條件下進(jìn)行雜交反應(yīng),雜交率最高

8、。一般常用的雜交溫度為42左右。,雜交反應(yīng)的時(shí)間可能隨探針濃度的增加而縮短,但在一個(gè)相當(dāng)大的濃度范圍內(nèi),雜交反應(yīng) 6h內(nèi)完成。在實(shí)際操作中,一般把雜交時(shí)間定為1620h,或?yàn)榱斯ぷ鞣奖?將雜交液和標(biāo)本孵育過(guò)夜。然而,雜交時(shí)間不要超過(guò)24 h,反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),形成的雜交體會(huì)解鏈,雜交信號(hào)會(huì)減弱。,六、雜交嚴(yán)格度(hybridization stringercy) 錯(cuò)配對(duì)雜交體的穩(wěn)定性較完全配對(duì)的雜交體的穩(wěn)定性差。 影響嚴(yán)格度的因素有甲酰胺的濃度、雜交溫度和高離子強(qiáng)度，因此可通過(guò)控制這些因素來(lái)減少非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。在低甲酰胺濃度、高離子強(qiáng)度和低雜交溫度條件下，嚴(yán)格度低，反之嚴(yán)

9、格度就高。,嚴(yán)格度越高，雜交反應(yīng)的特異性越強(qiáng)，但敏感性越低；反之，特異性越差，而敏感性越高。 在雜交時(shí)，將雜交液滴于組織切片上后，應(yīng)加蓋硅化的蓋玻片，防止孵育過(guò)程的高溫導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)，必要時(shí)可在蓋玻片四周加橡皮泥封固蓋玻片。,第六節(jié) 雜交后處理 雜交后處理的目的是除去未參與雜交體形成的過(guò)剩探針，除去探針與組織標(biāo)本之間的非特異性結(jié)合，包括與那些與靶核酸相似的序列與探針之間形成的含非互補(bǔ)堿基對(duì)的雜交體，從而減低背景。,雜交后處理主要包括系列不同濃度、不同溫度的鹽溶液的漂洗。 洗滌的條件（鹽濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間）因核酸探針的類型和標(biāo)記物的不同而略有差異，一般是鹽濃度由高到低而溫度由低到

10、高。高濃度的鹽可減少探針與組織標(biāo)本之間靜電結(jié)合，洗滌過(guò)程中至少有一次高嚴(yán)格度條件（低鹽、高溫、高甲酰胺）下的漂洗。 漂洗過(guò)程中，還必須注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合。,第七節(jié)顯示 顯示又稱檢測(cè)，是指通過(guò)一定方法使雜交反應(yīng)形成的雜交體（雜交信號(hào)）成為顯微鏡下肉眼可看見(jiàn)、識(shí)別的產(chǎn)物。對(duì)原位雜交反應(yīng)的信號(hào)進(jìn)行顯示的方法因探針的標(biāo)記物不同而已。,一、放射性同位素標(biāo)記探針的顯示 用32P、125I、35S等放射性同位素來(lái)標(biāo)記探針，用放射自顯影技術(shù)檢測(cè)雜交信號(hào)。 放射自顯影是利用感光乳膠記錄被研究材料中放射性物質(zhì)分布和定位的方法。在原位雜交中，放射自顯影

11、術(shù)的基本過(guò)程包括：組織切片中結(jié)合在探針上的放射性同位素以某種射線使感光乳膠曝光后先形成潛影，再經(jīng)顯影、定影和水洗等程序后獲得影像。,二、非放射性標(biāo)記探針的顯示 如果用辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記探針，原位雜交信號(hào)可用相應(yīng)底物的酶促反應(yīng)來(lái)顯示。 以地高辛標(biāo)記的探針在進(jìn)行原位雜交反應(yīng)后，可根據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)原理，用結(jié)合有酶（如HRP或AKP）或熒光素的羊抗地高辛抗體與標(biāo)記在探針上的地高辛進(jìn)行免疫反應(yīng)，再用相應(yīng)底物顯示酶促反應(yīng)或以熒光顯微鏡產(chǎn)生熒光間接顯示雜交體。,第八節(jié)對(duì)照試驗(yàn) 一般應(yīng)在下述幾種對(duì)照試驗(yàn)中選擇34種以證實(shí)雜交結(jié)果的可靠性。 一、 組織對(duì)照 （一）Southern或Northern印

12、跡反應(yīng),（二）免疫組織化學(xué) 如果能獲得靶基因產(chǎn)物的抗體，可結(jié)合免疫組織化學(xué)和原位雜交，從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明蛋白質(zhì)（或多肽）和相應(yīng)的mRNA共存于同一細(xì)胞中。,二、探針對(duì)照 （一）已知陽(yáng)性組織和已知陰性組織對(duì)照 陽(yáng)性組織和已知不含靶核酸的陰性組織標(biāo)本上進(jìn)行原位雜交，應(yīng)分別得到陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果。如果已知陽(yáng)性組織出現(xiàn)陰性結(jié)果，則應(yīng)對(duì)探針的制備及原位雜交的各個(gè)步驟進(jìn)行檢查。相反，如已知陰性組織出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則提示存在非特異性的雜交信號(hào)。,（二）用有意義鏈RNA探針做原位雜交 因?yàn)闊o(wú)意義鏈RNA的堿基序列與靶mRNA的堿基序列互補(bǔ)；用有意義鏈RNA探針進(jìn)

13、行原位雜交應(yīng)得到陰性結(jié)果，這是證明探針特異性較好的陰性對(duì)照。,（三）吸收試驗(yàn) 將無(wú)標(biāo)記探針先同特異性與之互補(bǔ)的DNA或RNA預(yù)雜交，然后再進(jìn)行原位雜交，結(jié)果應(yīng)為陰性。 三、雜交反應(yīng)對(duì)照 （一）空白試驗(yàn) 在進(jìn)行原位雜交時(shí)，將雜交液中省去標(biāo)記探針，結(jié)果應(yīng)為陰性。這是一項(xiàng)簡(jiǎn)便而有意義的陰性對(duì)照。,（二）雜交前用核酸酶預(yù)處理標(biāo)本 根據(jù)靶核酸是DNA或RNA，對(duì)被檢測(cè)的標(biāo)本先用DNA酶或RNA酶進(jìn)行預(yù)處理以消化被檢測(cè)的核酸，然后再進(jìn)行原位雜交。與未經(jīng)DNA酶或RNA酶預(yù)處理的標(biāo)本相比，如果雜交信號(hào)明顯減弱，便證明標(biāo)記探針與未經(jīng)酶預(yù)處理標(biāo)本中的DNA或RNA之間有雜交體形成。,四、顯示系統(tǒng)對(duì)照 （一）放

14、射自顯影顯示系統(tǒng)對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照是將浸漬乳膠的空白片在光線下曝光后顯影，陽(yáng)性結(jié)果證明乳膠及顯影過(guò)程工作正常。 陰性對(duì)照是將空白片浸乳膠后不經(jīng)曝光便與原位雜交標(biāo)本一起進(jìn)行顯影，結(jié)果應(yīng)為陰性。 如果陰性對(duì)照照片上有較多的銀粒，則說(shuō)明乳膠有放射性污染。,（二）非放射性原位雜交顯示系統(tǒng)對(duì)照 絕大部分的非放射性原位雜交是以免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行顯示的，在對(duì)照試驗(yàn)中應(yīng)包括免疫組織化學(xué)的一系列陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。具體對(duì)照試驗(yàn)的種類、操作方法與結(jié)果分析請(qǐng)參閱有關(guān)篇章或免疫組織化學(xué)專著。,第九節(jié) 原位雜交組織化學(xué)常用操作程序 一、應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的寡核苷酸探針 （一） 取材和切片 1、 取材 （1）新鮮組織

15、速凍法：將動(dòng)物麻醉后斷頭，迅速取材，并立即以干冰或液氮速凍1020min。 （2）灌注固定法：將動(dòng)物麻醉后，經(jīng)心臟先灌注溫生理鹽水，再以4甲醛0.1mol/L磷酸緩沖液（PB，pH 7.2）灌注固定，取材并浸于同樣固定液中再固定24h，然后將取材浸入20蔗糖PB于40C冰箱過(guò)夜。,2、切片 將速凍的組織或灌注固定的組織在恒冷箱切片機(jī)中切片（厚1520m）。將切片貼于有粘膠劑的載玻片上，37或室溫干燥以增加切片的粘附性。如不立即進(jìn)行雜交處理，可將切片儲(chǔ)藏于2080的環(huán)境中（可保存數(shù)月）。,（二）雜交前處理 1、4 多聚甲醛0.1mol/L,PB （pH 7.2）固定3060min（進(jìn)

16、 一步固定mRNA）； 2、0.1mol/L PB（pH 7.2）清洗3 次(每次5min)。（用磷酸緩沖 液沖洗）,3、0.1mol/L,甘氨酸-0.1mol/L PB（pH 7.2）洗 5min。 4、0.3% Triton X-100 -0.1mol/L PB （pH 7.2）處理洗10-15min(室溫)。 5、1g/ml蛋白酶K （pH 8.0的TB緩沖 液配制）消化30 min（37）。 （消化充分暴露）,6、4 多聚甲醛0.1mol/L,PB（pH 7.2） 終止消化和再固定（5min）。 7、0.1mol/L,PB（pH 7.

17、2）沖洗2次，每次3min。 8、0.25乙酸酐（以pH 8.0的0.1mol/L三 乙酸酐配制）處理10min。（堿性蛋 白乙酰化，去陽(yáng)離子電荷）,9、4SSC 5min。（從高濃度 低濃 度用標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽洗掉乙酰酐） 10、2 SSC 10min。 11、70100梯度酒精脫水，每次3min。 12、氯仿脫脂10min后干燥。,,i.雜交 1.配制雜交液： 在Eppendorf管中加入下列液體： 標(biāo)記探針 0.11.0 106 cpm/載片 雜交緩沖 300 l/載片 2.將雜交液混勻后滴加在切片表面， 然后將載片放于密封塑料盒內(nèi)雜 交2024h（41

18、45）。,ii.雜交后沖洗 1、4SSC 10sec 2、1SSC 20min (37) 3、0.5SSC 15min (37) 4、70100% 梯度酒精脫水（每次 12 min），室溫干燥。,iii.放射自顯影 1、在暗室中將核乳膠在40水浴中溶解，然后把已雜交切片的載玻片浸入原液或以蒸餾水對(duì)比稀釋的核乳膠液中，待幾秒鐘后慢慢地將載玻片提出，置于空氣干燥2030min。然后將涂有乳膠的載玻片置于暗盒中，最后將暗盒于4下曝光14周。,2、以D19顯影液將曝光的標(biāo)本在20 下顯影25min。 3、水洗1 min。 4、以F5定影液在20下定影25 min 5、水洗30min。 6、1硫

19、瑾復(fù)染12 min。 7、70100梯度酒精脫水，每次3 5min。 8、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。,a)應(yīng)用地高辛標(biāo)記的cRNA探針 i.取材和切片 同“應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的寡核苷 酸探針”中（一）。 ii.雜交前處理 同“應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的寡核苷 酸探針”中（二）中的“110”。,iii.雜交 1、雜交液配制：在雜交緩沖液中 加入適量的地高辛標(biāo)記的 cRNA探針，使探針終濃度為 0.5ug/ml。 2 、將混勻的雜交液加在切片上， 每片約 20 ul，4145保溫 1224h。,iv.雜交后沖洗 1、4SSC沖洗15min (37)。 2、

20、2SSC（含Rnase A,20 ug/ml） 沖洗10min (37)。 3、1SSC沖洗15min (37)。 4、0.5SSC沖洗15min (37)。 5、0.05 mol/L PBS (pH 7.2)沖洗3次， 每次5 min。,v.顯示 1、堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛抗體 Fab片段（1：1000）室溫下孵 育1h。 2、0.05 mol/L PBS (pH 7.2)沖洗 4次，每次5 min。 3、TSM2沖洗2次，每次5 min。 4、TSM2沖洗2次，每次5 min。 5、NBT和BCIP顯色液中顯色3h(室溫 )。 6、0.05 mol/L PBS沖洗2次，每次5 min 7、脫水、透明、封片。,