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1、第五章 原位雜交組織化學,第一節(jié) 原位雜交組織化學基本原理(in situ hybridization),原位雜交組織化學，簡稱原位雜交 (ISH)，是將分子雜交與組織化學相結合而在核酸原有的位置進行細胞內核酸定性、定位的一種技術。 當溶液中的DNA分子經(jīng)高溫或高PH處理后，DNA雙鏈分子會變性產(chǎn)生兩條單鏈，如果將溫度逐漸下降或pH恢復到中性（復性），單鏈會按照堿基互補配對的原則，重新形成氫鍵恢復到原來的雙鏈結構。無論兩條單鏈來源是否相同，只要它們之間的堿基順序互補或者部分互補，在條件適宜時，就可以全部或部分復性，產(chǎn)生分子雜交。,原位雜交技術在生命科學研究中可視為一項革命性進步。它使醫(yī)學研究從
2、器官、組織、細胞水平發(fā)展到分子水平。為各個學科的研究帶來突破性進展。其中特別是細胞或組織的重要基因表達、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學的基礎研究。,第三節(jié) 核酸分子探針,核酸探針是指帶有標記物的已知堿基序列的核酸片段，它僅與靶核酸即待測核酸反應，是用于組織細胞內的特定核酸序列定位的關鍵試劑。 探針的種類 基因組DNA探針 cDNA探針 cRNA探針 寡核苷酸探針,探針的標記 放射性同位素 3H 、35S或32P 非放射性標記物 生物素或地高辛的間接標 FITC或者羅丹明對探針分子進行直接標記 探針標記方法,第四節(jié) 原位雜交組織化學基本程序,標本制備 雜交前處理 雜交反應 雜交后處理 檢測
3、雜交信號，進行結果分析。,一、標本制備,取材：防止外原性RNA酶引起靶組織中RNA丟失，高壓消毒，焦碳酸二乙酯（DEPC， RNA抑制劑）處理。 固定 固定劑 ：4%多聚甲醛 固定方法：浸潤法，灌注法 切片 冰凍切片：最常用，操作帶手套，70%酒精檫洗工作臺 石蠟切片 ： 用含有DEPC的雙蒸水加溫展片。 培養(yǎng)細胞,,二、雜交前處理,增強組織通透性和核酸探針穿透性 0.2%0.5% Triton X-100的PBS內處理15min 蛋白酶K 1g/ml，37孵育1530 min 減低背景染色 酸酐和稀酸處理：防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，降低背景。 0.25%乙酸酐處理10 min
4、 預雜交：用不含探針的預雜交液在雜交溫度下預先孵育標本12h 內源性生物素和酶的抑制,三、雜交反應,雙鏈DNA探針和靶DNA變性 雜交反應進行時，探針和靶核酸必須是單鏈。 雜交液 甲酰胺：可使Tm降低，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結構的破壞以及標本的脫落。 硫酸葡聚糖：能與水結合，提高探針有效濃度。 牛血清白蛋白：阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，以減低背景。 探針長度 50-300個堿基，最長不宜超過400個堿基。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。 探針濃度 0.5-5.0g/ml 。 雜交溫度和時間 大約在3060之間。一般將雜交時間定為1620h，或為了方便，將雜
5、交液和標本孵育過夜,,四、雜交后處理,雜交后處理主要包括系列不同濃度、不同溫度鹽溶液的漂洗 鹽濃度由高到低，而溫度由低到高，漂洗1015min。高濃度的鹽可減少探針與組織標本間的靜電結合。漂洗過程中，必須注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量溶液漂洗也很難減少非特異性結合。,,,五、雜交體檢測,放射性同位素標記探針的檢測 放射性同位素標記探針的雜交信號可用放射自顯影術檢測。利用感光乳膠記錄被研究材料中放射性物質分布和定位。 非放射性標記探針的檢測 常用非放射性標記物多為半抗原，以半抗原標記探針的原位雜交信號可通過免疫酶組織化學或親合組織化學技術顯示。,放射性同位素標記探針的檢測,非放射性標記
6、探針的檢測,六、對照試驗,組織對照 Southern 或Northern 印跡 免疫組織化 探針對照 已知陽性組合和陰性組織對照 用有意義鏈RNA探針做雜交 吸收實驗 探針與互補DNA或RNA雜交 雜交反應對照 空白對照 雜交前用核酸酶預處理 檢測系統(tǒng)對照 放射自顯影空白片的陽性對照和陰性對照 非放射性原位雜交 同免疫組織化學技術對照,第五節(jié) 原位雜交組織化學技術進展,原位PCR技術 熒光原位雜交技術 胚胎原位雜交技術 雙重和多重原位雜交技術 原位雜交結合免疫組織化學技術 電鏡原位雜交技術 肽核酸原位雜交,原理：即聚合酶原位擴增技術。將PCR技術 與原位雜交技術結合起來，不改變周圍組織 的原有
7、位置，直接在組織、細胞或病原體原 位研究基因變化的技術。,固定組織,,蛋白酶K消化,,PCR擴增,顯微鏡觀察,dNTP--熒光素,,或dNTP-地高辛 -生物素,或熒光染料抗地高辛抗體 抗生物素抗體,一、原位PCR技術,二、熒光原位雜交技術(Fluorescent in situ hybridization,FISH),原理:一種利用熒光信號對原位雜交樣本進行檢測 的技術。 直接FISH 間接FISH,1.直接FISH,將已知堿基序列的特異DNA片斷作為探針，并標記上不同熒光素，在組織切片、間期細胞及染色體標本上與靶核酸進行DNA-DNA原位雜交，因所形成的雜交體帶有熒光素，故
8、可在熒光顯微鏡下直接觀察，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、得克薩斯紅(Texas Red)、羅丹明(rhodamin)及其衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyrhodamin isothiocyanate，TRITC)等。 簡單、快速 信號較弱，敏感性較低。,直接FISH,FISH技術的原理圖解,2. 間接FISH,使用非熒光標記的探針，如生物素或地高辛等標記探針，再通過親和連接或免疫反應帶入各種發(fā)光物質來檢測雜交體的存在。 因為有雜交信號放大作用，從而增加了雜交的敏感性，也降低了實驗成本，故間接法FISH是目前使用較多的方法。,間接FISH,Down(21三體)綜合征間
9、期細胞中的雜交信號,,3. 多色FISH,通過選用多種具有可分辨光譜的熒光染料與不同的探針結合(直接法)，在一個染色體中期分裂象或細胞核中可呈現(xiàn)多種顏色標記，同時檢測多種染色體異常。,多色FISH,4.FIBER FISH,將細胞的全部DNA在玻片上制備出高度伸展的染色質DNA纖維，然后用標記不同顏色熒光物質的探針與DNA纖維進行雜交，最后用熒光顯微鏡觀察結果并分析.,十二色熒光原位雜交技術鑒定食管癌KYSE450細胞系核型,各染色體標記的探針池組合,三、原位末端標記技術（primed in situ labeling,PRINS）,由未標記的序列特異性寡核苷酸探針（包括寡核苷酸引物或克隆的探
10、針）與固定在細胞內的靶DNA互補序列，在聚合酶的驅動下，帶有標記的脫氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依賴標記，新合成的DNA就能直接的或間接的被探測. 包含了PCR和FISH二種方法的特點，在染色體重排方面可選擇性的代替FISH技術，在使用PRINS技術時,用簡單的寡核苷酸引物代替探針，原位標記染色體，消除了制備DNA探針困難的問題。,四、胚胎原位雜交技術,全胚胎原位雜交 從整體水平反映胚胎發(fā)育過程中基因表達的時空順序, 是一種廣泛應用于胚胎發(fā)育調控基因表達研究的技術。 胚胎組織切片原位雜交。,,五、雙重和多重原位雜交技術,放射性同位素和非
11、放射性標記探針的雙重標記原位雜交 常用的放射性同位素標記物為35S，非放射性標記物為生物素和地高辛。 非放射性標記探針的雙重標記原位雜交 應用生物素和地高辛標記探針的雙重標記原位雜交 雙重熒光標記原位雜交 兩種同位素標記探針的雙重標記原位雜交,,六、原位雜交結合免疫組織化學技術,原位雜交在先 免疫組織化學在先,七、肽核酸原位雜交 (peptide nucleic acids，PNA),肽核酸是一類人工合成的電中性的肽鏈，以多聚酰胺鍵形成的類似核苷酸的物質。 具有一個擬肽骨架，沒有磷酸戊糖骨架. PNA鏈更容易和帶有負電荷的互補序列的DNA或RNA鏈結合. PNA對互補DNA的錯配容忍程度比相應的DNA/DNA更低. PNA不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解。,,肽核酸原位雜交,
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