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1、第五模塊 生物檢測(cè)技術(shù) 第九章 藥品的生物檢定法 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 知識(shí)目標(biāo) 理解熱原檢查法、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的含義； 掌握無菌檢查法、微生物限度檢查的主要方 法；理解藥物異常毒性檢查的方法 技能目標(biāo) 能檢查藥物制劑的熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素；能進(jìn) 行藥物的無菌檢查；能測(cè)定藥物的微生物限 度；能檢查藥物的異常毒性 學(xué)習(xí)目標(biāo) 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 復(fù)習(xí)提問 1什么是管碟法？管碟法操 作的主要流程？ 2雙碟的制備方法？ 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 新課大綱 本節(jié)主要內(nèi)容： 熱原檢查 : 1.簡(jiǎn)述

2、 2.具體操作方法 內(nèi)毒素檢查 : 1.簡(jiǎn)述 2.具體操作步驟 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 一、概 述 用整體動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)或離休 器官、組織、細(xì)胞等的體外試驗(yàn)來測(cè)定 藥品生物活性，以反映其臨床功能及效 價(jià)的一種方法。 1.生物檢定法 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 常見藥物 的生物檢 定法 肝素 絨促性素 縮宮素 胰島素 洋地黃 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 二、熱原檢查法 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 含熱原的注射液注入家兔體 內(nèi)，引起體溫升高 40度以上， 甚至出現(xiàn)昏迷

3、、休克、死亡 的現(xiàn)象。 2.什么是熱原反應(yīng)？ 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 3.熱原的基本性質(zhì)？ 水溶性、不揮發(fā)性、 耐熱性、濾過性 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 4.污染途徑 溶劑帶入 原料帶入 容器用具帶入 制備過程污染 使用帶入 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 5.除去方法 吸附法、離子交換法、 反滲透法、超濾、高溫、 酸堿 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 6.檢查方法 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 7.具體 步驟 靜脈注入藥物，觀察家兔體溫升

4、 高情況，超過限度認(rèn)為有熱原反 應(yīng) 供試用家兔 試驗(yàn)前的準(zhǔn)備 檢查法 結(jié)果判斷 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 3只兔： 1小時(shí)測(cè) 1次，共 3次， 最高 -最低升高的溫度 結(jié)果 ：均升高在 0.6度以下 且升高的總數(shù)在 1.4以下 認(rèn)為符合規(guī)定 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 智能熱原儀 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 溫度探頭 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 本法是利用鱟試劑來檢測(cè)或量化由革 蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（

5、單位 以 EU表示），以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi) 毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝 膠法和光度測(cè)定法。 三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測(cè)或 半定量?jī)?nèi)毒素的方法。 分為濁度法和顯色基質(zhì)法。 濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁 度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法?？煞譃榻K點(diǎn)濁度 法和動(dòng)態(tài)濁度法。 顯色基質(zhì)法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中 產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè) 定內(nèi)毒素含量的方法?？煞譃榻K點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯 色法。 凝膠法 光度測(cè)定法 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)

6、習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 內(nèi)毒素與鱟試劑起 反應(yīng)產(chǎn)生凝膠，觀 察到渾濁。 什么是鱟試 劑 ？ 什么是細(xì)菌內(nèi) 毒素 ？ 1.凝膠法原理 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 來源： G-細(xì)胞壁外膜上 的脂多糖 （ LPS）成分， 所以內(nèi)毒素是化學(xué)成分不 是簡(jiǎn)單的生命體，所以滅 內(nèi)毒素時(shí)應(yīng)與其他成分區(qū) 分。 什么是細(xì)菌內(nèi)毒素？ 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 化學(xué)結(jié)構(gòu)： a b c a(o特異性多糖鏈 )類似于抗原，親水 性 b 核心多糖 c類脂 A，疏水性，是生理活性中心 ， 實(shí)驗(yàn)證明，將 a 和 b 切下來組合后與 c部分

7、產(chǎn)生的效果相當(dāng)，所以認(rèn)為 c是 生理活性部位。 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 特點(diǎn) ：根據(jù)其特殊結(jié)構(gòu)， 疏水基團(tuán)易粘合在容器的器 壁，而在水中的濃度就變低， 另一方面疏水端相連結(jié)后， 親水端再與別的疏水端相連 而成大的集團(tuán)，使其在水中 的分布不均勻，所以藥典規(guī) 定在使用時(shí)要經(jīng)過 振蕩及混 旋 15分鐘 ，并立即做下一步 操作，但這種現(xiàn)象只限于人 工提純品。 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 與熱原的關(guān)系 ：廣義熱原包 括內(nèi)毒素、生物酶、蛋白質(zhì)、 化學(xué)物質(zhì)（后三種成分也有致 熱作用，但不引起器質(zhì)性的病 變），而 狹義的熱原就等于內(nèi) 毒素 （

8、引起器質(zhì)性的病變）。 所以藥品檢測(cè)時(shí)一般認(rèn)為沒有 內(nèi)毒素，合格時(shí)，熱原檢測(cè)也 合格。 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 分類： 分 國家 標(biāo)準(zhǔn)品：（簡(jiǎn)寫 RSE或 NSE）效價(jià)： 9000，單位 Eu,由 中檢所生產(chǎn)，代號(hào) 981就是指 98 年 1月生產(chǎn)。 和 工作 標(biāo)準(zhǔn)品：（ CSE和 WSE） 效價(jià)： 100 200，也有 50或 70， 單位 Eu，到中檢所購買，是法 定試劑。 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 拉丁文 TAL（東方鱟）、 LAL（美洲鱟），血液是藍(lán) 色（還有蟬）。被稱為是活 化石，大約生活在 4億年前 至今，體態(tài)基本

9、沒有變化， 品種有 10多種，但能作為 鱟試劑（血液變形細(xì)胞溶解 物的無菌冷凍干燥品） 用的 只有 3 5個(gè)，主要生活在 日本沿海、中國沿海、北美 沿海，在中國是二級(jí)保護(hù)動(dòng) 物，在日本是特級(jí)保護(hù)動(dòng)物。 不能人工養(yǎng)殖。 什 么 是 鱟 試 劑 ？ 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 發(fā)現(xiàn)： 1962年，美國的一個(gè)研究員 Bang在海灘散步，發(fā)現(xiàn)很多鱟（也叫大 王蟹）死了，他拿針管吸了海水，注入 一個(gè)活鱟體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其很快死亡， 1963 年寫了一篇“鱟的一種致死疾病”文章， 向研究所反應(yīng)，爭(zhēng)取一些經(jīng)費(fèi)以此為主 要研究方向，他的助手年輕人 levin和他 一起研究，發(fā)現(xiàn) G-

10、細(xì)胞壁外膜上的脂多 糖（ LPS）成分引起鱟致死，共同發(fā)表 文章“鱟的酶反應(yīng)機(jī)理”。 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 反應(yīng)機(jī)理 ：鱟試劑中含有 C、 B 因子，在脂多糖存在時(shí)成為激活因 子，使凝血酶原變?yōu)槟?，又?凝固蛋白原變?yōu)槟痰鞍祝ǔ赡z 狀），發(fā)生這樣的生化反應(yīng)。而口 服與輸入血液的劑量相比 100萬倍， 所以人口服內(nèi)毒素不會(huì)發(fā)生發(fā)熱反 應(yīng)，另一方面口服時(shí)人體也有一種 屏障作用。日本認(rèn)為血中 0.1Eu/ml, 就會(huì)有發(fā)熱反應(yīng)。 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 凝膠法的 靈敏度 低： 0.5 Eu/ml，規(guī)格： 0.1 ml

11、定量法高， 0.06Eu/ml，工藝在凝膠法 基礎(chǔ)上發(fā)展而來， 0.6 ml，也有 1.2和 3.1 ml。 檢測(cè)方法區(qū)別： 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 內(nèi)毒素小于 0.03 Eu/ml的無菌 注射用水，鱟試劑反應(yīng)的 PH： 6 8，而工業(yè)生產(chǎn)要求為 PH： 5 7，所以 不能以企業(yè)生產(chǎn) 查用水 ，必須是中檢所指定 生產(chǎn)。藥典規(guī)定凝膠法小于 0.03 Eu/ml，定量法小于 0.005 Eu/ml，買時(shí)要配套， 與鱟試劑買一個(gè)廠家生產(chǎn)的。 關(guān)于檢查用水 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 內(nèi)毒素檢查法 內(nèi)毒素 鱟試劑 檢查用水 學(xué)習(xí)目標(biāo)

12、復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 2.定量分析方法 預(yù)設(shè)限值法： OD為 0.02 什么是 OD? 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 OD： 就是 吸光度 ， 儀器采用透 光率下降到 95%的點(diǎn)作為 反應(yīng)時(shí)間臨界點(diǎn)，將 95% 取負(fù)對(duì)數(shù)正好是 0.02 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 3.實(shí)驗(yàn)前期工作 器材準(zhǔn)備 所需試劑 用具的處理 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 制備鱟試劑 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 生成標(biāo)準(zhǔn)曲線 4.具體操作 示例 頭孢曲松鈉注射液內(nèi)毒素測(cè)定 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱

13、 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 0.2ml 0.2 0.2 0.2 1.8ml水 1.8 1.8 1.8 100Eu/ml 10 1 0.1 0.01 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 制備鱟試劑 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 10支小管分加 0.1ml鱟試劑 8個(gè)管加內(nèi) 毒素標(biāo)準(zhǔn)品 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 生成標(biāo)準(zhǔn)曲線 待最后一個(gè)濃度點(diǎn)的反應(yīng)曲線 超過 0.02限值后，用鼠標(biāo)點(diǎn)中 “手動(dòng)停止檢測(cè)” 點(diǎn)擊 “生成標(biāo)準(zhǔn)曲線” 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 樣品稀釋與加樣 樣品四個(gè)濃度稀釋 8個(gè)陽性管 （如： 40.80.160.320） 平行 2個(gè)，共 8個(gè)管 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 陽性對(duì)照 ：找出最佳稀釋倍數(shù) 算出頭孢曲松鈉內(nèi)毒素濃度 為 0.065Eu/mg, 小于限值 0.2Eu/mg。 結(jié) 果 分 析 陰性對(duì)照： 反應(yīng)時(shí)間遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)曲 線 0.01所用反應(yīng)時(shí)間，陰性合格 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 本課小結(jié) 學(xué)習(xí)目標(biāo) 復(fù)習(xí)提問 新課大綱 新課內(nèi)容 本課小結(jié) 課后習(xí)題 課后習(xí)題 家兔熱原檢查法如何操作？ 濁度法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi) 毒素的具體操作步驟