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1、小麥籽粒植酸含量和無機(jī)磷含量的分布及其關(guān)系 植酸(Phytic acid,PA)又稱肌醇-6-磷酸(Myo-inositol 1,2,3,4,5,6hexakisphosphate或InsP6),是維生素族的1種肌醇六磷酸,是植物種子中磷的主要存儲形式,其含磷量占種子全磷的60% 80%,占肌醇多磷酸的95%以上,而其余肌醇多磷酸的磷量往往不到全磷的5%,另外無機(jī)磷含量占全磷的2%8%。細(xì)胞磷(包括DNA、RNA、自由核苷酸、磷脂和糖脂 等)所含磷占種子全磷量的10%20%。小麥種子植酸主要分布在糊粉層,84%88%的植酸存在于麩皮中,胚芽部分約占10%,而胚乳中幾乎沒有,約占2%左右。研究表

2、明,禾谷類作物用作糧食和飼料時,非反芻動物(包括人)不能消化吸收植酸和植酸鹽。在消化道中,植酸易于與Fe和Zn等礦質(zhì)元素形成不能被人和反芻動物吸收的復(fù)合物,也可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成植酸-蛋白質(zhì)二元復(fù)合物或植酸-金屬陽離子-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物,而且植酸還會抑制-淀粉酶和磷脂酶的活性,所以植酸是不可忽視的抗?fàn)I養(yǎng)因子。土壤中缺乏分解植酸及植酸鹽的微生物,有機(jī)肥中的植酸還會造成土壤、水系磷污染。 植酸含量多采用三氯化鐵比色法,其原理是利用植酸對鐵離子強(qiáng)烈的螯合作用,通過顯色反應(yīng)的OD值來測定出植酸含量。李春喜等采用FeCl3-磺基水楊酸測定了18個品種籽粒的植酸含量,其平均含量是10.55mg/g,百農(nóng)6

3、4(11.98mg/g)含量最高,豫麥34(9.36mg/g)含量最低,不同品種間籽粒植酸含量差異極顯著,說明不同品種間存在廣泛的遺傳變異。吳澎等對我國137份微核心種質(zhì)資源小麥材料的全麥粉中的植酸含量進(jìn)行測定,結(jié)果表明植酸平均含量為21.04g/mg,并按植酸含量其分為高、中、低含量3類品種,各占供試品種的3.45%、89.3%及7.25%。無機(jī)磷含量測定多采用鉬藍(lán)比色法,其原理如下:磷在一定酸度下,磷酸與鉬酸銨作用生成磷鉬酸銨,對苯二酚、亞硫酸鈉可將磷鉬酸銨還原成藍(lán)色的鉬藍(lán),使溶液呈藍(lán)色,藍(lán)色的深淺與磷的含量成正比,可用分光光度計(jì)測定,從而間接反應(yīng)出植酸含量。李麗等對磷鉬黃比色法測定小麥麩

4、中植酸含量的測試條件進(jìn)行研究,結(jié)果表明該方法檢測植酸磷含量的線性范圍為016g/mL,相關(guān)系數(shù)為0.999 4,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%1.32%,樣品加標(biāo)回收率為95.3%103%。Guttieri等利用鉬藍(lán)顯色法從EMS誘變后代中篩選出了低植酸的小麥突變株系,低植酸特性改變了麥粒中的總磷量分布,增加中央胚乳磷含量的同時減少了麩皮中磷的含量,突變型麩皮中的無機(jī)磷比野生型增加了4倍。楊宋蕊利用鉬藍(lán)顯色法篩選出2個EMS誘變小麥籽粒高無機(jī)磷突變體HIP-y1和HIPh1。秦麗燕等利用鉬藍(lán)比色法測定了570份普通小麥品種(系)和近緣種雜交后代株系,以及4個普通小麥雜交組合后代株系的籽粒無機(jī)磷含量,

5、結(jié)果發(fā)現(xiàn),這570份材料的籽粒無機(jī)磷含量主要分布在0.46 0.93g/mg之間,低無機(jī)磷(低于0.15g/mg)和高無機(jī)磷(高于0.93g/mg)的材料都比較少,分別只占材料總數(shù)的3.16%和1.23%。4個雜交組合群體無機(jī)磷含量的平均值分別為0.65、0.59、0.45和0.58g/mg,與其親本材料含量相仿。目前報道側(cè)重于小麥籽粒植酸含量或無機(jī)磷含量的研究。本研究采用三氯化鐵比色法和鉬藍(lán)比色法同時對92份小麥品種(系)全麥粉的植酸和無機(jī)磷含量進(jìn)行測定和分析,同時考查它們與千粒重和容重的相關(guān)性,旨在分析小麥籽粒植酸含量和無機(jī)磷含量的分布以及兩者之間的關(guān)系,從而為小麥營養(yǎng)品質(zhì)分析、小麥種質(zhì)資

6、源篩選和品質(zhì)育種提供參考。1、材料與方法1.1材料92份小麥品種或品系于2010/2011年度種植于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站試驗(yàn)田。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每小區(qū)4行,行長2m,行距25cm,3次重復(fù)。待植株成熟后,收獲各個小區(qū)的小麥籽粒。各品種(系)籽粒于2011年夏收獲后,及時晾曬,在室內(nèi)進(jìn)行考種。達(dá)到安全含水量后后熟3個月,手工磨制全麥粉,每份約5g。1.2精密儀器和藥品規(guī)格本研究室內(nèi)使用儀器為航天二院;生產(chǎn)的航天之星ZS-3板式酶標(biāo)儀。所用藥品純度均為分析純。1.3方法1.3.1無機(jī)磷含量的測定小麥籽粒全麥粉的無機(jī)磷含量測定采用鉬藍(lán)比色法,具體參照Dorsch等9的方法進(jìn)行,略有修改,具體

7、操作如下:準(zhǔn)確稱取90mg全麥粉置于2mL離心管中,加入900L 10.4mol/L的鹽酸,漩渦震蕩30min后,置于4 冰箱過夜提取。次日,漩渦震蕩30s后,6 000r/min離心2min,上清即為無機(jī)磷提取液。取10L提取液于96孔酶標(biāo)板中(同時將磷標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對照),加100L水和100L顯色液,其他樣品均加入90L蒸餾水和100L顯色液,室溫下反應(yīng)1h后,放入酶標(biāo)儀中在410nm波長下測定OD值。顯色液由3mol/L硫酸、25%鉬酸銨、10%抗壞血酸、蒸餾水按1112配置而成。磷標(biāo)準(zhǔn)樣品用磷酸氫二鉀配制,含磷量分別是0、0.50、0.46、0.93和1.39g/mg。每個樣品重復(fù)測定

8、3次,取其平均值。1.3.2植酸含量的測定小麥籽粒全麥粉的植酸含量測定采用三氯化鐵比色法,具體參照傅啟高等的方法進(jìn)行,略有修改,具體操作如下:稱取 樣品2.0g,加入40 mL1.2%HCl&10%Na2SO4溶液于室溫下攪拌浸提2h,8 000r/min離心15min,取上清液于4冰箱中備用。取0.1g/L植酸標(biāo)準(zhǔn)液分別0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4mL于10mL玻璃試管中,加蒸餾水3.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.6mL配成標(biāo)準(zhǔn)曲線,搖勻;取植酸提取液2 mL,加入15% TCA2mL,于10mL硬質(zhì)玻璃試管中混勻,4 冰箱中靜置2h后,8 000r/

9、min離心15min。吸取上清2mL,用0.75mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.06.5,加蒸餾水至30mL,混勻,分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液150L于酶標(biāo)板中,加入50L 0.3%磺基水楊酸&0.03% FeCl3&6H2O,混勻后放入酶標(biāo)儀在500nm處測定OD值。1.3統(tǒng)計(jì)方法使用Excel軟件分析各品種(系)植酸含量以及無機(jī)磷含量的極大值、極小值和平均值。并通過Excel圖表軟件繪制品種(系)間籽粒植酸酸、無機(jī)磷含量、容重及千粒重的頻率分析柱狀圖。2、結(jié)果與分析2.1小麥籽粒無機(jī)磷含量的變異采用鉬藍(lán)比色法對92份小麥品種(系)籽粒的無機(jī)磷含量進(jìn)行了測定,結(jié)果(圖1)表明,在所測品種

10、中無機(jī)磷含量為0.421.60g/mg,平均值為0.84g/mg,變異系數(shù)是0.24。籽粒無機(jī)磷含量在0.150.93g/mg的材料占參試材料的73.9%,籽粒無機(jī)磷含量高于0.93g/mg的材料占參試材料的26.1%。說明無機(jī)磷含量在所測品種間變異范圍較大,呈近正態(tài)分布。其中高無機(jī)磷材料(高于0.93g/mg)分別是農(nóng)大5688、百農(nóng)64、晉麥80和宋3744等材料。2.2小麥籽粒植酸含量的變異采用三氯化鐵比色法對92份小麥品種的籽粒植酸含量進(jìn)行了測定,結(jié)果(圖2)表明:在所測品種中植 酸含量為17.5428.71g/mg,平均值為23.27g/mg,變異系數(shù)是0.09,變異范圍較小,呈正態(tài)

11、分布。籽粒植酸含量在1327g/mg的中等植酸含量品種占參試材料的95%,籽粒植酸含量高于27g/mg的高植酸材料占參試材料的5%,分別是晉麥80、農(nóng)大5225、百農(nóng)64、濟(jì)麥5319和宋3744。2.3小麥籽粒植酸含量、無機(jī)磷含量與容重、千粒重的相關(guān)性對92份材料籽粒植酸含量、無機(jī)磷含量與千粒重、容重的相關(guān)性進(jìn)行了分析,結(jié)果(表1)表明:植酸含量與其容重顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r為-0.209 2),而與其千粒重的相關(guān)系數(shù)較小、沒有達(dá)到顯著水平,說明容重會顯著影響植酸含量,容重越低則植酸含量越高;而千粒重對植酸含量的影響很小。小麥籽粒的無機(jī)磷含量與其容重顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.231 5),與其千

12、粒重顯著正相關(guān) (r=0.255 4),說明容重、千粒重會顯著影響籽粒無機(jī)磷含量,容重越低(或千粒重越高)則無機(jī)磷含量越高。小麥籽粒植酸含量與間接法測定的小麥籽粒無機(jī)磷含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.479 6)。2.4小麥籽粒植酸含量、無機(jī)磷含量和總磷含量近似值的分布趨勢根據(jù)蘇琪等換算植酸磷的方法,用已測定的植酸含量,間接估算出植酸磷含量,并將植酸磷和無機(jī)磷相加得到總磷含量近似值。按照植酸磷含量從低到高的順序繪制散點(diǎn)圖,以分析三者在材料間的分布趨勢(圖3),結(jié)果表明:無機(jī)磷含量在材料間變化幅度比較大,植酸磷含量在材料間的變化幅度比較小;總磷含量近似值在不同材料間并非穩(wěn)定不變(極大值為9.69g/

13、mg,極小值為5.54g/mg,變異系數(shù)是0.10),其變化幅度介于植酸磷和無機(jī)磷之間,且總磷含量主要取決于植酸磷含量。因而不同品種(系)間的植酸含量不能簡單地用無機(jī)磷含量來反映。3、討論常用的植酸測定方法有2種:間接測定法(測定無機(jī)磷含量)和直接測定法(測定植酸含量)。由于測定無機(jī)磷簡單易行,目前大多數(shù)研究都用這種方法來間接測定植酸含量,也被廣泛用來進(jìn)行低植酸品種的篩選。因?yàn)橹参锏目偭琢勘３植蛔?在總磷一定的情況下,植酸磷含量的降低通常伴隨著無機(jī)磷含量的增加,所以植酸含量低的種子相對而言無機(jī)磷含量較高,反之,無機(jī)磷含量低的種子對應(yīng)的植酸含量較高。但是由于種子大小,籽粒飽滿度及種植地點(diǎn)和年份的

14、差異,植物種子總磷的含量會有所差別,這種間接測定結(jié)果可信度就會降低。結(jié)合孫潔等測定玉米植酸含量時的研究結(jié)果和本研究結(jié)果,間接法測定無機(jī)磷含量數(shù)據(jù)和直接法測定植酸含量數(shù)據(jù)具有較顯著差異,所以間接法所測結(jié)果不能用于實(shí)際數(shù)值,但是可供參考。在低植酸突變體篩選時,因?yàn)橥蛔儾粫斐煽偭缀亢图?xì)胞磷的變化,所以無機(jī)磷的高低能夠間接反映植酸含量的變化,然后用直接法進(jìn)行進(jìn)一步分析。植酸是禾谷類作物中含磷最豐富的化合物,占種子全磷量的75%,無機(jī)磷一般占全磷的2% 8%,所以理論上植酸含量高的品種(系)對應(yīng)的總磷含量應(yīng)該不低,無機(jī)磷含量也相對較高。本研究中直接法測定的植酸含量和間接法測定無機(jī)磷含量存在極顯著的正

15、相關(guān)關(guān)系,這與之前李興林的研究結(jié)果正好相反?？赡芤?yàn)樗貌牧喜煌瑢?dǎo)致,李興林研究所用材料為市場所售特級面粉,而本研究所用材料為普通小麥品種(系)全麥粉,由于麩皮中存在大量植酸,所以在普通品種中篩選低植酸材料的時候不能用無機(jī)磷作為篩選指標(biāo)。影響植酸含量差異的原因包括不同品種的遺傳基因、種植地區(qū)、年份、耕作條件不同以及測定方法差異。本研究中間接法和直接法測定結(jié)果的差異說明,在普通品種而不是突變?nèi)后w中篩選低植酸材料時,應(yīng)該避免用間接測定無機(jī)磷方法作為篩選低植酸品種(系)的標(biāo)準(zhǔn),因?yàn)槠胀ㄆ贩N總磷含量差異非常大,無機(jī)磷不能間接反映植酸含量高低。而直接法所得結(jié)果相對于間接法來說,更加真實(shí)可靠,可以用于接下來的遺傳、分離規(guī)律和相關(guān)基因檢測方面的研究。