課題課題2 2土壤中分解尿素的細(xì)菌的土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)分離與計數(shù)1嚴(yán)選課件一、課題背景一、課題背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一種重要的是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。農(nóng)業(yè)氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被農(nóng)作物被農(nóng)作物吸收。吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、細(xì)菌利用尿素的原因、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O2嚴(yán)選課件 1 1、實例：、實例：啟示：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的 要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度原因：因為熱泉溫度707080800 0C C，淘汰了絕大多，淘汰了絕大多 數(shù)微生物只有數(shù)微生物只有TaqTaq細(xì)菌被篩選出來。細(xì)菌被篩選出來。DNADNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是是一種在體外將一種在體外將少量少量DNADNA大量復(fù)制大量復(fù)制的技術(shù)，此項的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用技術(shù)要求使用耐高溫耐高溫（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.篩選菌株篩選菌株3嚴(yán)選課件2 2、實驗室中微生物的篩選原理：、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供人為提供有利于目的菌株生長有利于目的菌株生長的條件的條件(包包括營養(yǎng)、溫度、括營養(yǎng)、溫度、pHpH等等)，同時，同時抑制或阻止其他抑制或阻止其他微生物微生物生長。生長。什么是選擇性培養(yǎng)基？什么是選擇性培養(yǎng)基？4嚴(yán)選課件15.0g15.0g瓊脂瓊脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基5嚴(yán)選課件在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的氮源為尿素氮源為尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。5 5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理6嚴(yán)選課件6 6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為以尿素為唯一氮源唯一氮源的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基是是分離分離尿素尿素細(xì)菌細(xì)菌判斷該判斷該培養(yǎng)基培養(yǎng)基有無選有無選擇性擇性實驗組實驗組對照組對照組培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型是否是否接種接種目的目的結(jié)果結(jié)果只生長尿只生長尿素細(xì)菌素細(xì)菌生長多種生長多種微生物微生物是是7嚴(yán)選課件1 1、顯微鏡直接計數(shù)：、顯微鏡直接計數(shù)：利用利用血球計數(shù)板血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。樣品中微生物的數(shù)量。.統(tǒng)計菌落數(shù)目：統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計數(shù)；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)缺點(diǎn)8嚴(yán)選課件2.2.間接計數(shù)法（間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）活菌計數(shù)法）原理：原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落一個菌落是由是由一個單一個單細(xì)胞細(xì)胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。一個單細(xì)胞。常用方法：稀釋涂布平板法。常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀釋度下平板上生長的平代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，均菌落數(shù)，V V代表涂布平板時所用的稀釋液代表涂布平板時所用的稀釋液的體積的體積(ml)(ml)，M M代表稀釋倍數(shù)。代表稀釋倍數(shù)。9嚴(yán)選課件注意事項注意事項為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在3030300300的平板上進(jìn)行計數(shù)。的平板上進(jìn)行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到到三個或三個以上三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低實際數(shù)目低。10嚴(yán)選課件實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌 落數(shù)目的實驗時，落數(shù)目的實驗時，A A同學(xué)從對應(yīng)的同學(xué)從對應(yīng)的10106 6 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150150個菌個菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約只選擇出大約5050個菌落。分析其原因。個菌落。分析其原因。原因：原因：土樣不同，土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)或者是混入了其他的含氮物質(zhì))11嚴(yán)選課件設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。信度。.設(shè)置對照：設(shè)置對照：12嚴(yán)選課件小結(jié)：小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同學(xué)用與由其他同學(xué)用與A A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗 方案二：方案二：將將A A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。否受到污染。結(jié)果預(yù)測：結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與如果結(jié)果與A A同學(xué)一致，則證明同學(xué)一致，則證明A A無誤；無誤；如果結(jié)果不同，則證明如果結(jié)果不同，則證明A A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。基的配制有問題。13嚴(yán)選課件二二.實驗的具體操作實驗的具體操作 .土壤取樣土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基。14嚴(yán)選課件應(yīng)在火焰旁稱取土壤應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行火焰旁進(jìn)行 三三 樣品的稀釋樣品的稀釋15嚴(yán)選課件.取樣涂布取樣涂布實驗時要對實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。等。16嚴(yán)選課件.取樣涂布取樣涂布分離不同的微生物采用不同的稀釋度分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)目的目的細(xì)菌細(xì)菌10104 4、10105 5、10106 6保證獲得菌落保證獲得菌落數(shù)在數(shù)在3030300300之間、適于計之間、適于計數(shù)的平板數(shù)的平板放線菌放線菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同17嚴(yán)選課件.微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔在菌落計數(shù)時，每隔24h24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：細(xì)菌：30303737培養(yǎng)培養(yǎng)1 12d2d放線菌：放線菌：25252828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)3 34d4d。18嚴(yán)選課件如果得到了如果得到了2 2個或個或2 2個以上個以上菌落數(shù)目在菌落數(shù)目在3030300300的平板，則說明稀釋操作比較成功，的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確精確，需要重新實驗。，需要重新實驗。19嚴(yán)選課件微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察20嚴(yán)選課件三三.結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價1.1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：選擇每個平板上長有提示：選擇每個平板上長有3030300300個個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。21嚴(yán)選課件四、操作提示四、操作提示 無菌操作無菌操作 做好標(biāo)記做好標(biāo)記 規(guī)劃時間規(guī)劃時間 22嚴(yán)選課件五五.課外延伸課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PHPH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素分解尿素。測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán)伊紅美藍(lán)伊紅美藍(lán)伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌基上培養(yǎng)，大腸桿菌基上培養(yǎng)，大腸桿菌基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色菌落呈現(xiàn)黑色菌落呈現(xiàn)黑色菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出，通過記述得出，通過記述得出，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。水樣中大腸桿菌的數(shù)量。水樣中大腸桿菌的數(shù)量。水樣中大腸桿菌的數(shù)量。23嚴(yán)選課件大腸桿菌呈大腸桿菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸桿菌在伊大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂紅美藍(lán)瓊脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 24嚴(yán)選課件本課題知識小結(jié)本課題知識小結(jié):25嚴(yán)選課件六、例題解析六、例題解析 例例1 1對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定正確的表述是對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定正確的表述是A A在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B B至少接種一種細(xì)菌至少接種一種細(xì)菌 C C接種一個細(xì)菌接種一個細(xì)菌 D D及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 解析：細(xì)菌群體解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測定生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進(jìn)行的。是人們在一定條件下進(jìn)行的。這些條件是：一這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時測定細(xì)菌總數(shù)測定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測。在這些條件下，才能測定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測定時只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；定時只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。答案：答案：A A26嚴(yán)選課件1.1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（）A.A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.B.至少接種一種細(xì)菌至少接種一種細(xì)菌 C.C.接種一個細(xì)菌接種一個細(xì)菌 D.D.及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)及時補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）A.A.培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌 B.B.培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素實踐訓(xùn)練實踐訓(xùn)練A A C CD D27嚴(yán)選課件4.4.下列說法不正確的是（下列說法不正確的是（）A.A.科學(xué)家從科學(xué)家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.統(tǒng)計某一稀釋度的統(tǒng)計某一稀釋度的5 5個平板的菌落數(shù)依次為個平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度 D.D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。種類最多。5.5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）入（）A.A.較多的氮源物質(zhì)較多的氮源物質(zhì) B.B.較多的碳源物質(zhì)較多的碳源物質(zhì) C.C.青霉素類藥物青霉素類藥物 D.D.高濃度食鹽高濃度食鹽B BC C28嚴(yán)選課件練一練練一練用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，其結(jié)果與實際值相比（）A.比實際值高B.比實際值低C.和實際值一致D.比實際值可能高也可能低29嚴(yán)選課件下列能選擇出分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基是()A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、水B.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、瓊脂、水C.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、瓊脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水130嚴(yán)選課件31嚴(yán)選課件32嚴(yán)選課件