牛奶中活性物質的分析牛奶中活性物質的分析1優(yōu)選內容實驗內容實驗內容v1牛奶中水分含量的測定牛奶中水分含量的測定v2牛奶中粗脂肪的提取與牛奶中粗脂肪的提取與測定測定v3牛奶中酪蛋白的提取牛奶中酪蛋白的提取v4蛋白質含量的測定蛋白質含量的測定2優(yōu)選內容（1）牛奶中水分含量的測定）牛奶中水分含量的測定v水分是食品分析的重要項目之一。水分測定對于計算生產中的物料平衡，和實行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為69.7%-92.5%，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分隨品種不同略有差異，一般為32-42%v水分測定法通?？煞譃橹苯臃ㄖ苯臃ê烷g接法間接法兩類。利用水分本身的物理性質和化學性質測定水分的方法，叫做直接法，直接法，如重量法，蒸餾法和卡爾.費休法等；利用食品的比重，折射率，電導，介電常數(shù)等物理性質測定水分的方法，叫做間接法。間接法。測定水分的方法要根據食品的性質和測定目的來選定3優(yōu)選內容一一 重量法重量法凡操作過程中包括有稱量步驟的測定方法，統(tǒng)稱為重量法，如烘箱干燥法，紅外線干燥法，干燥劑法等。v烘箱干燥法烘箱干燥法在一定溫度和壓力條件下，將樣品加熱干燥，以排除其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常壓烘箱法和真空烘箱干燥法。這種測定方法費時長，但操作簡便，應用范圍較廣。v應用本法測定水分的樣品應符合下述條件：應用本法測定水分的樣品應符合下述條件：(1)水分是唯一的揮發(fā)物質；(2)水分的排除情況很完全；(3)食品中其他組分在加熱過程中由于發(fā)生化學反應而引起的重量變化可以忽略。4優(yōu)選內容二二 材料與儀器材料與儀器v材料全脂牛奶層析濾紙v器材常壓電熱烘箱干燥器電子分析天平5優(yōu)選內容三三 操作步驟操作步驟v取一張12cm*12cm70過夜烘干的層析濾紙，稱重，記為m1。準確稱取一定量牛奶m2，滴于濾紙上，70烘干后稱重，記為m3。計算水分含量。v干物質質量m4=m3-m1v水分含量（%）=（m2-m4）/m21006優(yōu)選內容（2）粗脂肪的定量測定）粗脂肪的定量測定索氏提取法索氏提取法一一、目的要求、目的要求學習和掌握粗脂肪的定量測定法索氏提取法7優(yōu)選內容二、原理二、原理v脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結合成的脂類化合物,能溶于脂溶性有機溶劑。v本實驗用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個提取過程均在索氏提取器中進行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點為30C-60 C的石油醚。用此法提取的脂溶性物質除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。8優(yōu)選內容三、三、適用范圍與特點適用范圍與特點v適用于脂類含量較高，結合態(tài)脂類含量少或經適用于脂類含量較高，結合態(tài)脂類含量少或經水解處理過的，（結合態(tài)已轉變成游離態(tài)），水解處理過的，（結合態(tài)已轉變成游離態(tài)），樣品應能烘干，磨細，不易吸濕結塊。樣品應能烘干，磨細，不易吸濕結塊。v此法經典，對大多數(shù)樣品的測定結果比較可靠。此法經典，對大多數(shù)樣品的測定結果比較可靠。但費時長（但費時長（816 h）溶劑用量大，需要專門）溶劑用量大，需要專門的儀器的儀器,索氏提取器。索氏提取器。9優(yōu)選內容四四 材料、試劑與器材材料、試劑與器材v材料：全脂牛奶v試劑：乙醚v器材：索氏提取器、干燥箱、電子分析天平10優(yōu)選內容索氏提取器構造索氏提取器構造11優(yōu)選內容五、操作方法五、操作方法1抽提筒的準備抽提筒的準備2抽提抽提將測定完水分帶有干物質的濾紙折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器內，連接已干燥至恒重（m5）的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無水乙醚，加量為接受瓶的23體積，于60水浴上加熱，使乙醚不斷的回流提取，一般視含油量高低提取612小時，至抽提完全為止（用濾紙試）。12優(yōu)選內容3 3 稱重稱重v取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶內乙醚剩12ml時，在水浴上蒸干，再于100105干燥2小時，取出放干燥器內冷卻30分鐘，稱重，并重復操作至恒重（m6）。v取出濾紙包，于戶外晾至無乙醚味，置入恒溫箱內，烘干，然后移入干燥缸內冷卻后稱重，重復操作至恒重（m7）。13優(yōu)選內容六六結果處理結果處理v方法一 脂肪脂肪()(m6-m5)/m4 100m6接受瓶和脂肪的質量，接受瓶和脂肪的質量，g；m5接受瓶的質量，接受瓶的質量，g；m4樣品的質量樣品的質量(如為測定水分如為測定水分 后的后的 樣品質量計樣品質量計)，g。v方法二脂肪脂肪()(m3-m7)/m4 100m3未抽提濾紙包的質量，未抽提濾紙包的質量，g；m7抽提后濾紙包的質量，抽提后濾紙包的質量，g；m4樣品的質量樣品的質量(如為測定水分如為測定水分 后的后的 樣品質量計樣品質量計)，g。14優(yōu)選內容七、注意事項七、注意事項v乙醚為易燃有機溶劑，實驗室應保持通風并禁止任何明火。v抽提用的乙醚或石油醚要求無水、無醇、無過氧化物，揮發(fā)殘渣含量低。因水和醇可導致水溶性物質溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測定結果偏高，被測樣品也要事先烘干。過氧化物會導致脂肪氧化，在烘干時也有引起爆炸的危險。v裝樣品的濾紙筒一定要嚴密，不能往外漏樣品，也但不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時高度不要超過回流彎管，否則超過彎管的樣品中的脂肪不能提盡，造成誤差。15優(yōu)選內容八、思考題八、思考題(1)本實驗制備得到的是粗脂肪,若要制備單一組分的脂類成分,可用什么方法進一步處理？(2)本實驗樣品制備時烘干為什么要避免過熱16優(yōu)選內容（3）酪蛋白的提?。├业鞍椎奶崛∫灰?、目的要求、目的要求v掌握一種提取酪蛋白的方法v掌握一種檢測牛乳質量的方法17優(yōu)選內容二二 實驗原理實驗原理v酪蛋白是乳蛋白質中最豐富的一類蛋白質，占乳蛋白的80%82%，酪蛋白不是單一的蛋白質，是一類含磷的復合蛋白質混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質可以檢測牛乳中是否摻假。v酪蛋白在其等電點時由于靜電和為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質，將牛乳調到pH4.6，酪蛋白就可從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個性質被用來從酪蛋白粗制劑中將脂類雜志除去。18優(yōu)選內容三三 儀器、原料和試劑儀器、原料和試劑v儀器：溫度計、布氏漏斗、pH試紙、抽濾瓶、水浴鍋、燒杯、量筒、表面皿、天平、離心機等v原料：市售全脂牛奶v試劑：無水乙醇、無水乙醚pH4.7乙酸鈉緩沖液0.2mol/L乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（體積比）19優(yōu)選內容四四 實驗步驟實驗步驟v1、酪蛋白等電點沉淀將100mL牛乳放到500mL燒杯中，加熱到40，加入到同樣40的乙酸鈉緩沖液中，調pH達4.7。此時有絮狀的蛋白質沉淀析出。將懸浮液冷卻至室溫，室溫放置分層，3000r/min離心15min，收集沉淀。v2、水洗將pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍，洗滌粗制品三次，分別離心10分鐘，得到沉淀蛋白。v3、去脂將粗制品中加入10ml無水乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準確稱重后，計算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白質量（g/100mL），并與理論產量（3.5g/100mL）相比較，求出實際獲得百分率。20優(yōu)選內容五五 思考題思考題v用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗滌蛋白質的順序是否可以變換？為什么？v試設計一個利用蛋白質其他性質提取蛋白質的實驗21優(yōu)選內容六六 離心機的使用及注意事項離心機的使用及注意事項v離心機的工作原理離心機的工作原理：在離心力場的作用下，可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度，從而將不同的物質分離。它是生化實驗中提取、分離、純化的常用設備，操作的關鍵環(huán)節(jié)是平衡。v注意事項注意事項1.檢查內、外套管應完整不漏，洗凈離心管；2.待離心的物質裝入離心管的量不應超過離心內套管體積的2/3；3.將一對離心管（含內、外套管）放在臺秤上平衡；4.檢查離心機正常后，將平衡好的離心管對稱的放在離心機中；5.蓋好離心機蓋，打開電源開關，設置轉速與時間，開始離心。注意一定不能超過離心機的最大離心速度！離心結束后，待離心機停止運轉后，再打開機蓋，取出離心管，不許用手強行使離心機停止轉6用完后，將內外套管洗凈，倒立放置，使其干燥，并在使用的登記薄簽名。7.使用過程中，如出現(xiàn)故障，一定請本室的實驗員排除，不許擅自處理22優(yōu)選內容（4）蛋白質濃度的測定）蛋白質濃度的測定考馬斯亮藍染考馬斯亮藍染色法色法一一 實驗目的實驗目的學會用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質濃度23優(yōu)選內容考馬斯亮藍能與蛋白質的疏水微區(qū)結合，這種結合具有高敏感性。考馬斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合形成復合物時呈藍色，最大吸收峰改變?yōu)?95nm,考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的高消光效應導致了蛋白質定量測定的高敏感度（比Lowry法靈敏4倍）在一定范圍內，蛋白質和染料考馬斯亮藍結合符合比爾定律，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結合的蛋白質量。二二 實驗原理實驗原理24優(yōu)選內容Coomassie Dye-Based 蛋白質定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein-DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+25優(yōu)選內容三三 實驗試劑與器材實驗試劑與器材v試劑0.9%NaCl溶液標準蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml）染液：考馬斯亮藍G250（0.01%）樣品液：酪蛋白溶液v器材漩渦混合器試管吸管容量瓶量筒電子分析天平比色皿722型分光光度計26優(yōu)選內容四、四、操作方法操作方法1.標準曲線制作取14支試管，分兩組按下表平行操作。試管編號0123456標準蛋白溶液(mL)00.10.20.30.40.50.60.9%NaCl溶液（mL）1.00.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍試劑(mL)4444444蛋白質濃度(g/mL)0102030405060A595nm搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色OD595nm以OD595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。27優(yōu)選內容2.酪蛋白濃度的測定稱取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一定體積（使其測定值在標準曲線的直線范圍內）。測定方法同上，根據所測定的OD595nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(g/mL)。28優(yōu)選內容五五 注意事項注意事項（1）如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5-20min內測定光吸收，因為再這段時間內顏色最穩(wěn)定。（2）測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，但此復合物的吸附量可以忽略。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。（3）一些陽離子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物質對測定無影響，而大量的去污劑如SDS等會嚴重干擾測定。29優(yōu)選內容六722型分光光度計使用方法型分光光度計使用方法 1調整調整（1）將靈敏度旋鈕調至“1”檔（放大倍率最?。?。調波長調節(jié)器至所需波長。（2）開啟電源開關，指示燈亮，選擇開關置于“T”，調節(jié)透光率100%T旋鈕使數(shù)字顯示100.0左右，預熱20min.2校正校正（1）打開吸收池暗室蓋（光門自動關閉），調節(jié)0%T旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，蓋上吸收池蓋，將參比溶液置于光路，使光電管受光，調節(jié)透光率100%T旋鈕，使數(shù)學顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到“100”，則可適當增加電流放大器靈敏度檔數(shù)，但應盡可能使用低檔數(shù)，這樣儀器將有更高的穩(wěn)定性。當改變靈敏度后必須重新校正“0”和“100”。（3）按（1）連續(xù)幾次調整“00.0”和“100.0”后，如將選擇開關置于“A”，調節(jié)吸光度調零旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”，即可進行下面吸光度A的測量；如將選擇開關置于“C”，將標準溶液推入光路，調節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示值為已知標準溶液濃度數(shù)值，即可進行下面濃度c的測量。30優(yōu)選內容3測定測定（）吸光度的測量。將要測的試樣溶液推入光路，顯示值即為待測樣品的吸光度值。（）濃度c的測量。將要測c試樣溶液推入光路，即可讀出待測樣品的濃度值c。4結束結束 測量完畢，關閉電源，將各調節(jié)旋鈕恢復至初始位置。取出吸收池洗凈，晾干，存于專用盒內。注意事項注意事項：（1）儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。（2）如果大幅度改變測試波長時，在調整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應緩慢，需一段光響應平衡時間），當穩(wěn)定后，重新調整“00.0”和“100”即可工作。（3）儀器左側下角有一只干燥劑筒，應保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變色應立即更新或烘干后再用。（4）當儀器停止工作時，關掉電源，電源開關需同時切斷，并罩好儀器31優(yōu)選內容七七 思考題思考題與其它測定蛋白質濃度的方法相比，考馬斯亮藍染色法測定有何優(yōu)點？32優(yōu)選內容