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1、 免疫組織化學(xué) 和 原位雜交 Immunohistochemistry & In situ hybridization 免疫組織化學(xué) 前提條件：所使用的抗體必須能用于免疫組化。 一、基本原理 ： 利用 抗體（ antibody）與 相應(yīng)抗原（ antigen）的特 異性結(jié)合 , 通過(guò)與抗體連接 的酶反應(yīng)或熒光染料顯示 抗原所在的位置。 二、常用于標(biāo)記抗體的標(biāo)記物 一）酶（ enzyme） 1.辣根過(guò)氧化物酶 （ horseradish peroxidase, HRP） 辣根過(guò)氧化物 酶 的 作用物 （底物， substrate） 1） 二氨基聯(lián)苯胺（ 3,3-diaminobenzidine，

2、 DAB） 顯色特點(diǎn)： - 棕色 -不溶于水及脂類(lèi)溶劑（酒精 ethanol, 二甲苯 xylene） -不擴(kuò)散 -永久保存 2） 3氨基 9乙基卡巴唑（ 3-Amino-9-Ethylcarbazole， AEC） 顯色特點(diǎn)： -棕紅色 -不溶于水，但 溶于 脂類(lèi)溶劑 -容易擴(kuò)散 -不能永久保存 3） 4氯 1萘酚（ 4-Chloro-1-naphthol， CN） 顯色特點(diǎn)： -藍(lán)色 -不溶于水，但溶于脂類(lèi)溶劑 -容易擴(kuò)散 -不能永久保存 4） 四甲基聯(lián)苯胺（ 3,3,5,5-Tetramethylbenzidine,TMB） 顯色特點(diǎn)： -深藍(lán)色 -不溶于水及脂類(lèi)溶劑 -不擴(kuò)散 -永久保

3、存 2.堿性磷酸酶 （ alkaline phosphatase, AP） 堿性磷酸酶的 作用物 （底物， substrate） 1） 四唑淡藍(lán) /5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -磷酸鹽 (Nitro-Blue- Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl- phosphate, NBT/BCIP） 顯色特點(diǎn)： -紫色 -不溶于水但溶于脂類(lèi)溶劑 -容易擴(kuò)散 -不能永久保存 2） 快紅 （固紅 /萘酚磷酸鹽， Fast Red TR/Naphthol AS-MX） 顯色特點(diǎn)： -桃紅色 -不溶于水但溶于脂類(lèi)溶劑 -容易擴(kuò)散 -不能永久保存 3） 快藍(lán) （固藍(lán) B

4、B/萘酚磷酸鹽， Fast Blue BB/Naphthol AS-MX) 顯色特點(diǎn)： -藍(lán)色 -不溶于水但溶于脂類(lèi)溶劑 -容易擴(kuò)散 -不能永久保存 4）品紅（品紅 /萘酚磷酸鹽， Fuchsin/Naphthol AS-TR） 顯色特點(diǎn)： -紅色 -不溶于水及脂類(lèi)溶劑 -不擴(kuò)散 -永久保存 DAB Fast blue Fast red NBT/BCIP AEC 二）熒光染料（ fluorescent dye） 常用的熒光染料 1.異硫氰酸熒光素（ fluorescein isothiocyanate， FITC） 分子量為 389，最大吸收光波長(zhǎng)為 490 495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng) 為 5

5、20 530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，是目前應(yīng)用最廣泛的熒 光素。 2.四甲基異 硫氰酸羅達(dá)明 （ tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC） 分子量為 444，最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為 620nm， 呈現(xiàn)橙紅色熒光。 3.羰花青類(lèi)（ carbocyanine dyes) 熒光較強(qiáng)，不易淬滅，近年來(lái)應(yīng)用廣泛。 4.Alexa Fluor 吸收光波及發(fā)射光波長(zhǎng)范圍廣，也是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。 三）生物素 (維生素 H, Biotin ) 水溶性維生素，屬于維生素 B族。相對(duì)分子量 244， 分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通過(guò)其羧基與被標(biāo)記

6、物的氨基結(jié) 合，可標(biāo)記抗體、酶、激素、核酸、凝集素等， 由于其分子小，不影響被標(biāo)記物的理化和免疫學(xué) 特性。極易于親和素（ Avidin）結(jié)合，形成 親和 素 -生物素復(fù)合物（ Avidin-biotin complex,ABC）因此，常與親 和素一起被用于免疫組化的 ABC方法中。 四）膠體金（ colloidal gold） 又稱(chēng)金溶膠（ gold solution），是指分 散相粒子直徑在 l150nm之間的金溶膠， 能穩(wěn)定又迅速地吸附蛋白質(zhì)， 可以作為 標(biāo)記物標(biāo)記抗體、抗原、激素、核酸等， 在藥物檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域有廣 泛的應(yīng)用，常用于透射電鏡 。 三、組織標(biāo)本的制備 一） 組織標(biāo)

7、本的取材 取材原則 :盡可能快的切取所需組織浸入固定液或快速冰凍 ,保持 組織的新鮮以 最大限度地防止抗原破壞和降解。 二） 固定 （ Fixation):根據(jù)所檢測(cè)抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?和固定方法，固定液用量應(yīng)是標(biāo)本的 40倍。 1.常用的固定劑 (Fixative solution) 1）單純固定劑 丙酮 (Acetone)：主要用于新鮮組織冰凍切片的快速固定，以 檢測(cè)細(xì)胞表面抗原、自身抗體及細(xì)胞內(nèi)外的免疫球蛋白。 甲醇 (Methanol)：與 丙酮相似。 乙醇 (Ethanol):與丙酮相似。 甲醛 (formaldehyde):使用最廣泛的固定劑，有多種劑型，包 括： 福馬林（

8、 formol） :即 10%甲醛水溶液，最常用的固定劑， 適用于各種組織固定。 中性福馬林：含過(guò)飽和碳酸鈣 （ calcium carbonate)的 10%甲 醛水溶液。 緩沖中性福馬林：以磷酸鹽緩沖液配制的 10%甲醛溶液。 4%多聚甲醛（ paraformaldehyde）：以磷酸鹽緩沖液配制的 4%多聚甲醛溶液。 2）復(fù)合固定劑 Bouin氏液：含苦味酸（ nitroxanthic acid）和冰醋酸 （ glacial acetic acid）的甲醛溶液。 Zamboni氏液：含苦味酸和冰醋酸多聚甲醛溶液。 PLP（ periodate-lysine-paraformaldehyd

9、e）：含過(guò)碘酸和賴(lài) 氨酸的多聚甲醛溶液，多用于需預(yù)固定的冰凍組織切片。 2.固定方法： 必須用預(yù)冷（ 4 ）的固定液固定，并保持低溫持 續(xù)固定至所需時(shí)間 。 1）灌注固定（ perfusion fixation）：最好的固定方法，尤其適 用于神經(jīng)組織如腦、脊髓和視網(wǎng)膜。 灌注固定后應(yīng)迅速切取 所需組織，在預(yù)冷的固定液中繼續(xù)浸泡固定至所需時(shí)間。 2） 浸泡固定：最普通和常用的固定方法，適用于除神經(jīng)組織外的 各種組織。 三）包埋和切片（ embedding and section） 1.石蠟切片基本步驟： 1）逐級(jí)乙醇溶液脫水：使組織脫水，便于二甲苯（ xylene）介入 的過(guò)程。時(shí)間的長(zhǎng)短取決于

10、組織塊 的大小及 結(jié)構(gòu)。置 80%以上的 乙醇溶液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使組織變硬變脆，應(yīng)當(dāng)避免。 70% 80% 90% 100%I 100%II 100%III 2）透明： 組織 用二甲苯處理 以便石蠟 介入的過(guò)程，時(shí)間長(zhǎng)短取決 于組織快的大小，但不宜過(guò)長(zhǎng)，以免組織過(guò)硬易脆。 二甲苯 I 二甲苯 II 二甲苯 III 3）浸蠟：組織經(jīng)二甲苯（ xylene）處理后石蠟介入的過(guò)程，時(shí)間 長(zhǎng)短取決于組織快的大小。溫度應(yīng)控制在 56 - 60 。 4）包埋：用模具使組織塊包于石蠟中成型的過(guò)程。 5）修快：將包有組織的蠟塊用刀切去多余的部分，修成一定形狀 的過(guò)程。 6）切片： 將包有組織的蠟塊安裝在切片機(jī)上

11、進(jìn)行切割的過(guò)程。 一 般切 36m。 2.冰凍切片的基本步驟： 1） 固定：根據(jù)所檢測(cè)組織的抗原性質(zhì)決定是否先進(jìn)行固定及選擇 適當(dāng)?shù)墓潭▌?。除非有特殊要求，否則應(yīng)當(dāng) 先進(jìn)行固定以防止 抗原破壞及降解。 常用的固定液是 4%多聚甲醛（ paraformaldehyde） 2）減少組織水分防止冰晶形成 :通常采用高滲的 30%蔗糖 (sucrose) 溶液吸收組織中的水分。 3）包埋：用于 冰凍切片組織的包埋劑 是 OCT ( Cryo Embedding Medium ) 4）切片：將包在 OCT中的組織安裝在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行切割，切 片的厚度一般為 5-20m。 5）后固定：適用于未經(jīng)固定的冰

12、凍組織切片，常用固定液是丙酮 （ acetone)和 4%多聚甲醛。 四）預(yù)防脫片的措施： 1.載玻片的處理： 重鉻酸鉀（ bichromicum Kalium）濃硫酸（ concentrated sulfuric acid）清潔液浸泡 24小時(shí) 充分流水沖洗 去 離子水沖洗 2遍 烘干 2.粘附劑的使用： 2%3氨基乙氧基甲硅烷（ 3-amino propyltriethoxy silane, APES）：適用于石蠟切片的載玻片。 0.1%多聚左旋賴(lài)氨酸（ poly-L-lysine）： 適用于冰凍切片的 載玻片 四、常用的免疫組化方法 一）免疫熒光法（ 應(yīng)注意標(biāo)本中自 發(fā)熒光的影響 ） 1

13、.直接法或一步法 (direct method or one-step staining method) 用標(biāo)記了熒光素的特異性抗體直 接與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原結(jié)合。 優(yōu)點(diǎn)：特異性高 缺點(diǎn)：敏感性低 2.間接法（ indirect method）： 熒光素不是 標(biāo)記在與標(biāo)本中相應(yīng) 抗原結(jié)合的特異性抗體上 ， 而是 標(biāo)記在抗特異性抗體的第二抗體 上。 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高 缺點(diǎn)：特異性低 二）免疫酶法 1.直接法或一步法 (direct method or one-step staining method) 用標(biāo)記了酶的特異性抗體直接與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原結(jié)合，以酶底 物的反應(yīng)顯示抗原的分布 。 2.間接法

14、(indirect method)： 常用的間接法： 1） 兩步法 （ two-step staining method）： 優(yōu)點(diǎn) :敏感性很高，特異性高，不受內(nèi)源性生物素影響。 缺點(diǎn) :背景染色高。 2)過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶 （ peroxidase anti-peroxidase， PAP） 或堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（ alkaline phosphatase anti- alkaline phosphatase, APAAP） method 優(yōu)點(diǎn)：特異性高， 背景染色很低，不受內(nèi)源性生物素影響。 缺點(diǎn)：敏感性相對(duì)低。 3.親和素 -生物素 -過(guò)氧化物酶復(fù)合物 ( avidin-bio

15、tin-eroxidase complex， ABC )或鏈親和素 -生物素 -過(guò)氧化物酶復(fù)合物法 (labelled strepavidin-biotin-eroxidase complex， LSAB) method 是 最廣泛使用但不建議使用的方法， 因?yàn)槟壳吧袩o(wú)去除內(nèi)源性 生物素和親和素的方法。 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，特異性很低。 缺點(diǎn)：極易受內(nèi)源性生物素影響，假陽(yáng)性率極高。 五、免疫組織化學(xué)的特異性與敏感性 一）特異性（ specificity):指免疫組化染色結(jié)果是否真正由特異 性抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合而產(chǎn)生。包括方法特異性和抗體特異性。 1.方法特異性：證明是由抗體結(jié)合引起的結(jié)果。 如：

16、加一抗 - 有染色結(jié)果 不加一抗 - 無(wú)染色結(jié)果 2.抗體特異性：證明是由所檢抗原而非其它成分與一抗結(jié)合引起 的染色結(jié)果。 如：用肝細(xì)胞抗體染肝組織 - 有染色結(jié)果 用肝細(xì)胞抗體染腎組織 - 無(wú)染色結(jié)果 二）特異性染色和非特異性染色 1.特異性染色：由一抗與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而產(chǎn)生的染色。染 色部位是抗原分布的部位，顯示出一定的結(jié)構(gòu)背景，如細(xì)胞核 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，或組織和細(xì)胞內(nèi)的某些特殊成分。 2.非特異性：不是 由一抗與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而引起的染色。 染 色部位與抗原分布的部位無(wú)關(guān)。 3.特異性染色的檢測(cè) 1）設(shè)陽(yáng)性對(duì)照：用已知抗原存在的標(biāo)本對(duì)比所檢測(cè)的標(biāo)本。 2）設(shè)陰性對(duì)照：用已知抗原不

17、存在的標(biāo)本或除去一抗的方法對(duì)比 所檢測(cè)的標(biāo)本。 陰性標(biāo)本 :不存在被檢抗原的標(biāo)本。 空白實(shí)驗(yàn)：組化染色程序中不加一抗。 替代實(shí)驗(yàn)： 組化染色程序中 用同型（ isotype）抗體替代一抗。 吸收實(shí)驗(yàn)：組化染色程序中用過(guò)量相應(yīng)抗原吸收一抗以阻止標(biāo) 本中的抗原與一抗結(jié)合。 三）敏感性 (sensitivity)：指所用的免疫組化方法能檢測(cè)的抗原 量。 1.敏感性與特異性的關(guān)系：一般是相反的關(guān)系。 2.提高敏感性的方法： 選用敏感的免疫組化染色方法： 如 EnVision兩步法， PAP或 APAAP法， ABC法。 選用含有放大作用的酶的免疫組化染色方法： 如堿性磷酸酶（ alkaline pho

18、sphatase）對(duì)底物（ substrate） 的作用隨時(shí)間的增加而增加，可選用含 堿性磷酸酶的 EnVision兩 步法或 APAAP法。 增加抗體的孵育時(shí)間：一般采取 4 過(guò)夜的方式。 四）非特異性染色的來(lái)源及消除 1.標(biāo)本固定不適當(dāng)或不充分 丙酮固定的標(biāo)本，尤其是它的冰凍切片標(biāo)本，有極強(qiáng)的非特異性 染色。應(yīng)選用適當(dāng)?shù)墓潭▌┘俺浞止潭ā?2.染色過(guò)程中切片干燥 應(yīng)用濕盒及防止切片干燥 3.內(nèi)遠(yuǎn)性酶活性未被抑制或消耗 經(jīng)固定的標(biāo)本，其細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶 (peroxidase)和堿性磷酸 酶（ alkaline phosphatase）不會(huì)被滅活，仍保持活性。 過(guò)氧化物酶 - 0.3%H2

19、O2消耗 堿性磷酸酶 - 左旋咪唑抑制，微波加熱或 0.2N 鹽酸 (HCL)破 壞。 采用免疫熒光方法。 4.游離醛基 醛類(lèi)固定劑未洗凈，殘留的游離醛基易與抗體非特異性結(jié)合。 徹底沖洗及用賴(lài)氨酸 、甘氨酸、白蛋白或正常血清封閉。 5.Fc受體 標(biāo)本中，尤其是冰凍切片或細(xì)胞甩片中，細(xì)胞膜上的免疫球蛋白 (immunoglobulin) Fc受體與抗體結(jié)合。 與二抗同源的血清或非特異性抗體封閉。 6.疏水鍵和離子鍵 免疫球蛋白可通過(guò)疏水鍵和離子鍵與標(biāo)本中的蛋白及其他成分非 特異性結(jié)合，抗血清中的補(bǔ)體也可通過(guò)疏水鍵和離子鍵與標(biāo)本中 的蛋白結(jié)合，再與抗體結(jié)合。 正常血清封閉 盡可能稀釋抗體 滅活補(bǔ)體

20、 增加抗體稀釋液的離子強(qiáng)度（將 PBS改為 TBS） 抗體稀釋液中添加去污劑（如 TritonX-100, Twen-20) 7.天然抗體 接受免疫的動(dòng)物在自然過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)某些動(dòng)物組織或血清成分 的抗體。 用相對(duì)應(yīng)的動(dòng)物血清或組織成分吸收 , 或盡可能提高抗體稀釋度。 8.雜質(zhì)抗體 由于免疫原不純，混有某些組織成分免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體。 盡可能提高抗體稀釋度。 9.自發(fā)熒光 標(biāo)本中的某些成分如紅細(xì)胞 、彈性纖維、脂質(zhì)等有自發(fā)熒光。 改用免疫顯色方法。 六、免疫組化雙重及多重染色 一）免疫熒光 雙重及多重染色 1.免疫熒光雙重染色 1)直接法： 直接用不同熒光染料標(biāo)記的兩種抗體孵育標(biāo)本。 如用

21、 FITC-CD45antibody（綠色） 和 Alexa flour555-CD20 antibody（紅色） 檢測(cè)淋巴組織中的 T細(xì)胞和 B細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：特異性高，方法簡(jiǎn)單，可用來(lái)源于同一宿主（ host）的 抗體。 缺點(diǎn)：敏感性低。 2)間接法 : 第一抗體來(lái)源于 非 同一種屬 , 可用以下方法： A)先用各自非標(biāo)記一抗孵育標(biāo)本，再用不同熒光染料標(biāo)記的各自二 抗結(jié)合一抗。二抗可以是 來(lái)源于同一種屬，也可以不是 。 如： 一抗 : mouse anti-CD45 rabbit anti-CD20 二抗 : FITC-goat anti-mouse IgG TRITC-goat anti-

22、rabbit IgG (green) or TRITC-donkey anti-rabbit IgG (red) 優(yōu)點(diǎn)：增加了敏感性。 缺點(diǎn)：需用 3-4種抗體，且一抗不能來(lái)源于同一種屬。由于所用 的抗體來(lái)源于不同種屬，存在交叉反應(yīng)的可能性，使用前 需進(jìn)行種屬間的交叉實(shí)驗(yàn)。 B)也可先完成第一套抗體顯示第一抗原，再進(jìn)行第二套抗體顯示第 二抗原。 第一抗體來(lái)源于 同一種屬， 可采取以下方法進(jìn)行： A)在 完成第一套抗體顯示第一抗原及保存了相應(yīng)的圖像后，用微波 處理滅活第一套抗體，再進(jìn)行第二套抗體顯示第二抗原。兩套二 抗可以是來(lái)源于同一種屬，也可以不是 , 但須標(biāo)記不同熒光染料 。 B)在完成第一

23、套抗體顯示第一抗原后，用飽和的與第一套一抗同一 種屬的免疫球蛋白封閉第一套抗體中二抗的未結(jié)合位點(diǎn)，再用熒 光標(biāo)記的第二套一抗直接進(jìn)行第二抗原的顯示。 2.免疫熒光多重染色 理論上可以使用 N個(gè)不同熒光染料標(biāo)記的抗體檢測(cè) N個(gè)不同抗原， 實(shí)際使用上受熒光顯微鏡設(shè)置的熒光通道限制。通常熒光顯微鏡 最多只能設(shè)置 3-4個(gè)熒光通道。 1)直接法： 可直接用 3個(gè)或 3個(gè)以上不同熒光染料標(biāo)記的一抗顯示相應(yīng)的抗原。 2)間接法 : 優(yōu)點(diǎn)：可在一標(biāo)本上檢測(cè) 3個(gè)或 3個(gè)以上不同的抗原。 缺點(diǎn)：由于 不同種屬來(lái)源的抗體間存在交叉反應(yīng)的可能性大， 非 特異性反應(yīng)極高。 第一抗體來(lái)源于 非 同一種屬， 可用以下方

24、法： A)先用 3種或 3種以上不同種屬的非標(biāo)記一抗孵育標(biāo)本，再用不同熒 光染料標(biāo)記的二抗各自結(jié)合一抗，一抗和二抗間不能有來(lái)源于同 一種屬的抗體。 B)也可按先后順序進(jìn)行各套抗體顯示各自抗原。 第一抗體來(lái)源于 同一種屬： 可在完成每套抗體顯示各自抗原及保存了相應(yīng)的圖像后，用微波 處理滅活各套抗體 ,再進(jìn)行后續(xù)不同熒光的各套抗體顯示后續(xù)的 各個(gè)抗原。 此方法的前提條件是后續(xù)的各個(gè)抗原能耐受微波處理。 二）免疫酶雙重及多重染色 前提條件：必須預(yù)先去除內(nèi)源性因數(shù)（如過(guò)氧化物酶，堿性磷酸 酶，生物素，親和素等）的影響。 應(yīng)該提醒的是，目前尚無(wú)方法 去除內(nèi)源性生物素和親和素。 1.免疫酶雙重染色 1)直

25、接法： 先去除 內(nèi)源性 因數(shù) (如過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，生物素，親和 素等 )的活性 , 再加不同的酶標(biāo)記的抗體 ,以各自抗體標(biāo)記酶的底 物反應(yīng)顯示抗原的分布。如用 HRP-CD68 antibody 和 AP-CD105 antibody 檢測(cè)炎癥組織中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞 ,分別以 DAB (棕色 )和 fast red（ 紅色 ）顯色。 優(yōu)點(diǎn)：特異性高，方法簡(jiǎn)單，可用來(lái)源于同一宿主的抗體。 缺點(diǎn)：敏感性低 ,必須用不同的標(biāo)記酶及底物。 2)間接法 : 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高。 缺點(diǎn)：特異性低。 第一抗體來(lái)源于 非 同一種屬， 可用以下方法： A)先用各自非標(biāo)記一抗孵育標(biāo)本，再加不同酶標(biāo)記的二

26、抗系統(tǒng) (如 HRP-polymer和 AP-polymer,SP-ABC和 SAP-ABC)及酶底物顯示各自 抗原。二抗系統(tǒng)可以是來(lái)源于同一種屬，也可以不是，但必須標(biāo) 記不同的酶。 B)也可先完成第一套抗體系統(tǒng)顯示第一抗原，再進(jìn)行第二套抗體系 統(tǒng)顯示第二抗原。它們的二抗系統(tǒng)可以是來(lái)源于同一種屬，也可 以不是，但必須標(biāo)記不同的酶。 C)如欲使用 PAP和 APAAP的二抗系統(tǒng)，則二抗系統(tǒng)之間及二抗系統(tǒng)與 一抗之間 不能 有來(lái)源于 同一種屬 的抗體。 第一抗體來(lái)源于 同一種屬： 可在完成第一套抗體顯示第一抗原后 , 用微波處理滅活第一套抗 體，再進(jìn)行第二套抗體顯示第二抗原。兩套二抗可以是來(lái)源于同

27、 一種屬，也可以不是 ,但必須標(biāo)記不同的酶。 2.免疫酶多重染色 理論上可以使用 N個(gè)不同酶標(biāo)記的抗體顯示 N個(gè)不同抗原，實(shí)際使 用上受常用標(biāo)記酶的限制。通常最常用的是 過(guò)氧化物酶 和 堿性磷 酸酶 ，而酶的底物則相對(duì)多些。 1)直接法 : 受常用標(biāo)記酶的限制 , 實(shí)際上只能 直接用 2個(gè)不同酶標(biāo)記的一抗 顯示相應(yīng)的 2個(gè)抗原。 2)間接法 : 由于需用三套或三套以上抗體系統(tǒng)，抗體間存在交叉反應(yīng)的可 能性大，非特異性反應(yīng)強(qiáng)，因此最好的方法是在完成每套抗體 顯示各自抗原后，用微波處理滅活各套抗體 ,再進(jìn)行后續(xù)不同套 抗體顯示后續(xù)的各個(gè)抗原。 此方法的前提條件是后續(xù)的各個(gè)抗原能耐受微波處理。 三）

28、 免疫酶及免疫熒光雙重及多重染色 一般先進(jìn)行免疫酶染色，再進(jìn)行免疫熒光染色。 由于通常只有 紅、綠、棕、藍(lán)（或紫） 4種顏色可用，故至多只能進(jìn)行 1-2種 免疫組化染色和 2-3種免疫熒光染色的組合。 原位雜交 也被稱(chēng)作原位雜交組織化學(xué) (In situ hybridization histo- chemistry），簡(jiǎn)稱(chēng) 原位雜交 (in situ hybridization,ISH)和熒 光 原位雜交 (fluorescein in situ hybridization,FISH) 一、基本原理 ： 利用兩條互補(bǔ)的單核苷酸鏈，在適當(dāng)?shù)臏囟群碗x子濃度下，通過(guò) 互補(bǔ) 堿基對(duì)之間的氫鍵緊密結(jié)合，

29、形成穩(wěn)定的雜交雙鏈的特性， 將帶有標(biāo)記物的已知 核酸某段 堿基序列做為探針，與標(biāo)本中的相 應(yīng)核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò) 熒光 、 免疫酶染色或放射性核素顯示雜交信號(hào)，進(jìn)行 相應(yīng) 核酸在 細(xì)胞內(nèi)的定位及定量。 二 、探針的制備： 一）探針的種類(lèi) 1.基因組 DNA探針： 是使用最廣泛的探針 ,可通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和 PCR方法獲得。 由于此類(lèi)探針是雙鏈 DNA,使用前必須進(jìn)行變性處理。 2.cDNA探針： cDNA是互補(bǔ)于 mRNA的 DNA分子 ,可從 cDNA文庫(kù)中克隆獲得 ,也可通 過(guò) RT-PCR方法獲得，由于此類(lèi)探針也是雙鏈 DNA,使用前也必須 進(jìn)行變性

30、處理。 3.寡核苷酸探針： 通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)合成的單鏈 DNA，一般長(zhǎng)度為 20-50bp。 以上都是 DNA探針，由于 DNA與 DNA或 RNA的結(jié)合效率低，故敏感性 低，且無(wú)法做正義 (sense)和反義 (antisense)探針的對(duì)照實(shí)驗(yàn)， 一般用于 DNA的雜交檢測(cè)。 4.cRNA探針： cRNA探針是以 cDNA為模板在體外轉(zhuǎn)錄而成的單鏈 RNA探針。由于 它是 RNA，與 DNA或 RNA的結(jié)合效率高，故敏感性高，并可做 sense 和 antisense探針的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，常用于 mRNA的雜交檢測(cè) ,也可用于 DNA的雜交檢測(cè)。 二）探針的標(biāo)記 1.探針的標(biāo)記物： 標(biāo)記物被標(biāo)記

31、在核酸 (NTP)或脫氧核酸 (dNTP)上，隨 RNA或 DNA的 合成而摻入。 1）放射性標(biāo)記物： 常用的放射性標(biāo)記物是 32P(磷 )、 3H(氚 )和 35S(硫 )。 2）非放射性標(biāo)記物： 常用的非放射性標(biāo)記物是 digoxigenin(地高辛 )、 fluorescein isothiocyanate（ FITC，異硫氰酸熒光素）和 biotin(生物素 )。 2.探針的標(biāo)記方法： 1)DNA探針的標(biāo)記方法 : 缺口平移法 (nick translation) 隨機(jī)引物法 (random primer) 末端標(biāo)記法 (end-labelling) B)T4聚合酶替代法 A)3 末端

32、標(biāo)記法 PCR擴(kuò)增標(biāo)記法 2)RNA探針的標(biāo)記方法 : 5 末端標(biāo)記法 RNA體外轉(zhuǎn)錄法 三、 mRNA原位雜交 (非放射性探針 )基本程序 一）標(biāo)本的制備 1.組織標(biāo)本的取材 取材原則 :盡可能快的切取所需組織浸入固定液 ,保持組織的新 鮮以最大限度地防止細(xì)胞內(nèi) mRNA或 DNA的降解 , 有條 件的最好在冷庫(kù)取材。 2.固定 固定液用量應(yīng)是標(biāo)本的 40倍。 1)常用的固定劑 單純固定劑 4%多聚甲醛 :常用 緩沖中性福馬林 :常用 福馬林 (10%甲醛水溶液 ) 中性福馬林 復(fù)合固定劑 Bouin氏液：常用 Zamboni氏液：常用 2)固定方法： 必須用預(yù)冷（ 4 ）的固定液固定，并保

33、持低溫持 續(xù)固定至所需時(shí)間 。 1)灌注固定：最好的固定方法，尤其適用于神經(jīng)組織如腦、脊髓 和視網(wǎng)膜。灌注固定后應(yīng)迅速切取所需組織，在預(yù) 冷的固定液中繼續(xù)浸泡固定至所需時(shí)間。 2)浸泡固定：最普通和常用的固定方法，適用于除神經(jīng)組織外的 各種組織。 3.包埋和切片 :采用石蠟包埋和切片，切片厚度應(yīng)為 4-6um。一般 不用冰凍切片，因?yàn)槿菀酌撈?4.切片的雜交前處理： 1)石蠟切片的回水：經(jīng)二甲苯、逐級(jí)酒精等脫蠟回水。 2)去除內(nèi)源性堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶活性：切片在 0.2N 鹽酸 0.3% TritonX-100水溶液中浸泡 40分鐘以滅活內(nèi)源性堿性磷 酸酶，或用 0.3% H2O2孵育

34、40分鐘以消耗內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活 性。如果是做 FISH,則可省略此步驟。 3)暴露 mRNA或 DNA: 加 proteinase K 溶液置 3720 分鐘以暴露細(xì) 胞的 mRNA，或微波加熱以暴露細(xì)胞的 DNA。 4)預(yù)雜交處理：加無(wú)探針的雜交液預(yù)處理 切片。此 步驟無(wú)必要， 可以省略。 5)探針雜交 :加含探針的雜交液置 46 過(guò)夜（放在搖床上更好）， 以 sense和 antisense探針互為對(duì)照。 6)雜交后的洗滌：置 46 去離子水洗切片 3次，每次 15分鐘（放在 搖床上洗更好 ），以除去未雜交的 探針。 7)雜交信號(hào)的檢測(cè)：加堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗地高辛 抗體室溫

35、孵育 2小時(shí)，加酶底物 NBT/BCIP或 DAB顯色。如做 FISH 則可省略此步驟。 8)封片及雜交結(jié)果檢查：一般用水溶性封片劑封片， 酶底物顯色的 標(biāo)本在普通顯微鏡下 檢查 ， FISH在熒光下 檢查。 附 1： mRNA原位雜交程序 1.石蠟切片經(jīng)二甲苯、逐級(jí)酒精等脫蠟回水。 2.切片在 0.2N 鹽酸 0.3%TritonX-100水溶液中浸泡 40分鐘以滅活內(nèi) 源性堿性磷酸酶。與此同時(shí)配制 10ug/ml的 Proteinase K溶液 （ 10ug Proteinase K在 1 ml Proteinase K激活液中）。 3.用去離子水洗切片 4次，加 Proteinase K

36、溶液置 3715 -20分鐘， 無(wú) RNase水（ DEPC處理）水洗切片 4次。 4.加雜交液置 46 過(guò)夜（放在搖床上更好）。 5.46 去離子水洗切片 3次，每次 15分鐘（放在搖床上洗更好）。 6.加堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗地高辛抗體（ 1： 200，用 1%BSA PBS配 制）室溫孵育 2小時(shí)。 7.PBS洗 3次，加 NBT/BCIP顯色 3分鐘至 30分鐘。 8.水溶性封片劑封片。 附 2：溶液配方 1.Proteinase K激活液 (PH7.4)： 50mM Tris-HCl (PH7.4) 5mM CaCl2 2.雜交液 (10ml， -20 保存，臨用前加入 1-2ug/m

37、l的 cRNA探針 )： 100%去離子甲酰胺 5ml 50%葡聚糖硫酸酯 （ dextran sulfate, sigma D8906） 2ml 40 x Denhardts液 50ul 1M Tris-HCl （ PH8.0） 100ul 5M NaCl 600ul 0.5M EDTA (PH8.0) 20ul 1M DTT 100ul 無(wú) RNase水 2.130ml 1)40 x Denhardts液 (40ml, 過(guò)濾除菌 ): 聚蔗糖（ polysucrose400, sigmaP7798） 0.4g 聚乙烯吡咯烷酮（ polyvinylpyrrolidone40000, sigm

38、aPVP-40 or P0930） 0.4g 牛血清白蛋白 0.4g 2)50%葡聚糖硫酸酯（ 10ml, 高壓滅菌， -20 保存）： 葡聚糖硫酸酯 5g 無(wú) RNase水 10ml 3)1M DTT:（ 過(guò)濾除菌 ， -20 保存） DTT 1g 加 無(wú) R,Nase水溶解至 6ml。 附 3： 注意事項(xiàng) 1.用于配制溶液的水應(yīng)是 無(wú) RNase水。 2.cRNA探針的濃度通過(guò)點(diǎn)在尼龍膜上的探針標(biāo)記效率來(lái)推測(cè)，以 1:10000的標(biāo)記效率為準(zhǔn)，為 1ug/ul。 3.無(wú)需預(yù)雜交，因?yàn)橛谢驘o(wú)此步驟結(jié)果無(wú)差別。 4.加抗體之前無(wú)需加封閉液，因?yàn)榉忾]液無(wú)任何效果。 四 .mRNA原位雙雜交 （

39、Double in situ hybridization for mRNA) 一）方法 與普通 mRNA原位雜交方法相同，只是在雜交液中加入了兩種不 同標(biāo)記物的探針 ,如 digoxigenin標(biāo)記的探針和 FITC標(biāo)記的探針。 可以在同一個(gè)標(biāo)本上檢測(cè)兩種 mRNA的表達(dá)。 二）注意事項(xiàng) 1.進(jìn)行 mRNA原位雙雜交時(shí)，應(yīng)先封片檢測(cè) FISH信號(hào)并保存所需圖 像，之后再加抗 digoxigenin抗體及相應(yīng)底物顯色。 2.不建議使用 biotin(生物素 )標(biāo)記探針，因?yàn)槟壳斑€無(wú)方法可去 除內(nèi)源性生物素的影響。 五 .順序免疫組化和原位雜交多種染色 (Sequential staining of immunohistochemistry and in situ hybridization) 一）基本原理 醛類(lèi)固定的組織蛋白質(zhì)發(fā)生變性及交聯(lián)， mRNA被包裹在其中。只 要不被暴露， mRNA就不會(huì)降解。 二）方法 一般先進(jìn)行免疫組化染色后再進(jìn)行原位雜交。選擇對(duì)比度大顏色 搭配。