《miRNA原位雜交技術(shù)的諸多影響因素分析》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《miRNA原位雜交技術(shù)的諸多影響因素分析（4頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、miRNA原位雜交技術(shù)的諸多影響因素分析 　　MicroRNA(miRNA,miR)是廣泛存在于生物個(gè)體的一類非蛋白編碼小分子RNA。作為動(dòng)植物體內(nèi)的重要調(diào)控分子,miRNAs與細(xì)胞的基因表達(dá)、個(gè)體發(fā)育、組織分化等一系列生理、病理過程密切相[1,2]關(guān)。 　　因能進(jìn)行定性、半定量及定位分析,在異質(zhì)性明顯的組織標(biāo)本中,miRNA原位雜交(miRNA in-situhybridization,MISH)技術(shù)不僅具有較其他常規(guī)miRNA分析方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn),同時(shí),由于miRNA具有不易降解而在石蠟包埋組織中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在的特性,使得MISH技

2、術(shù)在臨床科研中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注[3,4]。然而,常規(guī)MISH操作仍然受到多重因素的影響,包括臨床標(biāo)本的組織來源、保存時(shí)間;組織切片的厚度;蛋白酶K的濃度、孵育時(shí)間;探針的濃度、孵育時(shí)間、特異性;顯色方式等。為此,對(duì)影響MISH技術(shù)操作的諸多因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討,有助于該方法的建立、完善并在科研工作中廣泛應(yīng)用。 　　材料和方法　　　　1.材料原位雜交實(shí)驗(yàn)中的石蠟組織均來源于南昌大學(xué)附屬感染病醫(yī)院病理科。所有石蠟組織均常規(guī)4%中性甲醛固定、石蠟包埋,經(jīng)HE染色證實(shí)其病理類型。 　　2.試劑U6和miR-375地高辛標(biāo)記探針及其相關(guān)原位雜交檢測(cè)試劑購(gòu)自丹麥Exiqon公司,原位雜交封閉液與洗

3、滌液購(gòu)自美國(guó)Roche公司;TrizolRNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;miRNA逆轉(zhuǎn)錄與PCR引物購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBRPremixExTaqTM)購(gòu)自日本Takara公司。 　　3.原位雜交原位雜交使用的液體試劑均需用0.1%DEPC水配制。組織切片原位雜交步驟如下:石蠟包埋組織切片后脫蠟,于37℃蛋白酶K消化15min,漂洗后梯度乙醇脫水。 　　55℃恒溫預(yù)雜交1h后,地高辛標(biāo)記的miRNA探針55℃恒溫雜交

4、1h。堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1h,NBT/BCIP暗處30℃顯色。爬片細(xì)胞原位雜交步驟如下:培養(yǎng)后的爬片細(xì)胞用37℃預(yù)溫PBS漂洗三次后,4%中性甲醛固定5min。蛋白酶K消化與雜交過程與組織切片一致。 　　NBT/BCIP暗處30℃顯色后伊紅復(fù)染顯示細(xì)胞基本形態(tài)。雜交過程選擇U6探針以及用未添加探針的雜交液處理的組織、細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定:U6呈藍(lán)色或藍(lán)紫色顆粒的陽性信號(hào)定位于細(xì)胞的胞核;miR-375呈藍(lán)色或藍(lán)紫色顆粒的陽性信號(hào)定位于細(xì)胞胞質(zhì)和核仁。 　　4.細(xì)胞培養(yǎng)三株人乳腺癌細(xì)胞株BT549、T47D和MDA-MB-231均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞

5、庫(kù),三株細(xì)胞均選擇含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 　　5.RNA提取、miRNA逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)定量PCRRNA提取按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthe-sisKit說明書進(jìn)行。按照SYBRPremixExTaqTM的操作說明,以U6為內(nèi)參照,使用ABI7500FastReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems,美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng),每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔。采用公式2-ΔCt(ΔCt=CtmiR-375–CtU6)計(jì)算mi

6、R-375的相對(duì)表達(dá)量。 　　結(jié)果 　　1.不同保存時(shí)間和組織來源的石蠟切片U6探針的原位雜交選擇1990-2013年不同時(shí)間保存的多個(gè)乳腺、肺臟、肝臟組織,分別以未添加探針、添加U6探針的雜交液行原位雜交。結(jié)果顯示:來源于不同時(shí)間保存的三種組織均有U6顯色,保存時(shí)間越短的組織顯色效果越好。其中乳腺組織切片75593與肝臟組織切片5060的U6表達(dá)最高,顯色最好。以乳腺組織切片75593為例,陰性對(duì)照的乳腺腺上皮胞核顯紅色;U6探針雜交結(jié)果為乳腺腺上皮胞核顯藍(lán)紫色(圖1)。 　　2.不同厚度組織切片的U6探針的原位雜交選擇U6表達(dá)最高的乳腺組織切片75593與肝臟組織切片5060的4μm

7、和6μm切片分別進(jìn)行原位雜交分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:組織標(biāo)本切片越薄,雜交過程中越不易掉片,4μm和6μm厚度的組織切片原位雜交染色未見明顯差異(圖2)。 　　3.不同濃度的蛋白酶K對(duì)組織切片U6探針原位雜交的影響分別選擇2、20和200μg/ml的蛋白酶K,在37℃孵育乳腺組織切片75593與肝臟組織切片5060后,行U6探針的原位雜交。結(jié)果顯示,在乳腺組織切片75593中,20μg/ml的蛋白酶K作用組較其他組的原位雜交顯色更深,效果最好;在肝臟組織切片5060中,200μg/ml的蛋白酶K作用組的顯色最佳(圖3)。 　　4.不同濃度的蛋白酶K對(duì)爬片細(xì)胞的U6探針原位雜交的影響分別選擇2、

8、20和200μg/ml的蛋白酶K,對(duì)乳腺癌MDA-MB-231爬片細(xì)胞行U6探針原位雜交。 　　結(jié)果顯示,20μg/ml與200μg/ml濃度的蛋白酶K,于37℃孵育爬片細(xì)胞15min后,大部分細(xì)胞均因消化過度而喪失細(xì)胞基本形態(tài)并脫落;在2μg/ml濃度的蛋白酶K作用后,細(xì)胞能保持基本形態(tài)并呈現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)特異性藍(lán)紫色顯色(圖4)。 　　5.爬片乳腺癌細(xì)胞的miR-375探針原位雜交選擇BT-549和T47D兩株乳腺癌的爬片細(xì)胞行miR-375探針原位雜交檢測(cè),結(jié)果顯示,miR-375主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)與核仁,BT-549的miR-375表達(dá)明顯低于T47D(圖5)。 　　6.實(shí)時(shí)定量RT-P

9、CR分析乳腺癌細(xì)胞的miR-375表達(dá)實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)BT-549和T47D兩株乳腺癌細(xì)胞miR-205表達(dá)分析,結(jié)果顯示,BT-549的miR-375表達(dá)明顯低于T47D(圖6)。 　 　　討論 　　定性或定量檢測(cè)miRNAs表達(dá)的分析方法多種多樣,從原理上主要分為兩大類:基于探針雜交和基于擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法。Northernblotting是基于探針雜交分析中的經(jīng)典方法,也是miRNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。然而,盡管經(jīng)過多次改良,該方法仍無法避免樣本需求量大、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)[6,7]?；跀U(kuò)增技術(shù)的方法中,實(shí)時(shí)定量PCR法是現(xiàn)階段使用最為普遍的方法。這種方法的特異性和靈敏

10、性都很高[8],但與其他基于擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法一樣,該方法存在因PCR擴(kuò)增后失真miRNA的真實(shí)表達(dá)信息的缺陷。近年來,miRNA分析中,高通量微陣列芯片(Microarray)和第二代測(cè)序技術(shù)獲得了更多的關(guān)注[9-12]。然而,由于高通量檢測(cè)的成本較高[13],且由于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析能力的欠缺,兩種方法的全面普及尚需時(shí)日。由于miRNA在石蠟組織標(biāo)本中不容易被降解而長(zhǎng)期穩(wěn)定存在,在臨床標(biāo)本的分析中,利用石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行MISH分析越來越多地受到科研人員的青睞。 　　為此,通過探索MISH技術(shù)的各種影響因素,建立并完善具備定性、半定量以及定位信息的MISH方法,對(duì)臨床組織標(biāo)本進(jìn)行

11、分析將為miRNA的研究帶來更多的便利。 　　考慮到影響實(shí)驗(yàn)操作的各變量因素之間相互關(guān)聯(lián)(如探針的濃度影響探針的孵育時(shí)間)以及實(shí)驗(yàn)便利、節(jié)約等原則,在初步建立MISH方法后,通過固定操作中的部分次要變量因素(蛋白酶K的孵育時(shí)間15min、探針的孵育時(shí)間1h、顯色方式NBT/BCIP),對(duì)其他主要變量因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探討。 　　臨床組織標(biāo)本是miRNA與人類疾病關(guān)聯(lián)研究中的重要資源。現(xiàn)階段,醫(yī)院病理科保存標(biāo)本多為4%中性甲醛固定的石蠟包埋標(biāo)本,常規(guī)HE染色切片多為5μm厚度切片。為確認(rèn)MISH方法是否適用于常規(guī)切片標(biāo)本的分析,本文選擇不同保存時(shí)間段的乳腺、肺臟、肝臟的組織,以未添加探針和添加U

12、6探針的雜交液處理的組織切片作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照進(jìn)行U6探針的原位雜交分析。結(jié)果顯示: 　　1)來源于三種組織的多個(gè)標(biāo)本均有胞核內(nèi)U6顯色,但因U6的表達(dá)與分布并不均衡,在不同標(biāo)本來源的切片中顯色程度存在差異;2)來源于1990-2013年保存的石蠟組織標(biāo)本均能顯色,保存時(shí)間越短的組織顯色效果越好;3)4-6μm厚度的組織切片原位雜交染色未見明顯差異。以上結(jié)果表明,由于miRNA分子短小,不容易降解,原位雜交操作完全能在常規(guī)固定并長(zhǎng)期保存的多種組織來源的石蠟標(biāo)本上操作。 　　原位雜交操作中最主要的兩個(gè)變量因素是蛋白酶K與探針的濃度。原位雜交中蛋白酶K的作用是通過部分消化細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜,

13、暴露核酸分子,使得探針能順利地與胞質(zhì)、胞核內(nèi)的核酸分子結(jié)合。蛋白酶K最適濃度的選擇主要與標(biāo)本的來源、固定時(shí)間以及蛋白酶K的孵育時(shí)間有密切的關(guān)系。如果消化作用不到位,雜交信號(hào)將會(huì)減弱;消化作用過度,輕則使得雜交信號(hào)因彌散而減弱,重則會(huì)造成組織的脫片[14-16]。為此,在此次實(shí)驗(yàn)中,分別選擇2、20和200μg/ml的蛋白酶K與U6顯色最強(qiáng)的乳腺組織切片75593、肝臟組織切片5060以及MDA-MB-231爬片細(xì)胞孵育15min后,行U6探針的原位雜交。結(jié)果顯示,在乳腺組織切片75593中,20μg/ml的蛋白酶K作用組較其他組的原位雜交顯色更深,效果最好;在肝臟組織切片5060中,200μg

14、/ml的蛋白酶K作用組的顯色最佳。爬片細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)中,20μg/ml與200μg/ml濃度的蛋白酶K作用組中,大部分細(xì)胞均因消化過度而喪失細(xì)胞基本形態(tài)并脫落;2μg/ml濃度的蛋白酶K作用組中,細(xì)胞能保持基本形態(tài)并呈現(xiàn)特異性藍(lán)紫色顯色。原位雜交中探針濃度的選擇主要與探針的長(zhǎng)度、標(biāo)記方式、孵育時(shí)間、靶核酸分子的胞內(nèi)豐度等因素有關(guān)。探針濃度過低可能造成雜交信號(hào)減弱,探針濃度過高則造成不必要的浪費(fèi)[17,18]。為此,在探針合成公司推薦的探針使用濃度范圍內(nèi),此次實(shí)驗(yàn)分別選擇了低、中、高三個(gè)濃度進(jìn)行了摸索,發(fā)現(xiàn)U6與miR-375的原位雜交最適濃度分別為1ng/ml和100ng/ml。 　　以上

15、結(jié)果說明,原位雜交中主要變量因素的選擇受多種因素的影響,依據(jù)標(biāo)本的組織或細(xì)胞來源、標(biāo)本的固定時(shí)間,并參照操作說明分組預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定主要變量因素是非常必要的。 　　現(xiàn)有研究表明,使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)組織的miRNA分析結(jié)果常常與原位雜交分析結(jié)果并不一致[19-24]。造成這種情況的原因,一方面可能是諸如標(biāo)本來源不同、標(biāo)本容量較小以及組織標(biāo)本異質(zhì)性等因素;另一方面,實(shí)時(shí)定量RT-PCR過程中的引物,尤其是原位雜交探針的特異性常常被忽略了。 　　考慮到組織的異質(zhì)性可能造成原位雜交與實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果存在差異,為驗(yàn)證探針的特異性,在異質(zhì)性較小的細(xì)胞水平上進(jìn)行操作更為可靠。本次實(shí)驗(yàn)中,選擇了2株乳腺癌細(xì)胞分別進(jìn)行miR-375的實(shí)時(shí)定量RT-PCR和爬片細(xì)胞原位雜交分析。 　　結(jié)果顯示,兩種分析方法均發(fā)現(xiàn)BT-549的miR-375表達(dá)明顯低于T47D,間接說明miR-375探針的特異性。為此,在細(xì)胞水平上,結(jié)合實(shí)時(shí)定量RT-PCR的檢測(cè),對(duì)雜交探針的特異性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是非常必要的。這為后續(xù)使用該探針在組織與細(xì)胞水平上的原位雜交分析提供了保障。 　　綜上所述,通過前期實(shí)驗(yàn)確定各種變量因素而建立并完善的MISH技術(shù),為闡明miRNA的作用機(jī)制提供了更為便利的條件。