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1、大豆蛋白的提取與含量測(cè)定,指導(dǎo)老師 徐文俊,序言蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn),蛋白質(zhì)是一切生物體內(nèi)重要的組成成份，蛋白質(zhì)是由二十多種氨基酸以肽鍵相互聯(lián)接而成的復(fù)雜的高分子化合物，溶于水時(shí)形成親水膠體溶液。在酸堿和酶的作用下，蛋白質(zhì)被水解成膠胨肽最后形成氨基酸。 蛋白質(zhì)分子依靠氫鍵、鹽鍵等副價(jià)鍵維持一定的空間構(gòu)型。在各種物理化學(xué)因素影響下，由于副價(jià)鍵的破裂，使其空間結(jié)構(gòu)遭受不同程度的破壞，蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性也隨著改變。該現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。,蛋白質(zhì)分子是含有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離度相等，成為帶有正負(fù)電荷相等的兩性離子，在電場(chǎng)中不向兩極移

2、動(dòng)，并且極易沉淀。氨基酸組成不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。根據(jù)在一定條件下（如PH，離子強(qiáng)度等）它們所帶電荷的數(shù)量和種類，分子的大小及形狀等方面的差異，可以采用電泳，離子交換柱層析等方法對(duì)它們進(jìn)行分離分析。 許多物理化學(xué)因素可以改變蛋白質(zhì)在水中的溶解度，產(chǎn)生可逆或不可逆沉淀，這些因素（如增加溶液的離子強(qiáng)度，降低溶液的介電常數(shù)，調(diào)節(jié)溶液的PH等）以及一些沉淀劑和膠附劑也常用來(lái)分離，提純蛋白質(zhì)或除去蛋白質(zhì)。為了更好地使同學(xué)們運(yùn)用和掌握好理論和實(shí)踐相結(jié)合，把學(xué)到的理論應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)中，本系列實(shí)驗(yàn)安排是從一種生物中提取蛋白質(zhì)，通過(guò)各種物理化學(xué)性質(zhì)使其得到純化，得到蛋白質(zhì)，并進(jìn)行濃度測(cè)定，計(jì)算其收率。,蛋

3、白質(zhì)性質(zhì)與應(yīng)用技術(shù)關(guān)系圖,肽 氨基酸,疏水性 親水性,低 層 析,,,,一、大豆蛋白的提取,目的要求 1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、計(jì)算粗提產(chǎn)率 2、學(xué)習(xí)計(jì)算蛋白質(zhì)收率 實(shí)驗(yàn)原理 大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、根據(jù)其性質(zhì)不同，可以分為水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白、堿溶蛋白。將豆粉依次用上述溶劑提取，并用有機(jī)溶劑沉淀，可制得各部分蛋白質(zhì)的干粉。本實(shí)驗(yàn)主要是水溶提取大豆蛋白。 稱出提出蛋白質(zhì)的重量，已知原料重量，可以求出蛋白質(zhì)的收率。,試劑和器材,1、試劑 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1mo

4、l/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）離心機(jī) （2）燒杯 （3）滴管 （4）PH試紙等,操作方法,1、水抽提 將豆粉5g用約40毫升左右的蒸餾水少量多次的添加攪拌，常溫下攪拌抽提15min， 3800r/min離心15min，取上清液，如上清液不清澈再經(jīng)過(guò)濾。 取上清液1毫升稀釋50倍留做蛋白測(cè)定。 其余清液加入等體積在冰箱中預(yù)冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（攪拌）6mol/L和1 mol/L HCL，調(diào)PH4.55.0，3800r/min，離心15min，收集沉淀物，反復(fù)用丙酮攪拌洗滌離心2次，得到粉末狀蛋白質(zhì)干粉，稱重，計(jì)算粗產(chǎn)率。,蛋白質(zhì)產(chǎn)物重量 蛋白

5、質(zhì)產(chǎn)率= 100% 原料總重量 思考題 1、用丙酮沉淀蛋白時(shí)，為何要調(diào)PH4.55.0？ 2、大豆中哪類蛋白含量最多？ Folin酚法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度見(jiàn)第二實(shí)驗(yàn)部分,,,Folin酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,目的要求 掌握Folin酚法測(cè)定蛋白濃度的原理和方法實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如比重、紫外吸收，折射率等測(cè)定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)，F(xiàn)olin酚試劑反應(yīng)等方法來(lái)計(jì)算。其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實(shí)驗(yàn)室中常用的方法，它們操作簡(jiǎn)便，迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的儀器。Folin酚法靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍。 Folin酚法所用試劑是由兩部分組成，

6、試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鏈起顯色反應(yīng)。試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩(wěn)定，易被酚類還原而呈蘭色（鉬蘭和鎢蘭混合物）。,由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酷氨酸還原呈蘭色，溶液蘭色的深淺與蛋白濃度有較好的線性關(guān)系。因此用Folin酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，靈敏度較高。 樣品中含酚類化合物及檸檬酸均有干擾作用，如果樣品酸度較高則顯色較淺，要提高碳酸鈉一氫氧化鈉的濃度。此法也可測(cè)定溶液中酪氨酸的色氨酸的濃度。 Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一個(gè)，只是在各溶液的濃度及填加量上，保溫的溫度及保溫時(shí)間上有所不同而已，本實(shí)驗(yàn)所介紹的是本室常用的，靈敏度較高的操作方法。,試劑和器材,

7、1、材料： 本實(shí)驗(yàn)所提取大豆蛋白水提取液，經(jīng)合適稀釋至可測(cè)定范圍。 2、試劑： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸緩沖液。 （2）200g/ml的標(biāo)準(zhǔn)酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin試劑甲：（俗稱堿性銅試劑）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 稱取0.5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上兩溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一個(gè)月。,4、Folin試劑乙：在2升磨口回流裝置的燒瓶?jī)?nèi)，加鎢酸鈉（NaWO42H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO2M2O）25g，蒸餾水700ml，85%的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分

8、混合后，小火回流10小時(shí)，再加硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml及數(shù)滴溴。然后開口沸騰15min，以驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后定容到1000ml，過(guò)濾后呈金黃色，于棕色并中保存，可使用多年。 上述制備的Folin試劑乙的貯備液濃度一般在2mol/L左右，幾種操作方案都是把Folin試劑乙稀釋至1mol/L的酸度作為應(yīng)用液，我們是把貯備液于作用前稀釋18倍，使之濃度為0.1mol/L略高。這種稀釋18倍后的Folin試劑乙就是下文稱之為應(yīng)用液，F(xiàn)olin試劑乙貯備液濃度的標(biāo)定，一般是以酚酞為指示劑，用Folin試劑乙去滴定1mol/L左右的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液，當(dāng)溶液顏色由紅變?yōu)樽匣疑?，再突?/p>

9、變成黑綠既為終點(diǎn)。如果用NaOH去滴定Folin乙，終點(diǎn)不太好掌握，溶液的顏色是由淺黃色變?yōu)闇\綠色，再變?yōu)榛易仙珵榻K點(diǎn)。,3、器材：,試管10支 試管架一個(gè) 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒溫水浴 723型分光光度計(jì),操作方法,1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸緩沖液溶解的酪蛋白，濃度為200g/ml。用一支0.5ml移液管分別取上述標(biāo)準(zhǔn)酪蛋溶液0ml, 0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支試管中去，將此吸管用0.03mol/LPH7.8的磷酸緩沖液，反復(fù)洗凈，再用同一支移液管（防止未經(jīng)標(biāo)定吸量管的相對(duì)誤差

10、的影響）取上述緩沖液將每支試管中的溶液補(bǔ)加至1ml。再在另一支試管中加入1ml緩沖液作空白對(duì)照。于上述試管中各加入1mlFolin試劑甲并不時(shí)地進(jìn)行振蕩，10min后再加入后1in試劑乙的應(yīng)用液4毫升。立既搖勻放入55水溶中保濕5min。取出后用自來(lái)水冷卻1min。于波長(zhǎng)650nm進(jìn)行比色測(cè)定各管的OD值，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，既可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。,Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作：取7支試管（干燥的）按下表順序分別加入各種試劑并進(jìn)行反應(yīng)和測(cè)定,2、樣品測(cè)定：取兩支試管（平行）各加入待測(cè)的蛋白質(zhì)樣品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲線（可取兩支試管編號(hào)8、9，與工作曲線同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)和比色測(cè)定）；,3.蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算： A650值對(duì)應(yīng)的mg數(shù)(Pr) Pr(mg/ml)= 稀釋倍數(shù) Pr溶液的ml數(shù),,思考題 1、采用Folin的酚法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量時(shí)，樣品中的什么物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾？ 2、作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白的酪蛋白在應(yīng)用時(shí)有何要求。,