《熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)FluorescenceInSituHybridiza》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)FluorescenceInSituHybridiza（35頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 熒 光 原 位 雜 交 實(shí) 驗(yàn) Fluorescence In Situ Hybridization 原 位 雜 交 (In situ hybridization)1） 同 位 素 原 位 雜 交 (Isotopic in situ hybridization) 70年 代 2） 非 同 位 素 原 位 雜 交 (Non-isotopic in situ hybridization) 80年 代 中 后 期 （ 1） 免 疫 酶 聯(lián) （ 2） 熒 光 原 位 雜 交 （ Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同 位 素 原 位 雜 交 的 不 足

2、 之 處 ：1） 不 穩(wěn) 定 ；2） 高 背 景 ；3） 曝 光 時(shí) 間 長 ；4） 結(jié) 果 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理 繁 瑣 。 5） 同 位 素 的 使 用 和 處 理 實(shí) 驗(yàn) 的 基 本 原 理 :FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. DNA for probe use is labeled with fluorescent

3、 (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence micro

4、scope. *熒 光 原 位 雜 交 的 特 點(diǎn) ：1） 快 速 ； 2） 信 號(hào) 強(qiáng) ； 3） 特 異 性 高 ； 4） 多 色 。*FISH有 上 述 優(yōu) 點(diǎn) 的 原 因 ：使 用 了 熒 光 標(biāo) 記 與 檢 測(cè) 系 統(tǒng) 取 代 放 射 性 標(biāo) 記 與 檢 測(cè) 系 統(tǒng)標(biāo) 記 探 針 的 物 質(zhì) ： （ 1） 生 物 素 (biotin)/地 高 辛 (digoxigenin) 半 抗 原 報(bào) 告 分 子 （ 間 接 標(biāo) 記 ） （ 2） 熒 光 物 質(zhì) （ 直 接 標(biāo) 記 ） FLUORESCENT labeled dUTP HAPTENE labeled dUTP AMCA-6-dUT

5、PCascadeBlue-4-dUTPFluorescein-12-dUTPRhodamine-6-dUTPTexasRed-6-dUTPCy3-6-dUTPCy5-dUTP Biotin(BIO)-11-dUTPDigoxygenin(DIG)-11-dUTPDinitrophenyl (DNP)-11-dUTP 染 色 體 復(fù) 染 的 物 質(zhì) : Propidium Iodide (PI)（ 紅 色 ）DAPI（ 蘭 色 ）quinacrine（ 綠 色 ）chromomycine A3（ 綠 色 ） 染 色 體 “ 原 位 抑 制 ” 雜 交 （ chromosome in situ s

6、uppression, CISS)克 服 散 在 的 重 復(fù) 序 列 造 成 的 雜 交 背 景 ， 提 高 信 號(hào) 的 特 異 性 ， 在 探 針中 加 入 過 量 的 未 標(biāo) 記 的 競 爭 性 DNA(competitor DNA)， 如 human Cot-1 DNA， 進(jìn) 行 雜 交 前 的 預(yù) 復(fù) 性 。 探 針 中 的 重 復(fù) 序 列 與 加 入 的 競爭 物 中 的 大 量 重 復(fù) 序 列 優(yōu) 先 復(fù) 性 ， 而 特 異 性 的 單 拷 貝 序 列 因 競 爭 物中 同 源 序 列 拷 貝 數(shù) 少 ， 絕 大 部 分 仍 保 持 單 鏈 狀 態(tài) 。*FISH技 術(shù) 的 應(yīng) 用1

7、） 基 因 （ 或 DNA片 段 ） 的 染 色 體 定 位 ；2） 染 色 體 數(shù) 目 與 結(jié) 構(gòu) 異 常 的 檢 測(cè) ；3） 間 期 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) （ 絨 毛 /羊 水 /精 子 /卵 裂 球 /其 它 間 期 細(xì) 胞 研 究 與 診 斷 ） ；4） 腫 瘤 遺 傳 學(xué) 研 究 *用 于 FISH的 探 針1） 單 拷 貝 探 針 ： （ 1） 種 類 ： YAC， BAC， Cosmid， Plasmid， cDNA片 段 （ 2） 應(yīng) 用 （ a） 定 位 DNA片 段 及 嵌 合 體 克 隆 驗(yàn) 證 ； （ b） 確 定 染 色 體 微 小 缺 失 與 重 復(fù) ； （ c） 染

8、 色 體 斷 裂 點(diǎn) 分 析 。 （ d） 間 期 細(xì) 胞 染 色 體 數(shù) 目 異 常 診 斷 。 DNA片 段 的 染 色 體 定 位 FISH檢 測(cè) 微 小 缺失 染 色 體 片 段 重 復(fù) Dup 19(p13.2-13.1 21q22.2 BAC克 隆 在 Down綜 合 征 間 期 細(xì) 胞 中 的 雜 交 信 號(hào) ） 簡 單 重 復(fù) 序 列 探 針 (simple repetitive probes)異 染 色 質(zhì) 著 絲 粒 探 針 (heterochromatic centromer probes)其 靶 序 列 為 衛(wèi) 星 DNA或 衛(wèi) 星 III DNA(alpha sate

9、llite/satellite III DNA)多 位 于 染 色 體 的 著 絲 粒 和 異染 色 質(zhì) 區(qū) 域 ， 重 復(fù) 數(shù) 百 次 至 數(shù) 千 次 。特 點(diǎn) ： 信 號(hào) 強(qiáng)應(yīng) 用 ： (a)標(biāo) 記 染 色 體 識(shí) 別 (b)染 色 體 數(shù) 目 異 常 檢 測(cè) (c)間 期 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 研 究 和 臨 床 診 斷 *間 期 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 的 意 義 ：細(xì) 胞 分 裂 期 僅 占 整 個(gè) 細(xì) 胞 周 期 的 幾 分 之 一 至 幾 十分 之 一 ， 經(jīng) 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 和 相 應(yīng) 處 理 才 能 獲 得 染 色 體 。人 體 的 大 部 分 細(xì) 胞 并 不 進(jìn) 行 分 裂 ，

10、很 難 通 過 培 養(yǎng)獲 得 中 期 染 色 體 分 裂 相 ， 間 期 FISH為 這 一 時(shí) 期遺 期 傳 物 質(zhì) 的 研 究 提 供 了 可 能 ， 而 且 快 速 。 ） 染 色 體 涂 染 探 針 (chromosome painting probes) 整 條 染 色 體 探 針 或 染 色 體 區(qū) 帶 特 異 性 探 針探 針 來 源 ：（ 1） 含 有 人 單 條 染 色 體 的 人 -嚙 齒 類 (human-rodent)體 細(xì) 胞 雜 種 組 織 融 合 的 產(chǎn) 物 ；（ 2） 熒 光 激 活 的 流 式 細(xì) 胞 儀 (fluorescence-activated cel

11、l sorter,FACS)分 離 整 條 染 色 體 DNA， 并 以 載 體 克 隆 /PCR 擴(kuò) 增 ；（ 3） 顯 微 切 割 得 到 染 色 體 或 染 色 體 片 段 ， PCR擴(kuò) 增 ；應(yīng) 用 （ 1） 染 色 體 數(shù) 目 和 結(jié) 構(gòu) 異 常 分 析 ； （ 2） 不 同 物 種 間 的 同 源 性 比 較 ； （ 3） 白 血 病 及 其 它 腫 瘤 的 染 色 體 診 斷 和 研 究 。 多 色 FISH（ muti-color FISH) 多 色 復(fù) 合 染 色 體 FISH探 針 (multiplex FISH, M-FISH probes)#兩 種 以 上 不 同 的

12、非 同 位 素 標(biāo) 記 ， 不 同 的 熒 光 檢 測(cè) 系 統(tǒng) ，通 過 不 同 的 濾 光 片 組 合 或 極 少 數(shù) 幾 種 非 同 位 素 標(biāo) 記 探 針后 ， 按 照 不 同 的 比 例 混 合 ， 可 以 顯 示 多 種 顏 色 。 實(shí) 驗(yàn) 的 基 本 操 作 步 驟 及 時(shí) 間 安 排一 淋 巴 細(xì) 胞 的 培 養(yǎng) 及 染 色 體 標(biāo) 本 制 備第 一 天 （ 星 期 一 ） 采 血 、 接 種 （ 10:00）第 二 天 （ 星 期 二 ） 培 養(yǎng)第 三 天 （ 星 期 三 ） 培 養(yǎng)第 四 天 （ 星 期 四 ） 上 午 7:00 加 秋 水 仙 素 ,(終 濃 度 0.2ug

13、/ml） 至 上 午 10:00結(jié) 束 培 養(yǎng)制 片 ， 不 染 色 ， 在 顯 微 鏡 下 挑 選 分 散 良 好 的 標(biāo) 本 。 將 選 好 的標(biāo) 本 放 入 50 烤 片 。 第 五 天 （ 星 期 五 ）探 針 變 性 ： 75 水 浴 5分 鐘 ， 立 即 置 于 0 （ 冰 浴 中 ） 5-10分 鐘 。玻 片 標(biāo) 本 變 性 ：1. 50 溫 箱 中 2小 時(shí)2. 標(biāo) 本 在 70-75 ， 70%甲 酰 胺 /2XSSC中 變 性 2-3分 鐘 。3. 立 即 脫 水 ， 70-90-100%順 序 ， 各 5分 鐘 。4 .室 溫 干 燥 原 位 雜 交 ：將 變 性 的 D

14、NA探 針 10ul滴 于 變 性 并 脫 水 的玻 片 標(biāo) 本 上 ， 蓋 上 蓋 玻 片 ， Parafilm封 片 ，置 于 濕 盒 中 37 雜 交 過 夜 。 （ 15-17hr） 第 五 天 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 束 (第 六 天 ， 星 期 六 )洗 脫 、 信 號(hào) 放 大 和 免 疫 熒 光 檢 測(cè)1.用 刀 片 將 蓋 片 揭 起 ， 輕 輕 移 掉 。2 . 45 50%甲 酰 胺 /2XSSC中 洗 3次 ， 每 次 5分 鐘 。3. 45 1XSSC中 洗 3次 ， 每 次 5分 鐘 。 4. 室 溫 下 ， 2XSSC輕 洗 一 下 。5 加 180ul封 閉 液 I， 以 薄

15、 膜 蓋 片 ， 37 溫 育 20分 鐘， 加 入 180ul avidin-FITC,37 溫 育 45分 鐘 。6.取 出 標(biāo) 本 ， 45 ， 4XSSC/0.1%Tween20中 洗 3 次 ， 每 次 5分 鐘 。 7 加 封 閉 液 II,37 溫 育 20分 鐘 。8 加 180ul antiavidin于 標(biāo) 本 上 ， 37 45分 鐘 。9 取 出 標(biāo) 本 ， 45 ， 4XSSC/0.1%Tween20中 洗 3次 ， 每 次 5分 鐘 。10 加 180ul封 閉 液 I， 37 溫 育 20分 鐘 。11 加 180ul avidin-FITC， 37 溫 育 45分 鐘 。12取 出 標(biāo) 本 ， 45 ， 4XSSC/0.1%Tween20中 洗 2次 ， 每 次 5分 鐘 。 再 于 2XSSC室 溫 輕 洗 一 下 。 13 將 玻 片 自 然 干 燥 ， PI/antifade復(fù) 染 ， 蓋 上 蓋 片 。14 鏡 檢 、 照 相 。