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1、2010年版中國藥典微生物檢驗技術,崔學文 四川省食品藥品檢驗所 2010年3月,主要內容,一、藥品微生物檢驗現狀 二、中國藥典2010年版微生物檢驗增修訂 內容簡介 三、微生物檢查方法驗證試驗,(一)藥品微生物檢驗現狀,,藥品質量標準 【性狀】 【鑒別】 【檢查】 無菌/微生物限度 【含量測定】,藥品微生物檢驗概況,藥品質量體系,安全性,有效性,藥品質量體系構成與相互關系,藥品中污染的微生物通過微生物體及其分泌代謝產物導致機體過敏、中毒、感染等，嚴重的可以直接導致菌血癥危及生命。此外，某些藥品中污染微生物通過代謝活動改變藥物組成、破壞有效成份而造成療效改變或喪失。,藥品微生物檢驗概況,所以

2、，世界各國高度重視藥品微生物檢查，無菌/微生物限度檢查均為各國藥典中的重要內容。,藥品微生物檢驗概況,我國的微生物檢驗 無菌檢查始于1953年新中國第一部藥典（版） 微生物限度檢查始于1972年 由來：1972年日商在進口我國的中成藥中發(fā)現污染了大量細菌，同時還檢出大腸桿菌，向我方提出交涉，引起我國政府的高度重視，于是我國開始了微生物限度檢查工作，接著三部組織聯(lián)合調查京津滬的中藥廠，國務院為此發(fā)了73121號文件，要求加強管理提高中成藥的質量,藥品微生物檢驗概況,在中央和各地政府有關部門的關懷和重視下，經過我國藥品微生物檢驗工作者幾十年來的艱苦奮斗，我國藥品微生物檢驗工作不斷發(fā)展，標準不斷完

3、善，逐步建立起了符合我國國情的藥品微生物檢驗標準體系。 至2010版中國藥典，我國藥品無菌、微生物限度檢查方法和標準在科學性、合理性以及與國際接軌方面均有了長足進展，使我國藥品無菌和微生物限度檢查步入了一個嶄新的時期。,藥品微生物檢驗概況,近3年來發(fā)生的藥害事件,技術落后、標準化程度低； 重要性被忽視、事故頻繁！ 標準進步與標準化滯后的矛盾,藥品微生物檢驗現狀,無菌檢查現狀,1、方法的修訂與完善 2、技術現狀與標準化 3、無菌檢查的幾個問題,1、方法的修訂與完善,2005年版無菌檢查法主要方面與USP、BP的比較,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基Fluid Thioglycollate Medium,20

4、05年版無菌檢查培養(yǎng)基與USP、BP的比較1,大豆胰酪胨培養(yǎng)基(TSB)改良馬丁培養(yǎng)基,2005年版無菌檢查培養(yǎng)基與USP、BP的比較2,,中國藥典無菌檢查培養(yǎng)基差異造成的問題與對策 問題：實驗條件對號入座 漏檢 結果判斷對號入座 漏檢 對策：強調兩個培養(yǎng)基條件的互補性，實驗上 同等對待，結果判斷上不要受誤導，避 免漏檢。,,,3、無菌檢查的幾個問題,1）、無菌檢查的認識誤區(qū) 如何正確認識無菌檢查？ 2）、抗菌藥物的無菌檢查 如何去除抗菌活性？ 3）、外用制劑及眼用制劑的無菌檢查 如何去除基質影響？,1）、無菌檢查的認識誤區(qū),“欣弗事件”反映了我國一些企業(yè)在微生物控制方面

5、存在的嚴重問題；而更為嚴重的是一些企業(yè)普遍存在的無菌檢查認識誤區(qū)。,為什么要做無菌檢查？,1、有最后滅菌保證，中間不需要控制？ 2、我們現在生產條件很好，GMP，不用再強調終產品的檢查？,為什么抗生素產品也要做無菌檢查？,1、抗生素抗菌譜的限制； 2、污染微生物的亞致死、休眠狀態(tài)。,1、藥典要求。 2、抗生素產品的無菌檢查欣弗的情況如此，那么有“天然抗生素”美譽的魚腥草等中藥注射劑情況又該如何？ 3、近年來頻繁出現的中藥注射劑不良反應問題有沒有污染微生物的可能？,為什么中藥注射用產品無菌檢查也要采用薄膜過濾法？,2）、抗菌藥物的無菌檢查,抗菌類藥物由于對微生物生長的抑制作用，怎樣合理檢驗，一直

6、爭論較多。這其中關鍵的困惑來自于關于藥品中受損、受抑制或處于靜息狀態(tài)微生物的基礎研究的缺乏。 肯定的一點是，應盡量去除藥物對微生物生長的影響。USP29每膜最多沖洗500ml；BP2002和JP14每膜沖洗不大于1000ml；中國藥典2005年版以所有陽性對照菌生長為目標。 去除抗生素抗菌的活性，使得處于亞致死、休眠狀態(tài)的污染微生物復蘇、生長而得以檢出。,2）、抗菌藥物的無菌檢查,主要解決措施： 喹諾酮類以MnSO4溶液為中和劑； 參見：加替沙星無菌檢查方法的建立與標準操作探討 ，馬仕洪、劉鵬、戴翚，藥物分析雜志，2007，27（6）：877880 -內酰胺類以-內酰胺酶為中和劑； 參見：簡

7、化注射用頭孢菌素無菌檢查法的探討，戴翚、劉鵬、馬仕洪，藥物分析雜志，2007，27（2）：208211 氨糖類及其他抗生素改善沖洗條件。 每膜沖洗500ml以內基本都能解決問題。,,,,,,,,,,多價金屬陽離子對喹諾酮類的絡合作用,,五種喹諾酮類抗生素的結構，并且由3、4位上的羰基與鎂、猛等金屬離子配位生成穩(wěn)定的六元環(huán)絡合物，藥物與金屬離子的絡合比為2：1,頭孢類抗生素無菌檢查,幾種頭孢菌數無菌檢查沖洗量,通過400ml稀釋液的溶解，濾過，采用0.1%蛋白胨溶液沖洗（表7），陽性對照菌均可正常生長。,,從方法學研究到常規(guī)分析 ...,常規(guī)分析,SOP,驗證,未生長,生長,假陰性的結果 ?

8、,陰性的結果？,陽性 的結果 ?,假陽性的結果？,方法學研究,,,,,,,,,,完全按照驗證過的方法實施 / SOP,調查原因,,實驗操作的標準化 驗證試驗的系統(tǒng)化 制定標準的嚴謹化 完備的實驗室保障系統(tǒng) 最終目標：一次檢驗即可得到準確結果。,微生物限度檢查現狀,1、方法和標準的修訂與完善 2、技術現狀與標準化 3、微生物限度檢查的幾個問題,1、方法和標準的修訂與完善,中國藥典2005版微生物限度檢查法與英美藥典比較,樣品10g或10ml+緩沖液至100ml,,總需氧菌TSA, 35 ,48-72h,真菌SDA(PDA), 20-25 ,5-7d,,,結果(cfu/ml or g),,,,取1

9、ml樣品液,,,,,USP、BP總需氣菌/霉菌及酵母菌計數流程,總需氣菌、霉菌及酵母菌計數,中國藥典: 玫瑰紅鈉瓊脂, 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂,對供試品的前處理和一些檢驗方法進行了完善； 具有明顯的中國特色，與國際差距顯著。 計數測定體系的差異： 難以操作，檢驗繁瑣 需氣菌總數=細菌數+霉菌及酵母菌？ 1000 1000 100 參見：美英歐藥典微生物限度標準的淺析，蘇德模、胡昌勤、馬越，中國藥品標準，2005年第3期,1、方法和標準的修訂與完善,2、技術現狀與標準化,1）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基質量標準。 固體培養(yǎng)基的靈敏度。 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性

10、,當染菌較多時，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基生長大量的細菌，給結果判斷帶來困難。,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的專屬性,以中檢所玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：050428 ）與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：050523 ）比較，加入50100cfu陽性菌在相同條件培養(yǎng)觀察，見下表：,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基專屬性實驗結果,2、技術現狀與標準化,2）、自動化程度低，仍然依賴大量的人工 以方法驗證為基礎，引入更為便捷的供試品前處理技術，規(guī)范供試品前處理 有條件的地方可以考慮引入自動稀釋、自動接種、儀器判讀結果等設備和技術 3）、75mm薄膜過濾器的研制 征對我國中成藥品種多、情況復雜，開發(fā)研制的75mm薄膜過濾器在目前的驗證工作中發(fā)揮

11、了重要作用。,中國藥品生物制品檢定所,36,75mm濾器,圖10 75mm濾器結構細部,37,75mm濾器,（上）50mm薄膜上的大腸埃希菌菌落 （中）75mm薄膜上的金黃色葡萄球菌菌落 （下）75mm薄膜上的黑曲霉菌菌落,3、微生物限度檢查的幾個問題,原料藥的微生物標準問題； 藥材原粉的界定問題； 含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的中成藥制劑標準問題； 純化水微生物限度檢查問題；,原料藥的微生物標準問題,原料藥是藥品生產過程中引入微生物污染的重要來源之一，雖然一些藥品在生產過程或終產品階段可以采取一些滅菌措施殺滅污染微生物，但可能因為由此引入的死菌體、毒素等無法消除而危害患者，而原料藥過高的微生物

12、荷載可能直接挑戰(zhàn)一些滅菌措施的有效性，造成滅菌失敗，使藥品存在更大的安全隱患。所以世界各國藥典(原料品種占規(guī)定微生物限度品種數:BP 和EP近90%,USP約30%)均規(guī)定應對原料藥進行微生物檢查，以消除或控制其對藥品引入的微生物污染。(有最后滅菌保證，中間不需要控制？),在嚴格執(zhí)行藥品GMP的前提下，國外藥典更為重視 原料藥的微生物檢查，尤其是對一些非滅菌制劑，甚至僅僅對原料藥有微生物限度控制要求，而對制劑沒有強制要求。中國藥典2005版參考了國外藥典的這一發(fā)展趨勢，對于化學藥品的片劑、膠囊劑、顆粒劑等6個主要口服制劑在各論和制劑通則中均未做微生物限度檢查的強制要求，僅在附錄中做出通用性要求

13、，但很多企業(yè)不清楚這一變化的背景和兩個必要前提，即嚴格的原料藥微生物控制和嚴格的GMP管理，從而放松了對這些產品的微生物控制，可能會存在潛在風險。(我們現在生產條件很好，GMP，不用再強調終產品的檢查？),原料藥的微生物標準問題,中國藥典規(guī)定，對藥品原輔料藥的微生物檢查參照相應用途的藥品進行，即用于非滅菌制劑生產的原料藥應按相應制劑的微生物限度標準進行微生物限度控制；而用于滅菌制劑的原料藥一般應符合無菌要求?？紤]到生產過程中污染微生物可能發(fā)生的變化，國外企業(yè)通常在生產上自覺執(zhí)行比制劑要求更為嚴格的原料藥微生物標準。,原料藥的微生物標準問題,原料藥的微生物標準問題,（1）重視不夠 目前一些企業(yè)

14、對原料藥微生物控制的重要性和意義認識不夠，對源頭上的問題解決不好，加之GMP執(zhí)行流于形式，造成了頻繁的藥品微生物污染事故發(fā)生。 （2）標準依據不清楚 目前中國藥典絕大多數藥品原輔料各論項下沒有明確的微生物檢查標準，而是需要根據實際用途去確定相應的控制標準。 （3）抽樣不正確 原料藥微生物檢查的抽樣除了應參照相應的抽樣原則，還應強調的一點是抽樣的環(huán)境要求和無菌操作要求，不當的抽樣方法不僅可以使得樣本對總體沒有代表意義、抽取的樣本被污染，甚至可因抽樣而污染原料。 （4）方法不合理 對于原料藥微生物檢查方法驗證應與藥品制劑微生物檢查方法驗證同等重視，否則同樣存在檢驗方法不合理、不科學，檢驗結果

15、沒有意義的問題。,純化水問題,USP31/Water for Pharmaceutical Purpose Drinking Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun Maximun action levels are 500 cfu per mL Purified Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun

16、 Maximun action levels are 100 cfu per mL Water for Injection: Membrane Filtraion Method Sample Volume-100mL minimun Maximun action levels are 10 cfu per 100mL,Purified Water:pour plate or membrane filtration method1 Sample Volume1.0 mL minimum2 Growth MediumPlate Cou

17、nt Agar3 Incubation Time48 to 72 hours minimum Incubation Temperature30 to 35 2 Nevertheless, in a very low to nil count scenario, a maximum sample volume of around 250 to 300 mL is usually considered a reasonable balance of sample collecting and processing ease and increased statistic

18、al reliability. 3 Also known as Standard Methods Agar, Standard Methods Plate Count Agar, or TGYA, this medium contains tryptone (pancreatic digest of casein), glucose and yeast extract.,純化水問題,2005版二部P303 2010版二部P412 純化水（Purified Water） 【檢查】微生物限度 取本品，采用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄XI J），細菌、霉菌和酵母菌總數每1ml不得過100個。 這

19、一標準源于國外，在其需氣菌培養(yǎng)基統(tǒng)一規(guī)定的情況下簡單易行。但我國引入后，造成企業(yè)大量的意見。在藥典現有條件下實際采用2ml實驗，1ml測定細菌數、1ml測定霉菌和酵母菌數，再加合起來作為一個檢驗結果。 主要問題還是培養(yǎng)基和檢驗體系的差異。,(二) 中國藥典2010年版微生物檢驗增修訂內容簡介,,中國藥典2010年版框架(衛(wèi)),中國藥典2010年版(衛(wèi)) 無菌檢查法 微生物限度檢查法 滅菌法 抑菌效力檢查法指導原則 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則 微生物限度檢查法應用指導原則 藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則,2010版無菌檢查法修訂,2010年版中國藥典一、二、三部的無菌檢查法基本延續(xù)2005

20、年版。 2010年版中國藥典三部逐漸向一、二部看齊。,2010版無菌檢查法修訂,1、附錄 103 頁，附錄XI H 無菌檢查法 第 6 行，增加“防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出” 理由：因為有些實驗人員對樣品的處理和火焰上的操作直接影響供試品中微生物的檢出。 2、附錄 103 頁，附錄XI H 無菌檢查法 第 13 行，增加“無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經過無菌技術的培訓” 理由（1） 無菌檢查是高風險產品關乎用藥安全的必檢項目，為保證檢驗質量，必須有人員素質的保證。,而且，無菌檢查是以一次檢出不得復試的檢驗項目，實驗人員必須對實驗結果具有微生物學的判斷能力:確定污染來

21、源,污染菌類別或定性及是否重試等。因此無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，經過無菌技術的培訓，取得相應的上崗證。否則是不能勝任該崗位工作的.理由（2） 從全國藥檢系統(tǒng)特別是藥品生產企業(yè)中的用人情況來看，對從事無菌檢查的崗位要求不明確，崗位上的人員也不被重視，存在著不穩(wěn)定、學歷偏低、素質偏低的情況。藥典中增加這條規(guī)定可以保持該崗位人員的價值和穩(wěn)定性。理由（3） 美國藥典無菌檢查法中也有人員的要求。,2010版無菌檢查法修訂,3、附錄 103 頁，培養(yǎng)基 第 5 行，“三周”修訂為“3周” 第 6 行，“一年”修訂為“1年” 4、附錄 103 頁，培養(yǎng)基 第 7 行，刪除“（用于培養(yǎng)好氧菌、厭

22、氧菌）” 倒第 6行，刪除“（用于培養(yǎng)真菌）” 理由：考慮所用培養(yǎng)基與USP/BP/EP不一致的問題，避免對號入座，減少漏檢的機會，有利于提高污染菌的檢出率。,2010版無菌檢查法修訂,11、附錄 104 頁，薄膜過濾法 左第1行，“將規(guī)定量”修訂為“取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種” 左第1行，增加“總量” 左倒第1行，“按”修訂為“置” 12、附錄 105 頁，直接接種法 第4行，“銅綠假單胞菌”修訂為“大腸埃希菌” 第6行修訂為“其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量” 第7行，“按”修訂為“置”,理由（1） 根據5年來驗證試驗的經驗，發(fā)現作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌對大部分抗生素不敏感，

23、而大腸埃希菌對抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。理由（2） 但是，銅綠假單胞菌作為自然環(huán)境中存在的假單胞菌族的代表也有其作為試驗菌的必要性，無菌檢查法必須保證其能被檢出。所以采取了在培養(yǎng)基靈敏度試驗中保留銅綠假單孢菌，而在驗證試驗用菌和陽性對照用菌中改用大腸埃希菌。,2010版無菌檢查法修訂,16、附錄 105 頁，陰性對照 左第4行，“如果容器”修訂為“如果供試品容器” 左第5行，“向供試品容器內導入”修訂為“向容器內導入” 17、附錄 105 頁，薄膜過濾法 左第4行，增加“抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜” 左第11行，“每次沖洗量為100ml，且總沖洗量不宜過大，”修訂為“

24、每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不宜過大不得超過1000ml，” 理由：保證濾膜的完好性和微生物的存活。,2010年版微生物限度檢查法修訂,2010年版中國藥典微生物限度檢查法 附錄XIII C（一部） 附錄XI J （二部） 引入培養(yǎng)基適用性實驗 增加白色念珠菌檢查法 貼膏劑檢查方法的改進 限度標準表示方法改變,2010年版微生物限度檢查法修訂,4、附錄108頁，新增：貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）

25、的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。,理由：與國際接軌。BP2007、EP6.0、USP30及美國、歐洲和日本三方協(xié)調一致的藥品微生物限度檢測方法，均對透皮貼劑規(guī)定了檢測方法和限度標準。,2010年版微生物限度檢查法修訂,5、附錄108頁，修訂：離心沉淀法 取一定量供試液，500轉/分離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細菌檢查。 理由： 1、離心沉淀集菌法操作的不確定性較大，試驗菌回收率的分布區(qū)間較寬。 2、離心集菌法的實驗結果復現性差，無法準確反應供試品受微生物污染的真實程度。 3、原操作規(guī)程中僅規(guī)定轉數和離心時間不能很好的評價離心效果。（近年來更多的以相對離心力（R

26、CF）評價離心過程中的受力情況 。其計算公式為：RCF=0.00001118RN2 ，N表示轉速 ，R表示離心半徑 ）,實驗數據：取無菌10%葡糖糖溶液9ml置無菌離心管中（2管），分別加金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌菌液各1ml（5001500cfu/ml），按高速離心的條件試驗，離心后，用無菌吸管從離心管上部小心吸出上清液（勿擾動底部溶液），留底部集菌液約2ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨溶液補充至原量，混勻，取此供試液1ml注入平皿中，按平皿計數法測定，計算回收率。,實驗數據： 取無菌生理鹽水溶液9ml置無菌離心管中（2管），分別加白色念珠菌和枯草芽孢桿菌菌液各1ml（5001500c

27、fu/ml），混勻，按低速離心的條件試驗，在離心管上部取樣1ml，按平皿計數法測定，計算回收率,2010年版微生物限度檢查法修訂,6、附錄108頁，增加：計數培養(yǎng)基的適用性檢查 細菌、霉菌及酵母菌計數用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。 菌種 驗證試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）

28、26 003 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003,2010年版微生物限度檢查法修訂,6、附錄108頁，增加：計數培養(yǎng)基的適用性檢查 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50100cfu

29、的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml 含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50100cfu的孢子懸液。 菌懸液制備后應在2小時內使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時內使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在28，在驗證過的貯存期內替代對應量的新鮮孢子懸液使用。,計數培養(yǎng)基適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株

30、試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48hr，計數；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72hr，計數；取白色念珠菌50100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)72hr，計數。同時，用對應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。結果判定 被檢培養(yǎng)基的菌落數與對照培養(yǎng)基菌落數相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)的適用性檢查符合規(guī)定。 被檢培養(yǎng)基菌落數瓊脂培養(yǎng)基回收率=

31、*100% 對照培養(yǎng)基菌落數,2010年版微生物限度檢查法修訂,13、附錄110頁，增加：控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。 菌種 對試驗菌種的要求同計數培養(yǎng)基的適用性檢查。 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 09

32、4 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001,2010年版微生物限度檢查法修訂,16、附錄111頁，增加：白色念珠菌 取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上

33、生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選23個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。 若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時。取培養(yǎng)物進行染色，鏡檢及芽管試驗。 芽管試驗挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的

34、載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內，置3537、13h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。 若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。,理由:白色念珠菌（Candida albicans），又稱為白假絲酵母菌（Saccharomyces albicaus），屬假絲酵母菌屬（Saccharom yces） 。白色念珠菌是條件致病菌，是醫(yī)學全身性真菌感染病的重要組成之一，一旦感染，常可引起心內膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。 白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國內的藥品、食品標準均已把白色念珠菌作為微生物檢驗中酵

35、母菌的代表菌，因此有些藥品依據給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。,(三) 微生物檢查方法驗證試驗,,無菌/微生物限度檢查理念,,,,,充分重視微生物檢查的重要性 充分重視微生物檢查方法的合理性 如何推進微生物檢驗技術的發(fā)展？ 方法驗證,關于方法驗證,為什么驗證? 驗證什么? 怎么驗證? 何時驗證？,關于方法驗證,中國藥典2005版首次引入方法驗證要求； 中國藥典2010版無菌檢查法和微生物限度檢查法延續(xù)了2005版方法驗證要求； 中國藥典2010版微生物限度檢查法應用指導原則（一部附錄XVIII F、二部附錄XIX P）第五條。,為什么驗證?,1、采用經過驗證的方法，是分析測量

36、科學的基本要求，是各種法規(guī)遵循工作的基礎。藥品微生物檢查作為整個藥品質量體系中的一個環(huán)節(jié)，應與其他檢驗項目一樣，對方法和條件進行考察，以保證結果的科學性，如鑒別、含量測定。 2、驗證的思想其實早已貫徹于微生物檢測的諸多方面：無菌環(huán)境驗證（塵埃離子、浮游菌、沉降菌檢測）、滅菌器的驗證、培養(yǎng)基靈敏度檢測、陰性對照、陽性對照等等。,為什么驗證?,3、2005版充分借鑒發(fā)達國家經驗，將微生物檢查方法的驗證實驗進行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。驗證實際上伴隨著整個實驗過程，實驗過程中的每一個環(huán)節(jié)均應有合理的證明（驗證），保證其對結果判斷沒有影響。 4、有了系統(tǒng)的方法驗證，可以避免以往因為陽性菌選擇不合理、方

37、法不合理而造成的漏檢、誤判，以保證結果的科學可靠，這一點無論對于當前無菌檢查的一次性報告，還是對于實驗室認證認可、以及新的藥品注冊管理辦法的要求都是相一致的。,5、通過對同品種但不同批號或不同生產廠家的產品的微生物學驗證試驗比較，可以發(fā)現產品所用原料質量或工藝流程中是否存在污染抑菌物質的問題，具有藥品質量控制的意義。,例：鹽酸利多卡因注射液,要求執(zhí)行驗證的相關法規(guī)和文件,為了確保開展微生物學檢驗方法的驗證，國食監(jiān)注2005234號“關于頒布和執(zhí)行中國藥典2005年版有關事宜的通知” 國藥典發(fā)200598號“關于執(zhí)行中國藥典2005年版微生物限度檢查法和無菌檢查法有關問題的說明”中檢藥20068

38、62號“第七屆全國藥品檢驗所抗生素室主任工作會議暨全國藥品微生物檢驗方法及標準研討會會議紀要”都作了說明和規(guī)定。,驗證什么？,無菌、微生物限度檢查的驗證試驗可概括描述為：在采用的檢驗方法和過程中，通過分別加入規(guī)定量的代表性微生物，以試驗供試品是否在規(guī)定的檢驗量、在所采用的檢驗條件下無抑菌性，或已充分消除了抑菌性，并且所用方法對微生物生長無不良影響，從而確認檢驗方法的有效性，保證檢驗結果的準確可靠。因此，整個實驗過程中的每一個環(huán)節(jié)均應有合理的證明，保證其對結果判斷沒有影響。按樣品的檢驗流程，驗證的重點環(huán)節(jié)分布如下：,驗證什么？,需前處理,不需前處理,有抑菌作用,無抑菌作用,樣品,檢查,去除抑菌作

39、用,,,,,,,,,,,,,驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。,驗證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出的影響。,,可以通過驗證實驗判斷,藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié),,,,驗證什么？需要驗證的重點環(huán)節(jié),驗證實際上伴隨著整個實驗過程，實驗過程中的每一個環(huán)節(jié)均應有合理的證明（驗證），保證其對結果判斷沒有影響。 前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現性，應在驗證范圍內。已有標準規(guī)程（SOP）和充足實驗證明的前處理方法可以直接采用，但出現疑問應進一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當前驗證工作的重點。尤其強調應充分驗證供試品本身對微生物生長的影響。,怎么驗證？,利

40、用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響，通過模擬實驗對降低或消除效果加以檢驗。,稀釋法 薄膜法 中和法 離心法,供試品,前處理,去除抗菌活性,稀釋 溶解 分散 萃取 離心,,供試品污染微生物檢查,驗證,,,,,,供試品中抗菌活性的去除,稀釋法降低供試品的相對濃度 薄膜法利用體積差異分離 中和法利用化學（生物）專屬性滅活 離心法利用沉降系數差異分離,各方法組合運用，效果更佳！,抗菌活性去除效果的檢驗,應根據供試品的特點，選擇敏感菌株，對供試品抗菌活性去除效果加以檢驗，再按藥典要求全面驗證，提高效率。,選擇敏感菌株,查閱資料臨床藥物實驗手冊、文獻資料、申 報資料中的藥效學資料 參考已

41、經驗證過的品種 直接通過驗證實驗確定,選擇適宜的方法,可靠、穩(wěn)定、簡便 參考方法： 在樣品許可的條件下 無菌：薄膜過濾，500ml/膜沖洗； 限度：薄膜過濾，300ml/膜沖洗。,結果總結與報告,綜合分析實驗中遇到的所有情況，最終形成一份詳細、嚴謹、具有可操作性的驗證報告。 給出該品種的標準檢驗規(guī)程，規(guī)程中應明確樣品前處理步驟、采用的具體方法，以及各方法操作的關鍵點，以供檢驗參考。 方法驗證實驗報告標準的技術文件。,無菌檢查方法驗證的思路,驗證體系：陰性對照、陽性對照、微生物挑戰(zhàn)試驗 通過消除或抑制供試品中抗微生物物質的活性來檢驗微生物的方法，應通過驗證，以確定所用檢驗方法測定結果的可信

42、度,無菌檢查方法驗證的思路,利用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響，通過模擬實驗對降低或消除效果加以檢驗 依據抗菌譜通過預實驗確定敏感菌株（陽性對照菌） 通過敏感菌株確定沖洗量 通過方法驗證驗證該取樣量以及沖洗量下敏感菌株生長情況 確定試驗方案進行檢驗,,,,影響無菌檢查方法驗證結果的環(huán)節(jié),供試液的制備 沖洗條件 中和劑的選擇與加入 敏感菌株的選擇與加入 標準化操作,影響無菌檢查方法驗證結果的環(huán)節(jié),供試液的制備供試液濃度過高增加了濾膜的初始吸附量，從而導致了后期沖洗體積的增大，因此將供試液濃度控制在一定范圍之內有助于提高無菌檢查方法的科學性,供試液的影響,左奧硝唑注射液（水針）

43、 規(guī)格：10mL：0.25g/支 生產企業(yè) ： 衡陽恒生制藥有限公司 注射用鹽酸克林霉素（粉針） 規(guī)格： 0.3g/支 生產企業(yè) ：北京四環(huán)科寶制藥有限公司,左奧硝唑注射液（ 10mL：0.25g/支）,注射用鹽酸克林霉素（ 0.3g/支）,無菌三針單聯(lián)管 ----溶解稀釋供試品,,影響無菌檢查方法驗證結果的環(huán)節(jié),沖洗條件主要是沖洗體積對于無菌檢查方法的影響，沖洗體積過大濾膜的截留能力會降低，導致無菌檢查假陰性結果的出現建議沖洗量控制在1000ml/膜以內,沖洗量的影響性試驗,指征菌：粘質沙雷（Serratiamarcescens） 注：又稱靈桿菌，一種產生鮮紅色素的細菌，存在于空氣和水

44、中，可生長在動、植物性食品中。為細菌中最小者，約0.5(0.51.0)微米。近球形短桿菌，但形態(tài)多樣。革蘭氏陰性，周身鞭毛,能運動。無莢膜，無芽胞，在普通瓊脂平板上2530培養(yǎng)12天出現粘性、中心顆粒狀、有惡臭的菌落。約半數菌株能產生紅色的靈菌素(prodigiosin)。在室溫條件下易促進色素的生成，因本菌小且有色素，常用于檢定濾菌器的質量。,操作步驟：1.濕潤濾膜2.加入適量指征菌3.用不同沖洗量對濾膜進行沖洗4.平行進行陽性對照5.取膜培養(yǎng)6.計算回收率,沖洗量的影響性試驗,沖洗量的影響性試驗,影響無菌檢查方法驗證結果的環(huán)節(jié),中和劑的選擇與加入選擇：對應的理化特性作為選擇依據，如內酰胺酶

45、、 MnSO4 ；應對微生物的生長無影響。加入：不同中和劑加入方式效果不一樣。通過我們的經驗，基本傾向于直接加入培養(yǎng)體系中。,影響無菌檢查方法驗證結果的環(huán)節(jié),敏感菌株的選擇與加入選擇：根據抗菌譜和預試驗（體外抑菌試驗）加入：按規(guī)定應在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮濾器的有效性。而驗證實驗主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質對陽性菌生長的影響，可以與對照濾筒比較而做出判斷，所以驗證實驗中加菌時機與方式只要與對照一致即可。,影響無菌檢查方法驗證結果的環(huán)節(jié),標準化操作供試液制備：通過比較發(fā)現，在檢驗條件下，0.9%氯化鈉溶液對大多數的抗生素粉針比0.1蛋白胨溶液溶解能力強、溶解速度快。 沖洗方法

46、：少量多次、充分震搖、沖洗體積的控制中和劑和陽性對照菌的加入方式,樣品量以及供試液濃度的確定,出廠檢驗量遠遠高于上市抽驗量，樣品量的增加是否會直接導致沖洗量的增加？ 沖洗只能讓樣品的吸附量降至最低值，即降至基礎吸附量 敏感菌的生長取決于培養(yǎng)體系中殘留的濾膜基礎吸附量 濾膜基礎吸附量的多少取決于濾膜材質，和沖洗量無關,樣品量與基礎吸附量無關,樣品量以及供試液濃度的確定,個論化描述時規(guī)定供試液濃度，不同取樣量參考規(guī)定濃度配制，所配供試液濃度不應高于規(guī)定值。,微生物限度檢查方法驗證的思路,選擇敏感菌株 選擇方法：同無菌驗證 選擇參考： 一般中藥選擇枯草和金葡； 一般抗生素根據抗菌譜選擇。,原則:

47、由易到難，由簡到繁,例：黃芩苷,黃芩苷： 理學性質：幾乎不溶于水 查閱文獻： 周智興 傅穎媛 黃芩苷對白色念珠菌細胞周期的影響 結論 ： 黃芩苷具有明顯的抗白色念珠菌作用;黃芩苷能抑制白色念珠菌增殖 驗證試驗： 1：10供試液混懸，1ml影響菌落識別； 0.2ml/皿，0.1ml /皿，白念回收率明顯低于70%； 1：50供試液，澄清，薄膜過濾，300ml/膜；,選擇敏感菌株,,用藥典規(guī)定的5個標準菌株，對124個中藥品種進行驗證，研究表明： 有一定抑菌作用和強抑菌作用的品種占總數的79%。 說明用在沒有對方法進行驗證之前，有近80%的中成藥微生物限度檢查的結果，不能真實反映樣品中實際

48、的污染情況。,培養(yǎng)基稀釋法:定義? 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。 薄膜過濾法:供試液取樣量? 取相當于每張濾膜含1g、1ml 或10cm2 供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾；若供試品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml 進行試驗。 四硫磺酸亮綠培養(yǎng)基:配法? 臨用前，取上述培養(yǎng)基，每10ml 加入碘試液0.2ml 和亮綠試液0.1ml，混勻。,什么時候驗證？,（1）當建立藥品的微生物學檢查方法時。即當申報新藥時必須附有進行微生物學檢查的方法學驗證的資料。并在藥品質量標準的【無菌】或

49、【微生物限度】項下明確經驗證試驗確定的檢驗操作方法。 （2）產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改時?？疾爝@些改變對微生物生長的影響。,驗證以后怎么辦？,無菌檢查：進行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。,微生物限度：檢查時，按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、霉菌酵母菌菌數的測定；供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。,檢驗方法的各論化！,再驗證定期再驗證 考察驗證結果的穩(wěn)定性和及時發(fā)現影響微生物 生長的因素。 與產品的微生物學檢查同時進行 陽性對照（無菌），敏感 菌回收（限度）,方法驗證實驗工作的完善和發(fā)展,一方面以驗證實驗為手段和契機，充分完善和細化我國無菌和微生物限度檢查方法，建立起完備的SOP體系。 另一方面集中力量盡快完成我國數以千計的品種的檢驗方法的初步驗證實驗，并收集、整理、分析已有驗證資料，指出各品種驗證實驗的發(fā)展方向。 通過方法驗證促進我國藥品微生物檢驗工作全面發(fā)展。 微生物限度檢查法應用指導原則第五條。,驗證實驗信息交流平臺 ,,謝謝大家！,,