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1、 Kary B. Mullis (1944 -)，在 Cetus公 司 工 作 期 間 ，發(fā) 明 了 PCR。 他 原 本 是要 合 成 DNA引 物 來 進(jìn) 行測(cè) 序 工 作 ， 卻 常 為 沒 有足 夠 多 的 模 板 DNA而 煩惱 。 1983年 春 夏 之 交 的一 個(gè) 晚 上 ， 他 開 車 去 鄉(xiāng)下 別 墅 的 路 上 萌 發(fā) 了 用引 物 （ 而 不 是 一 個(gè)引 物 ） 去 擴(kuò) 增 模 板 DNA 的 想 法 . Mullis開 車 的 時(shí) 候 , 瞬 間 感 覺 兩 排 路 燈 就 是 DNA的 兩 條 鏈 ， 自 己 的 車 和 對(duì) 面開 來 的 車 象 是 DNA聚 合

2、 酶 ， 面 對(duì) 面 地 合 成 著 DNA， 1983年 9月 中 旬 。 美 國(guó) 黃 石 國(guó) 家 公 園 Thermus aquaticus The Thermusaquaticus DNApolymeraseTaqNot permanentlydestroyed at 94COptimaltemperature is 72C Taq DNA聚 合 酶 (Thermus aquaticus， Cetus/Roche)Tth DNA聚 合 酶 (Thermus thermophilus， Toyobo)Pfu DNA聚 合 酶 （ Pyrococcus furiosus， Stratagen

3、e） Deep Vent DNA聚 合 酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚 合 酶 （ Thermus flavus， Promega)Tli DNA聚 合 酶 (Thermococcus litoralis， Promega) Vent DNA聚 合 酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚 合 酶 ( Pyrococcus woesei， Roche)Pfx DNA聚 合 酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)Dynazyme DNA聚 合 酶 （ Thermus brockianus， Finnazyme）FD DNA聚 合 酶 (

4、Thermus sterophilus？ ， 復(fù) 旦 大 學(xué) ) Tma, Tne, KOD, 三 個(gè) 水 浴 鍋 ， 用 手 移 動(dòng) （ Mullis等 人 當(dāng) 時(shí) 用 的 ） 電 加 熱 塊 自 來 水 冷 卻 （ PE， 1988） 電 加 熱 塊 內(nèi) 置 循 環(huán) 液 冷 卻 （ PE， 1989） 三 個(gè) 加 熱 塊 機(jī) 械 手 （ Stratagene， 1994） 半 導(dǎo) 體 制 冷 和 加 熱 （ MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 溫 度 梯 度 , 熒 光 檢 測(cè) (如 Roche的 Lightcycler) 風(fēng) 加 熱 Lab-on-chip式 的 P

5、CR儀 (所 謂 的 芯 片 PCR) 1991年 出 現(xiàn) 三 個(gè) 水 浴 鍋 +機(jī) 械 手 的 原 始 PCR儀 （ 華 美 ， 復(fù) 日 等 ） 現(xiàn) 在 以 半 導(dǎo) 體 （ Peltier板 ） 制 冷 式 為 主 （ 杭 州 博 日 ,上 海 天 呈 , 廈 門安 普 利 等 ） 1983年 春 ， Mullis發(fā) 展 出 PCR的 概 念 ； 1983年 9月 ， Mullis用 大 腸 桿 菌 DNA聚 合 酶 做 了 第 一 個(gè) PCR實(shí)驗(yàn) ， 只 用 一 個(gè) 循 環(huán) ； 1983年 12月 ， 用 同 位 素 標(biāo) 記 法 看 到 了 10個(gè) 循 環(huán) 后 的 49 bp長(zhǎng) 度的 第

6、一 個(gè) PCR片 斷 ； 1985年 12月 20日 ， Mullis的 同 事 Saiki在 Science上 發(fā) 了 一 篇論 文 ， 方 法 中 用 了 PCR技 術(shù) ， 導(dǎo) 致 Mullis的 文 章 到 處 被 拒 ； 1985年 10月 25日 申 請(qǐng) 了 PCR的 專 利 ， 1987年 7月 28日 批 準(zhǔn)（ 專 利 號(hào) 4,683,202 ） ， 這 回 Mullis是 第 一 發(fā) 明 人 。 1986年 5月 ， Mullis在 冷 泉 港 實(shí) 驗(yàn) 室 做 專 題 報(bào) 告 ， 全 世 界 從 此 開始 學(xué) 習(xí) PCR的 方 法 ； 1986年 6月 ， Cetus公 司 純

7、 化 了 第 一 種 高 溫 菌 DNA聚 合 酶 ， Taq DNA polymerase， 這 是 85年 春 天 Mullis建 議 做 的 ； 1988年 ， 第 一 臺(tái) PCR儀 問 世 ； 1991年 ， Hoffman LaRoche以 3億 美 元 的 代 價(jià) 從 Cetus公 司 獲得 全 權(quán) 開 發(fā) 權(quán) 。 Mullis的 上 司 有 句 “ 名 言 ” ， “ 我 們要 擴(kuò) 增 這 么 多 DNA樣 品 有 什 么 用 ” ； 到 了 1991， Cetus公 司 以 3億 美 元 的轉(zhuǎn) 讓 費(fèi) 將 PCR相 關(guān) 專 利 轉(zhuǎn) 讓 給 瑞 士Hoffman LaRoche公

8、 司 ， 并 在 此 后的 經(jīng) 營(yíng) 中 又 獲 得 了 數(shù) 億 美 元 的 分 紅 ； Mullis于 1993年 獲 得 諾 貝 爾 化 學(xué) 獎(jiǎng) ， T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green 過

9、 程（ 一 ） PCR的 基 本 原 理 （ 二 ） PCR的 種 類1.普 通 PCR 樣 品 正 對(duì) 照 負(fù) 對(duì) 照 標(biāo) 準(zhǔn) 分 子 量 （ 二 ） PCR的 種 類2.RT-PCR： 反 轉(zhuǎn) 錄 PCR(reverse transcriptase-PCR)原 理 ： RNA的 反 轉(zhuǎn) 錄 （ RT） 和 cDNA的 聚 合 酶 鏈 式 擴(kuò) 增 （ PCR） 相 結(jié)合 的 技 術(shù) 。 首 先 經(jīng) 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 的 作 用 從 RNA合 成 cDNA， 再 以 cDNA為模 板 ， 擴(kuò) 增 合 成 目 的 片 段 。特 點(diǎn) ： 作 為 模 板 的 RNA可 以 是 總 RNA、 mRNA或

10、 體 外 轉(zhuǎn) 錄 的 RNA產(chǎn) 物 。無 論 使 用 何 種 RNA， 關(guān) 鍵 是 確 保 RNA中 無 RNA酶 和 基 因 組 DNA的 污 染 。用 于 反 轉(zhuǎn) 錄 的 引 物 可 視 實(shí) 驗(yàn) 的 具 體 情 況 選 擇 隨 機(jī) 引 物 、 Oligo dT 及 基 因 特 異 性 引 物 (GSP)中 的 一 種 。 對(duì) 于 短 的 不 具 有 發(fā) 卡 結(jié) 構(gòu) 的 真核 細(xì) 胞 mRNA， 三 種 都 可 。 應(yīng) 用 ： RT-PCR技 術(shù) 靈 敏 而 且 用 途 廣 泛 ， 分 析 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平 ， 細(xì) 胞 中 RNA病 毒 的 含 量 ， 直 接 克 隆 特 定 基

11、因 的 cDNA序 列 。 兩 步 法 RT-PCR示 意 圖一 步 法 RT-PCR示 意 圖 兩 步 法 RT-PCR 一 步 法 RT-PCR起 始 第 一 鏈 cDNA合 成 使 用 ： 起 始 第 一 鏈 合 成 使 用Oligo(dT)， 隨 機(jī) 六 聚 體 ， GSP引 物 GSP引 物優(yōu) 點(diǎn) 優(yōu) 點(diǎn)靈 活 方 便引 物 選 擇 擴(kuò) 增 酶 同 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 預(yù) 先 混 合擴(kuò) 增 酶 的 選 擇 轉(zhuǎn) 管 步 驟 少 ， 減 少 污 染 可 能 性困 難 RT-PCR的 優(yōu) 化 能 力 高 靈 敏 度適 用 于 在 單 個(gè) 樣 品 中 檢 測(cè) 幾 個(gè) mRNA 適 用 于 大 量

12、 樣 品 分 析一 步 法 和 兩 步 法 RT-PCR的 比 較 EcoRI 寡 聚 (dT)12-18隨 機(jī) 6堿 基 引 物 R6寡 聚 (dT)12-18 隨 機(jī) 6堿 基 引 物 R6mRNA (A)n(T)12-18(A)n(A)n(T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6第 二 鏈 合 成(A)n(T)12-18 (A)nR6 R6 R6 R6 R6 R6 (A)n(T)12-18 EcoRI加 上 EcoRI接 頭 ， 磷 酸 化 ， cDNA分 級(jí)cDNA合 成 完 畢 ， 準(zhǔn) 備 連 接第 一 鏈 合 成cDNA合 成 過 程 示 意 圖 cDNA序 列 的 克

13、隆 （ 二 ） PCR的 種 類2.Nested PCR： 巢 式 PCR原 理 ： 利 用 兩 套 PCR引 物 （ 巢 式 引 物 ） 對(duì) 進(jìn) 行 兩 輪 PCR擴(kuò) 增 反 應(yīng) 。在 第 一 輪 擴(kuò) 增 中 ， 外 引 物 用 以 產(chǎn) 生 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 ， 此 產(chǎn) 物 在 內(nèi) 引 物 的存 在 下 進(jìn) 行 第 二 輪 擴(kuò) 增 。優(yōu) 點(diǎn) ： 由 于 巢 式 PCR反 應(yīng) 有 兩 次 PCR擴(kuò) 增 ， 從 而 降 低 了 擴(kuò) 增 多 個(gè) 靶位 點(diǎn) 的 可 能 性 （ 因 為 與 兩 套 引 物 都 互 補(bǔ) 的 引 物 很 少 ） 增 加 了 檢 測(cè)的 敏 感 性 ； 兩 對(duì) PCR引 物 與

14、 檢 測(cè) 模 板 的 配 對(duì) ， 增 加 了 檢 測(cè) 的 可 靠 性 ；增 加 有 限 量 靶 序 列 （ 如 稀 有 mRNA） 的 靈 敏 度 ， 并 且 提 高 了 困 難 PCR（ 如 5RACE） 的 特 異 性 。應(yīng) 用 ： 一 般 應(yīng) 用 于 動(dòng) 物 方 面 。 如 ： 病 毒 ， 梅 毒 螺 旋 體 ， HIV， 腫 瘤 基 因 等 。 Nested PCR原 理 示 意 圖 First PCRSecond PCR （ 二 ） PCR的 種 類3.Inverse PCR： 反 向 PCR原 理 ： 用 適 當(dāng) 的 限 制 性 內(nèi) 切 裂 解 含 核 心 區(qū) 的 DNA， 以 產(chǎn)

15、 生 適 合于 PCR擴(kuò) 增 大 小 的 片 段 ， 然 后 片 段 的 末 端 再 連 接 形 成 環(huán) 狀 分 子 。PCR的 引 物 同 源 于 環(huán) 上 核 心 區(qū) 的 末 端 序 列 ， 但 其 方 向 可 使 鏈 的延 長(zhǎng) 經(jīng) 過 環(huán) 上 的 未 知 區(qū) 而 不 是 分 開 引 物 的 核 心 區(qū) 。 這 種 反 向PCR方 法 可 用 于 擴(kuò) 增 本 來 就 在 核 心 區(qū) 旁 邊 的 序 列 ， 還 可 應(yīng) 用 于制 備 未 知 序 列 探 針 或 測(cè) 定 邊 側(cè) 區(qū) 域 本 身 的 上 、 下 游 序 列 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 可 使 已 知 序 列 的 核 心 區(qū) 邊 側(cè) 的 未 知

16、 DNA成 幾 何 級(jí) 數(shù) 擴(kuò) 增 。應(yīng) 用 ： 一 般 應(yīng) 用 于 未 知 序 列 的 擴(kuò) 增 ， 有 時(shí) 也 用 于 定 點(diǎn) 突 變 。 Inverse PCR原 理 示 意 圖 （ 二 ） PCR的 種 類4.PCR-RFLP: 多 聚 酶 鏈 反 應(yīng) (PCR)-限 制 性 片 段 長(zhǎng) 度 多 態(tài) 性 (restriction fragment length Polymorphism， RFLP) 原 理 ： PCR產(chǎn) 物 限 制 性 內(nèi) 切 酶 切 多 態(tài) 性 分 析 ， DNA發(fā) 生 重 排后 ， 酶 切 位 點(diǎn) 發(fā) 生 改 變 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 具 有 分 辯 率 高 ， 無 需

17、標(biāo) 記 ,重 復(fù) 性 好 ， 簡(jiǎn) 便 快 速 直 觀 等 。主 要 用 于 核 酸 變 異 性 分 析 與 比 較 , 微 生 物 的 分 群 分 型 分 亞 型 ， 癌基 因 分 析 ， 遺 傳 病 的 診 斷 等 。 局 限 ： 只 能 應(yīng) 用 突 變 引 起 限 制 性 酶 切 位 點(diǎn) 改 變 的 情 況 下 ， 一 次只 能 完 成 一 個(gè) 特 定 位 點(diǎn) 突 變 篩 選 ， 檢 測(cè) 效 率 低 。 PCR-RFLP原 理 示 意 圖 5.PCR-SSCP： 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) 一 單 鏈 構(gòu) 象 多 態(tài) 性 (single strand conformation polymorp

18、hism)原 理 ： 是 將 經(jīng) 擴(kuò) 增 的 DNA片 段 經(jīng) 過 變 性 處 理 ， 形 成 單 鏈 ， 由 于 序 列不 同 ， 單 鏈 構(gòu) 象 就 有 差 異 ， 在 中 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 中 電 泳 的 遷 移 率不 同 ， 通 過 與 標(biāo) 準(zhǔn) 物 的 對(duì) 比 ， 即 可 檢 測(cè) 出 有 無 變 異 。特 點(diǎn) ： 剛 建 立 時(shí) 是 將 同 位 素 摻 入 PCR擴(kuò) 增 的 產(chǎn) 物 中 ， 通 過 放 射 自 顯影 顯 示 結(jié) 果 。 后 用 銀 染 取 代 同 位 素 顯 示 DNA帶 型 ， 大 大 降 低 了 成 本 ，具 有 經(jīng) 濟(jì) 、 快 速 、 靈 敏 等 特

19、 點(diǎn) 。 1993年 起 用 EB染 色 法 顯 示 DNA帶 型 。優(yōu) 點(diǎn) ： 檢 測(cè) 基 因 變 異 ， 具 有 操 作 簡(jiǎn) 便 、 快 速 、 不 需 特 殊 設(shè) 備 ， 適 用于 大 樣 本 篩 選 。 己 廣 泛 應(yīng) 用 于 檢 測(cè) 各 種 病 原 體 基 因 的 點(diǎn) 突 變 及 缺 失突 變 ， 基 因 的 多 態(tài) 性 分 析 等 。（ 一 ） PCR的 種 類 PCR-SSCP示 意 圖 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) (PCR)可 對(duì) 特 定 核 苷 酸 片 斷 進(jìn) 行 指 數(shù) 級(jí) 的 擴(kuò)增 。 在 擴(kuò) 增 反 應(yīng) 結(jié) 束 之 后 ， 我 們 可 以 通 過 凝 膠 電 泳 的 方

20、 法 對(duì) 擴(kuò) 增產(chǎn) 物 進(jìn) 行 定 性 的 分 析 ， 也 可 以 通 過 放 射 性 核 素 摻 入 標(biāo) 記 后 的 光 密度 掃 描 來 進(jìn) 行 定 量 的 分 析 。 無 論 定 性 還 是 定 量 分 析 ， 分 析 的 都 是 PCR 終 產(chǎn) 物 。 但 是 在 許 多 情 況 下 ， 我 們 所 感 興 趣 的 是 未 經(jīng) PCR 信號(hào) 放 大 之 前 的 起 始 模 板 量 。 例 如 我 們 想 知 道 某 一 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 植 物 轉(zhuǎn)基 因 的 拷 貝 數(shù) 或 者 某 一 特 定 基 因 在 特 定 組 織 中 的 表 達(dá) 量 。 在 這 種需 求 下 熒 光 定 量 PC

21、R技 術(shù) 應(yīng) 運(yùn) 而 生 。 logDNA Cycles logDNA Cycles 實(shí) 時(shí) 定 量 PCR技 術(shù) ， 是 指 在 PCR反 應(yīng) 體 系 中 加 入 熒 光 基 團(tuán) ， 利用 熒 光 信 號(hào) 積 累 實(shí) 時(shí) 監(jiān) 測(cè) 整 個(gè)PCR進(jìn) 程 ， 使 每 一 個(gè) 循 環(huán) 變 得“ 可 見 ” ， 最 后 通 過 Ct值 和 標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 對(duì) 樣 品 中 的 DNA (or cDNA) 的 起 始 濃 度 進(jìn) 行 定 量 的方 法 。 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR是 目 前 確 定 樣品 中 DNA(或 cDNA) 拷 貝 數(shù) 最 敏感 、 最 準(zhǔn) 確 的 方 法 。 Real Tim

22、e PCR and Conventional PCRVS 535 353 5 3 5 3 535 5Taq Taq5 3RepeatDenaturationPrimer AnnealingElongation 常 規(guī) PCR ProcessIn theory, product accumulation is proportional to 2 n, where n is the number of amplification cycle repeats Reality vs. TheoryAmplification is exponential, but the exponential inc

23、rease is limited:n A linear increase follows exponentialn Eventually plateaus TheoreticalReal LifeLog Target DNA Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification. 普 通 PCR和熒光定量PCR的 區(qū) 別常規(guī)PCR是通過電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析（定量不準(zhǔn)確），無法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)；熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)

24、程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA (or cDNA) 的起始濃度進(jìn)行定量的方法（準(zhǔn)確定量） 。 適 用 定 性 分 析 ，不 適 合 定 量 分析 ；PCR 產(chǎn) 物 的 長(zhǎng)度 從 100bp 數(shù) kb 實(shí) 時(shí) 檢 測(cè) :每 個(gè) 循環(huán) 都 產(chǎn) 出 熒 光 信 號(hào) 絕 對(duì) 定 量 ， 靈 敏 度更 高 PCR產(chǎn) 物 的 長(zhǎng) 度 一般 在 60-150 bps 熒 光 定 量 PCR的 原 理基 本 原 理 ： 擴(kuò) 增 呈 指 數(shù) 增 長(zhǎng) ， 在 反 應(yīng) 體 系 和 條 件 完 全 一 致 的 情 況下 ， 樣 本 DNA含 量 與 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 的 對(duì) 數(shù) 成

25、正 比 。 由 于 反 應(yīng) 體 系 中 的 熒光 染 料 或 熒 光 標(biāo) 記 物 (熒 光 探 針 )與 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 結(jié) 合 發(fā) 光 ， 其 熒 光 量 與 擴(kuò)增 產(chǎn) 物 量 成 正 比 。 因 此 ， 通 過 熒 光 量 的 檢 測(cè) 就 可 以 測(cè) 定 樣 本 核 酸 量 。熒 光 化 合 物 分 為 兩 類（ 1） 非 特 異 性 的 嵌 入 熒 光 染 料 ： 利 用 嵌 入 熒 光 染 料 檢 測(cè) ， 只 是 簡(jiǎn) 單地 反 映 PCR反 應(yīng) 體 系 中 總 的 核 酸 量 ， 是 一 種 非 特 異 性 的 檢 測(cè) 方 法 。（ 2） 特 異 性 熒 光 (引 物 )探 針 ： 增

26、 加 了 探 針 的 識(shí) 別 步 驟 ,特 異 性 、 專 一性 更 高 。 非 特 異 性 的 嵌 入 熒 光 染 料 （ Non-specific DNA binding dyes） SYBR Green I SYBR Gold Ethidium Bromide Cycle 1Cycle 3Cycle 2 Molecular Probe公 司的 一 個(gè) 專 利產(chǎn) 品 ，US Patent5,436,134 1993年 7月12日 申 請(qǐng) 簡(jiǎn) 便 可 以 使 用 已 有 的 引 物 普 遍 通 用 可 以 檢 測(cè) 所 有 的 雙 鏈 DNA， 包 括 引 物 二 聚 體 ； 需 要 化 大

27、力 氣 優(yōu) 化 反 應(yīng) 條 件 ， 以 消 除 非 特 異 性擴(kuò) 增 ； $1 / PCR 反 應(yīng) Extension5 353 5 3 53 Extension ContinuedApply ExcitationWavelength5 353 5 5Taq Taq 353 Taq Taq5 5Repeat DNA binding dyesBD BD BD BDBD BD BD BDBD BDl l ll l 特 異 性 的 熒 光 探 針 特 異 性 的 熒 光 探 針 是 把 熒 光 化 合 物 標(biāo) 記 到 特 異 性 的 寡核 苷 酸 上 形 成 熒 光 標(biāo) 記 的 DNA探 針 。 通

28、 過 探 針 與 PCR產(chǎn)物 特 異 性 的 結(jié) 合 ,在 PCR過 程 中 可 對(duì) 產(chǎn) 物 實(shí) 現(xiàn) 均 相 、 實(shí)時(shí) 、 定 量 檢 測(cè) ,也 適 用 于 多 通 道 檢 測(cè) 。 TaqMan探 針 ABI 公 司 首 先 推 出 (PRISM 7000系 列 ) US Patent 5,723,591, 1995年 11月 申 請(qǐng) 。 實(shí) 時(shí) 檢 測(cè) : 每 個(gè) 循 環(huán) 都 會(huì) 產(chǎn) 生 與 PCR產(chǎn)物 成 正 比 的 熒 光 物 質(zhì) TaqMan探 針 是 一 段 5端 標(biāo) 記 報(bào) 告 熒 光 基 團(tuán) (R),3端 標(biāo) 記 淬 滅 熒 光 基 團(tuán)(Q)的 寡 核 苷 酸 ,其 序 列 與

29、模 板 DNA中 的 一 段 完 全 互 補(bǔ) 。 當(dāng) 探 針 單 獨(dú) 存 在 時(shí) ,由 于 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移 的 發(fā) 生 ,R的 熒 光 受 到 Q的 猝滅 。 在 PCR過 程 中 ,由 于 TaqDNA酶 的 5-3外 切 酶 活 性 的 作 用 ,使 探 針的 5端 的 R被 切 斷 ,加 大 了 與 Q的 距 離 而 使 熒 光 恢 復(fù) 。 一 分 子 的 產(chǎn) 物 生 成 就 伴 隨 著 一 分 子 的 熒 光 信 號(hào) 的 產(chǎn) 生 。 隨 著 擴(kuò) 增 循 環(huán)數(shù) 的 增 加 ,釋 放 出 來 的 熒 光 基 團(tuán) 不 斷 積 累 。 因 此 ,Taqman探 針 檢 測(cè) 的是

30、 積 累 熒 光 。 Cleavage-based assay:TaqManTM5 533 d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers 5 353 5 35 3 5 353 5353 Add Master Mix and SampleDenaturation 5 353 5 35 3 5353 Annealing Reaction TubeTaq l5 3R QProbe 5 3R Q 5 35353 RQ Extension Step5 3 1. Strand DisplacementTaq3Q R 5 5 33Q TaqR 5 2. Cleavag

31、e3. PolymerizationComplete5 3QTaq R3 5 4. Detection 5 33 QTaq R 5l RCleavage-based assay:TaqManTM Cycle 一 般 而 言 ， 熒 光 擴(kuò) 增 曲 線 擴(kuò) 增 曲 線 可 以 分 成 三 個(gè) 階 段 ： 熒 光 背 景 信 號(hào) 階 段 , 熒 光 信 號(hào)指 數(shù) 擴(kuò) 增 階 段 和 平 臺(tái) 期 。 在 熒 光 背 景 信 號(hào) 階 段 ， 擴(kuò) 增 的 熒 光 信 號(hào) 被 熒 光 背 景 信 號(hào) 所 掩 蓋 ，我 們 無 法 判 斷 產(chǎn) 物 量 的 變 化 。 而 在 平 臺(tái) 期 ， 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物

32、已 不 再 呈 指 數(shù) 級(jí) 的 增 加 。 PCR 的 終產(chǎn) 物 量 與 起 始 模 板 量 之 間 沒 有 線 性 關(guān) 系 ， 所 以 根 據(jù) 最 終 的 PCR 產(chǎn) 物 量 不 能 計(jì) 算 出 起 始 DNA 拷 貝 數(shù) 。 只 有 在 熒 光 信 號(hào) 指 數(shù) 擴(kuò) 增 階 段 ， PCR 產(chǎn) 物 量 的 對(duì) 數(shù) 值 與 起 始 模 板 量 之 間 存在 線 性 關(guān) 系 ， 我 們 可 以 選 擇 在 這 個(gè) 階 段 進(jìn) 行 定 量 分 析 。 為 了 定 量 和 比 較 的 方 便 ， 在 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 技 術(shù) 中 引 入 了 兩 個(gè) 非 常 重 要 的 概 念 ：熒 光

33、 閾 值 和 CT 值 。 熒 光 閾 值 是 在 熒 光 擴(kuò) 增 曲 線 上 人 為 設(shè) 定 的 一 個(gè) 值 ， 它 可 以 設(shè) 定 在 熒 光信 號(hào) 指 數(shù) 擴(kuò) 增 階 段 任 意 位 置 上 ， 但 一 般 我 們 將 熒 光 域 值 的 缺 省 設(shè) 置 是 3-15 個(gè) 循 環(huán) 的 熒 光信 號(hào) 的 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 的 10 倍 。 每 個(gè) 反 應(yīng) 管 內(nèi) 的 熒 光 信 號(hào) 到 達(dá) 設(shè) 定 的 域 值 時(shí) 所 經(jīng) 歷 的 循 環(huán) 數(shù) 被稱 為 C T 值 。 Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory PCR擴(kuò) 增 過 程 中 ，擴(kuò)

34、增 產(chǎn) 物 熒 光 信 號(hào) 超過 基 線 值 （ 進(jìn) 入 指 數(shù)增 長(zhǎng) 期 ） 時(shí) 的 循 環(huán) 數(shù) 。 principle of quantitative real-time PCR use when rather than how much fluorescent signal PCR cycles Low (high copy no.) High CT(low copy no.)real-time PCR amplification plots (7 x 10-fold dilns. + NTC) End point(not quantitative)threshold ofdetecti

35、onCT Correlates strongly with the starting copy number Is linear with the log of starting copy number 10ng 0.001ngTitrate a template; 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng 模板起始濃度越高，Ct值越小 Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系Ct值 與 模 板 起 始 濃 度 的 關(guān) 系 如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個(gè)循環(huán)到達(dá) 如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個(gè)循環(huán)到達(dá) 雜 合 子野 生 性 純 合 子 突 變 純 合 子 不 能 在

36、 同 一 管 中 進(jìn) 行 多 片 斷 擴(kuò) 增 不 同 的 基 因 必 須 在 不 同 的 試 管 中 管 之 間 的 精 確 度 跟 多 熒 光 系 統(tǒng) 同 等 的 精 確 和 可 靠 靈 敏 度 高 ， 定 量 方 便 費(fèi) 用 高 1996 1997 1998 1999 2000 基 因 、 DNA片 段 的 克 隆 人 工 基 因 構(gòu) 建 DNA序 列 測(cè) 定 基 因 定 點(diǎn) 突 變 基 因 型 （ 突 變 ） 檢 測(cè) ， SNP分 析 ， 遺 傳 背 景 分 析 生 物 物 種 鑒 定 ， 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 研 究 基 因 表 達(dá) 量 研 究 （ real-time PCR） / 基 因 表 達(dá) 譜 研 究 （ DNA chip, SAGE） 疾 病 基 因 檢 測(cè) / 遺 傳 病 的 產(chǎn) 前 診 斷 致 病 病 原 體 的 檢 測(cè) 腫 瘤 治 療 中 癌 基 因 的 檢 測(cè) DNA指 紋 、 個(gè) 體 識(shí) 別 、 親 子 關(guān) 系 鑒 別 、法 醫(yī) 物 證