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1、DXS6804基因座等位基因分型標準物的克隆制備及其群體遺傳學研究 　　　　目的 用分子克隆技術制備DXS6804基因座等位基因分型標準物，并用于中國云南普米族人群的群體遺傳學研究，解決長期困擾短串聯(lián)重復序列分型上存在的準確性和標準化問題。方法 用PCR擴增出DXS6804基因座的各等位基因片段，PCR產(chǎn)物克隆后，DNA測序證實插入片段的大小和結構，按國際標準進行命名后，經(jīng)擴大培養(yǎng)、擴增及再鑒定后，制備出該基因座的等位基因分型標準物，進行群體研究。結果 調查了中國云南地區(qū)普米族人群基因座的基因型分布頻率，發(fā)現(xiàn)DXS6804基因座兩個分型標準物外等位基因。結論 分子克隆技術是

2、制備等位基因分型標準物的可靠方法，DXS6804基因座是一個適合我國法醫(yī)學和群體遺傳學分析的遺傳標記。 等位基因分型標準物；短串聯(lián)重復序列；遺傳多態(tài)性 　　Study on the construction of standard DXS6804 allelic laddervia molecular cloning and its genetic polymorphism　in Chinese yunnan pumi populations 　　ABSTRACT: ObjectiveTo resolve the problem of the accuracy and sta

3、ndardization of STRPCR typing in forensic practice, construct DXS6804 allelic ladder by molecular clonning and apply them in a population study on the Pumi population in Yunnan, China. MethodsPCR was used to produce several different allelic fragments of the locus. After cloning the PCR products, t

4、he recombinant plasmids were sequenced. Then we denominated them and used them as template for reamplification to generate the locus standard ladder. ResultsThe sequencing results confirmed that the size and the construction of the inserts were correct. The genetic polymorphisms of this locus in Yu

5、nnan Pumi population of China were studied. Two offladder alleles of DXS6804 locus were found. ConclusionThis method is of high value for forensic DNA typing to construct standard ladders. DXS6804 is robust for genetic research and forensic application. 　　KEY WORDS: allelic ladder; short tandem

6、repeats; genetic polymorphism 　　短串聯(lián)重復序列(short tandem repeats, STR)是一類在人類基因組中分布廣泛并且具有高度多態(tài)性的遺傳標記。具有分型檢測所需檢材量少、尤其適合降解DNA的擴增等優(yōu)點，被廣泛應用于法醫(yī)學個體識別和同一認定以及民事案件中的親權鑒定[12]。特別是X染色體STR基因座，具有擴增片段短、等位基因多、分型方法簡單、多態(tài)信息含量高的優(yōu)點，更受到格外關注。而且它特別適用于法醫(yī)學實踐中在母方缺如(去世或失蹤)情況下兄弟姐妹的親權鑒定，另外，也可以作為性別的輔助鑒定，為法醫(yī)學研究提供了一種新的工具。但是，由于目前已知的X染

7、色體多態(tài)性遺傳標記的數(shù)量較少，適用于法醫(yī)學的更少，而且其研究方法還處于摸索階段[3]。　　等位基因分型標準物(allelic ladder)是人群中常見的等位基因混合物，用來與未知樣品比對確定基因型。只有具備了一套精確的、國際標準化命名的標準參照物，才有可能對STR分型結果作出正確的判型和命名,STR數(shù)據(jù)才能在各實驗室之間進行交流和合作[4]。為此，我們應用分子克隆技術，在國內(nèi)外首先制備出DXS6804基因座的等位基因分型標準物。應用自制的等位基因分型標準物，首次調查了中國云南地區(qū)普米族人群基因型分布頻率，評價該基因座在法醫(yī)學和群體遺傳學中的應用價值。 　　1對象與方法 　　1.1

8、對象 　　1.1.1樣本遵循知情同意原則，隨機抽取中國云南地區(qū)100名普米族(其中女性49名)群體中無親緣關系個體的靜脈血，EDTA抗凝，-70℃保存。 　　1.1.2引物引物序列查自GenBank(表1)，由奧科公司合成。 　　1.1.3試劑2X Taq polymerase mix和DH5α感受態(tài)細胞(天為時代公司)；質粒純化試劑盒(Qiagen公司)；pGEMT Easy Vector SystemⅠ(美國Promega公司)；聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒(Biospin公司)；EDTA等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。 　　1.1.4儀器臺式高速離心機(德國Her

9、mle公司)；微量可調加樣器(10、20、50、100、200、1000μL)(法國Gilson公司)；三相恒壓電泳儀(美國Bi aRad公司)；干熱器(美國Bellco公司)；旋渦混勻器(日本Tomy kogyo公司)；超凈工作臺(中國揚州醫(yī)療設備廠)；低溫冰箱(-30℃，-70℃)(日本Sanyo公司)；ABI3730自動測序儀(美國ABI公司)。 　　1.2方法 　　1.2.1制備標準分型物模板DNA通過Chelex100法[5]提取云南普米族群體樣本DNA，PCR擴增。反應體系：總體積13μL， 2Taq polymerase mix 6μL，引物1μL(5nmol/L

10、)，DNA 2μL，H2O 2μL。反應條件見表1?！　∮米冃跃郾０纺z電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，銀染顯色[67]。從群體樣本的擴增產(chǎn)物中，選出了9個不同大小片段長度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒純化各個片斷，制備成PCR再擴增的模板。 　　1.2.2PCR再擴增、產(chǎn)物鑒定及純化將制備好的9份DNA進行擴增，反應體系及條件如前。擴增產(chǎn)物進行電泳、銀染后再確定其片段大小，并進行純化。 　　1.2.3PCR產(chǎn)物的克隆采用pGEMT Easy Vector SystemⅠ克隆試劑盒，將純化后的PCR片段直接插入質粒的多克隆位點。重組后的質粒轉化DH5α感受態(tài)細胞，選

11、擇培養(yǎng)，再用以上的擴增方法篩選出含有正確插入片段的克隆。 　　1.2.4重組質粒的DNA測序采用ABI3730全自動遺傳分析儀，以質粒公用的M13正向引物對重組質粒的插入片段進行測序，確定插入片段的大小及組成，以國際法庭血液遺傳學學會(international society of forensic haemogenetics, ISFH)推薦的命名原則進行各等位基因命名[89]。 　　1.2.5重組質粒的擴大培養(yǎng)及保存對經(jīng)測序證實的含有正確等位基因插入片段的質粒擴大培養(yǎng)。提取質粒后,得到該基因座的等位基因分型標準參照物的重組質粒。菌液加甘油后，-70℃保存。 　　1.2

12、.6等位基因分型標準物的制備和再鑒定以含該基因座等位基因插入片段的重組質粒DNA為模板,進行PCR擴增，反應體系及條件如前。純化該基因座各等位基因的PCR產(chǎn)物，混合制備成等位基因分型標準物,通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，驗證所得分型標準物的可用性?！　⒂梅肿涌寺〖夹g制備出的DXS6804基因座等位基因標準分型物用于云南地區(qū)普米族群體的遺傳學研究。 　　1.2.7數(shù)據(jù)分析利用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件計算該基因座等位基因片段的頻率和基因型頻率。利用χ2檢驗進行HardyWeinberg平衡吻合性檢驗[10]。根據(jù)等位基因和等位基因型頻率，分別計算雜合度(H)、個人識別力(DP)、多態(tài)信息量(PIC)[1112]。