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1、原位雜交操作流程 冰凍切片的（ DIG-labeled RNA probe）原位雜交操作程序 一 、 切片制備 用新鮮組織制作 6m厚冰凍切片 ， 37 干燥 1 4小時 ， 進行下一步操作 。 二 、 預(yù)雜交前處理 預(yù)固定 ： 4%PFA（ in DEPC-PBS Ph7.4） RT 30 60min 4%PFA： 多聚甲醛 20g 1 PBS 450ml 加熱 （ 60 、 20min） 溶解 冷卻后調(diào) pH至 7.4

2、 1 PBS 500ml PBS RT 5 min 2 10 PBS： 500ml NaCl 40g KCl 1g KH2PO4 1g

3、 Na2HPO4 7.7g DEPC水 450ml 調(diào) Ph至 7.5 DEPC水加至 500ml PBS(含 0.3%v/vTritonX-100) RT 15 min 臨用前配制 10

4、%TritonX-100 15ml 1 PBS 500ml PBS RT 5min 2 消化 ： 2g/mlProteinase K in TE buffer 37 10 min TE： pH8.0 Tris-HCl 1M 5ml pH8.0 EDTA

5、0.5M 1ml DEPC水 500ml 0.2%Glycin in PBS RT 5 min 2 (50 xDenhart s; Ficoll 400 聚蔗糖 1g 后固定 ： 4%PFA in PBS RT 15 min

6、 PVP 聚乙烯基吡咯烷酮 1g BSA 牛血清白蛋白 1g DEPC 水 100ml） PBS RT 3 min 2 0.1 M 三乙醇胺 （ TEA） /0.25%乙酸酐 RT 5 min 2 0.1M 三乙醇胺 ：三乙醇胺 2.64ml

7、 DEPC水 200ml 用前加入乙酸酐 500l PBS RT 5 min 2 三 、 預(yù)雜交 預(yù)雜交 50 2h 預(yù)雜交液： 50%去離子甲酰胺 5 SSC 5 Denhardt s

8、 0.02%SDS 0.1mg/mltRNA 四 、 雜交 雜交 50 12h以上 五 、 雜交后處理 2 SSC脫去蓋膜 （ 片 ） 50 2 SSC清洗 37 10 min 2 20g/mlRNaseA in Rnsae buffer 37 30 min Rnsae buffer;2M Tris 5ml

9、 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W 1000ml Rnase buffer 37 30 min 2 SSC 50 15 min 2

10、 1 SSC（ 含 0.02%SDS） 37 15 min 2 5%SDS 2ml 1 SSC 500ml 0.1 SSC 37 15 min 2 Buffer 37 10 min 2 Buffer : 2M Tris-HCl Ph7.6 25ml

11、 3M NaCl 25ml D.W. 500ml 封閉； 0.5%抗體阻斷液 in Buffer （ 含 0.2%Tween20） 37 20 min 抗體阻斷液 : (1:500抗地高辛抗體 in 阻斷液 37 2 h) 阻斷劑 1g

12、 Tween-20 0.4ml Buffer 37 10 min 2 Buffer 200ml Buffer 37 10 min 2 顯色； Buffer : 2M Tris 10ml （ 1:50NBT/BCIP Stock Solution in Buffer 224h） 3M NaCl 6.67ml

13、 MgCl2 2.033g （ 濕合 、 避光 ） D.W. 180ml 濃 HCl調(diào) pH至 9.5 D.W. 200ml 終止反應(yīng)： Buffer RT 5min 2 流水沖洗 5-10min 1%甲基綠復(fù)染 3-10min， 水洗 ， 晾干 ， 封固 DNA探針檢測石蠟 切片中 DNA

14、組織標本 肝穿刺組織 ， 常規(guī)石蠟包埋 ， 4m連續(xù) 石蠟切片 ， 貼在涂有切片粘合劑的干凈 載玻片上 ， 58 烤 18h。 試劑 1 20 SSC 2 HBV cDNA-Dig探針 5g 3 4 多聚甲醛 4 0.1mol/L PBS， pH7.4 5 0.2mmol/L HCl 和 0.1mol/L甘氨酸 PBS pH7.4 6 0.4 Tritor X-100 PBS pH7.4 7 蛋白酶 20g/ml 8 0.25 乙酸酐 ， 用 0.1mol/L三乙醇胺配制 9 預(yù)雜交緩沖液和雜交緩沖液 10. AKP標記抗 Dig Fab段二抗 ， 可 1:500稀釋

15、11. TSM、 TSM2（ 配制參閱附錄 4） 12. NBT和 BCIP顯色液或用 AKP顯色 Kit 操作流程 雜交前處理 預(yù)雜交 雜交 雜交后漂洗 雜交后檢測 結(jié)果判斷 雜交前處理 1. 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水 2. 0.02M pH7.4 PBS洗 3 3min 3. 0.2M HCI 20min 室溫 （ 除去蛋白 ） 4. 2 SSC（ 內(nèi)含 5M EDTA） 50 洗 30min 5. 蛋白酶 2g/ml 37 20min 6. 0.1M甘氨酸 PBS洗 10min 室溫 ， 中止酶反應(yīng) 7. 4 多聚甲醛 ， 20min 室溫 8.

16、 PBS洗 3 3min 9. 75 ， 85 ， 95 和無水乙醇各 2min 預(yù)雜交和雜交 加預(yù)雜交液 20l/每片 ， 42 2h。 加雜交液 10 20ul/每片 （ 內(nèi)含 HBV-cDNA Dig標記探針 4g/ml） ， 加蓋硅化玻片 ， 將切 片置于 95 10min， 使探針和靶病毒 DNA雙鏈 打開 （ 變性 ） ， 然后迅速置于冰上 5min， 再將 切片置于盛有 2 SSC濕合內(nèi) ， 42 雜交過夜 (12 16h)。 雜交后漂洗 1. 將切片置于 2 SSC液內(nèi)振動移去蓋片 2. 2 SSC洗 2 10min， 55 3. 0.5 SSC 2

17、 5min， 50 4. PBS洗 3 3min 5. 10 醋酸 20min 室溫 ， 阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶 6. PBS洗 3 3min 信號放大和顯示 1. 1:500稀釋 AKP標記抗 Dig二抗 ， 37 4h， 或 4 過夜 2. PBS洗 3 3min 3. TSM1洗 2 5min 4. TSM2洗 2 5min 5.顯色液 在 1mlTSM2中加入 4.5lNBT， 3.5l， BCIP 混合后 ， 顯色 30min 12h， 中間不斷觀察 6. TSM2洗 ， PBS洗 3 3min， 核固紅或甲基綠襯染 7. 蒸鎦水洗 ， 系列乙醇脫水 ， 二甲苯透明 ，

18、 樹脂封片 結(jié)果判斷 ISH流程 探針合成 組織細胞標本的準備 ISH試劑的配制 操作流程 探 針 1、 根據(jù)文獻報道合成 PCR引物一對 。 2、 PCR擴增：用高保真 DNA聚合酶 進行 PCR擴增 。 3、 將 PCR擴增產(chǎn)物亞克隆入 pGEM2Z質(zhì)粒 （ EcoRI和 ACC I酶切位點 ） ， 在大腸桿菌 中擴增 ， 純化 。 原理： PGEM3質(zhì)粒購于 promega公司 ， 含有位于 pUc19 MCS側(cè)面的 SP6和 T7 RNA聚合酶啟動子 ， 在將所需序列 插入 MCS后 ， 一個簡單的基于 lac Z -肽 滅活的

19、顏色選擇方案將促進重組體的篩選 。 在體外 ， 將 SP6或 T7 RNA聚合酶加入到含有 標記物的三磷酸核苷前體的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中 ， 可允許從任何一方向產(chǎn)生多拷貝 DNA插入序 列的標記 RNA探針 。 4、 利用 Roche生產(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄標記 RNA kit（ Cat.No 999644） 操作流程參閱 原位檢測技術(shù) p132-133。 組織細胞標本的準備 ISH試劑的配制 （ 所有試劑和用具 均用 DEPC水處理 ） 操作流程 1 1、 活細胞經(jīng) 4 多聚甲醛固定 20min， 室溫 ， PBS洗 ， 系列乙醇脫水 。 2、 組織標本：標準取材后 ，

20、4 多聚甲醛固定 6h， 用 25 遮糖或液氮速凍 ， 切片貼在涂有 APES膠的干凈載玻 片上 。 3、 PBS洗 3 3min， 冰凍切用 4%檸檬酸鹽 90 保溫 20min， 石蠟切片 98 10min， 細胞片不用 。 4、 2g/ml 蛋白酶 K 37 20min， PBS洗 3 3min。 5、 0.1mol/L甘氨酸 PBS洗 10min. 6、 0.25%乙酸酐的 0.1mol/L三乙醇胺 (pH8.0)洗 10min， PBS洗 10min。 7、 預(yù)雜交 0.2 SSC 50 甲酰胺 30min 37 。 8、 雜交：滴加雜交液 （ 2g/ml ）

21、 加一層復(fù)蓋膜 ， 48 雜交 8-12h。 9、 雜交后洗： 2 SSC洗 2 5min 45 1 SSC洗 2 5min 室溫 0.5 SSC洗 2 5min 室溫 0.1 SSC洗 2 5min 室溫 PBS洗 3 3min 10、 用 10 正常血清封閉 30min 11、 抗 Dig IgG 1:500 37 1h 12、 PBS洗 3 3min 13、 0.02M TBS pH9.015min 14、 NBT/BCIP顯色 1h-24h 15、 洗后 ， 核固紅襯染 ， 蒸餾水洗 ， 脫 水 ， 透明 ， 封片 。 16、 結(jié)果觀察：紫藍色為陽性信號 ， 紅 色為背景 。