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1、原 位 雜 交 技 術(shù) 原 位 雜 交 技 術(shù)原 位 雜 交 技 術(shù) 的 歷 史 發(fā) 展二 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 原 理 及 分 類三 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 一 般 過 程四 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 一 、 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 歷 史 發(fā) 展 原 位 雜 交 技 術(shù) (In situ hybridization， ISH)是 分 子 生 物 學(xué) 、組 織 化 學(xué) 及 細(xì) 胞 學(xué) 相 結(jié) 合 而 產(chǎn) 生 的 一 門 新 興 技 術(shù) ， 始 于 20世 紀(jì)60年 代 。 1969年 美 國(guó) 耶 魯 大 學(xué) 的 Gall等 首 先 用 爪 蟾 核 糖 體 基 因探 針

2、 與 其 卵 母 細(xì) 胞 雜 交 ， 將 該 基 因 進(jìn) 行 定 位 ， 與 此 同 時(shí) Buongiorno Nardelli和 Amaldi等 (1970)相 繼 利 用 同 位 素 標(biāo) 記核 酸 探 針 進(jìn) 行 了 細(xì) 胞 或 組 織 的 基 因 定 位 ， 從 而 創(chuàng) 造 了 原 位 雜 交技 術(shù) 。 自 此 以 后 ， 由 于 分 子 生 物 學(xué) 技 術(shù) 的 迅 猛 發(fā) 展 ， 特 別 是 20世 紀(jì) 70年 代 末 到 80年 代 初 ， 分 子 克 隆 、 質(zhì) 粒 和 噬 菌 體 DNA的 構(gòu) 建成 功 ， 為 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 發(fā) 展 奠 定 了 深 厚 的 技 術(shù)

3、基 礎(chǔ) 。 二 、 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 原 理 及 分 類 概 念 ： 原 位 雜 交 技 術(shù) (In situ hybridization， ISH)是 用標(biāo) 記 的 核 酸 探 針 ， 經(jīng) 放 射 自 顯 影 或 非 放 射 檢 測(cè) 體 系 ，在 組 織 ， 細(xì) 胞 、 間 期 核 及 染 色 體 上 對(duì) 核 酸 進(jìn) 行 定 位和 相 對(duì) 定 量 研 究 的 一 種 手 段 。原 理 ： 利 用 核 酸 分 子 單 鏈 之 間 有 互 補(bǔ) 的 堿 基 序 列 ， 將有 放 射 性 或 非 放 射 性 的 外 源 核 酸 (即 探 針 )與 組 織 、 細(xì) 胞 或 染 色 體 上 待

4、 測(cè) DNA或 RNA互 補(bǔ) 配 對(duì) ， 結(jié) 合 成 專 一 的 核 酸 雜 交 分 子 ， 經(jīng) 一 定 的 檢 測(cè) 手 段 將 待 測(cè) 核 酸 在 組 織 、 細(xì) 胞 或 染 色 體 上 的 位 置 顯 示 出 來 。 分 類1、 基 因 組 原 位 雜 交 技 術(shù) 基 因 組 原 位 雜 交 (GISH)技 術(shù) 是 20世 紀(jì) 80年 代 末 發(fā) 展 起 來 的 一 種 原 位 雜 交技 術(shù) 。 它 主 要 是 利 用 物 種 之 間 DNA同 源 性 的 差 異 ， 用 另 一 物 種 的 基 因 組 DNA以 適 當(dāng) 的 濃 度 作 封 阻 ， 在 靶 染 色 體 上 進(jìn) 行 原 位

5、雜 交 。 2、 熒 光 原 位 雜 交 技 術(shù) 熒 光 原 位 雜 交 (FISH)技 術(shù) 是 在 已 有 的 放 射 性 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 基 礎(chǔ) 上 發(fā) 展 起 來 的 一 種 非 放 射 性 DNA分 子 原 位 雜 交 技 術(shù) 。 它 利 用 熒 光 標(biāo) 記 的 核 酸 片 段 為 探 針 ， 與 染 色 體 上 或 DNA顯 微 切 片 上 的 特 異 fl-N： 行 雜 交 ， 通 過 熒 光 檢 測(cè) 系 統(tǒng) (熒 光 顯 微 鏡 )檢 測(cè) 信 號(hào) DNA序 列 在 染 色 體 或 DNA顯 微 切 片 上 的 目 的 DNA序 列 ， 進(jìn) 而 確 定 其 雜 交 位

6、點(diǎn) 。 3 、 多 彩 色 熒 光 原 位 雜 交 技 術(shù) 多 彩 色 熒 光 原 位 雜 交 (mFISH)是 在 熒 光 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 基 礎(chǔ) 上 發(fā) 展 起 來 的 一 種 新 技 術(shù) ， 它 用 幾 種 不 同 顏 色 的 熒 光 素 單 獨(dú) 或 混 合 標(biāo) 記 的 探 針 進(jìn) 行 原 位 雜 交 ， 能 同 時(shí) 檢 測(cè) 多 個(gè) 靶 位 ， 各 靶 位 在 熒 光 顯 微 鏡 下 和 照 片 上 的 顏 色 不 同 ， 呈 現(xiàn) 多 種 色 彩 。4、 原 位 PCR 原 位 PCR技 術(shù) 是 常 規(guī) 的 原 位 雜 交 技 術(shù) 與 PCR技 術(shù) 的 有 機(jī) 結(jié) 合 ， 即

7、 通 過 PCR技 術(shù) 對(duì) 靶 核 酸 序 列 在 染 色 體 上 或 組 織 細(xì) 胞 內(nèi) 進(jìn) 行 原 位 擴(kuò) 增 使 其 拷 貝 數(shù) 增加 ， 然 后 通 過 原 位 雜 交 技 術(shù) 進(jìn) 行 檢 測(cè) ， 從 而 對(duì) 靶 核 酸 序 列 進(jìn) 行 定 性 、 定位 和 定 量 分 析 。 三 、 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 一 般 過 程以 經(jīng) 過 標(biāo) 記 的 已 知 核 酸 分 子 為 探 針以 細(xì) 胞 內(nèi) 與 探 針 序 列 互 補(bǔ) 的 特 異 核 酸 分 子 為 靶 分 子在 一 定 條 件 下 使 探 針 與 靶 核 酸 分 子 在 原 位 發(fā) 生 雜 交再 對(duì) 其 探 測(cè) 探 針 標(biāo)

8、記 靶 核 酸分 子雜 交檢 測(cè) 一 ） 、 探 針 是 含 有 互 補(bǔ) 順 序 的 外 源 性 被 標(biāo) 記 的 DNA或 RNA片段 ， 是 在 原 位 雜 交 中 用 于 檢 測(cè) 細(xì) 胞 內(nèi) 特 定 DNA或RNA順 序 定 位 的 特 殊 試 劑 ， 探 針 的 堿 基 序 列 是 已知 的 ， 只 能 與 特 定 的 核 酸 分 子 結(jié) 合 上1、 cDNA2、 RNA 3、 寡 核 苷 酸 1、 cDNA (plementary DNA) 互 補(bǔ) 于 mRNA的 DNA分 子（ 長(zhǎng) 度 為 數(shù) 百 -數(shù) 千 堿 基 對(duì) ） 克 隆 于 質(zhì) 粒 中 ， 可 以 無 限 繁 殖 ， 取

9、之 不 盡 較 穩(wěn) 定 ， 不 易 被 降 解 標(biāo) 記 方 法 可 靠 易 行優(yōu) 點(diǎn) 優(yōu) 點(diǎn) ： 雜 交 效 率 比 DNA探 針 高 在 檢 測(cè) mRNA時(shí) 所 形 成 的 RNA-mRNA雜 交 體 比 DNA-mRNA雜 交 體 穩(wěn) 定 可 以 同 時(shí) 得 到 同 義 RNA鏈 和 反 義 RNA鏈 缺 點(diǎn) ： 2、 RNA RNA是 單 鏈 分 子（ 探 針 長(zhǎng) 度 50-300堿 基 對(duì) ） 這 類 探 針 是 根 據(jù) 靶 分 子 而 設(shè) 計(jì) 序 列 在 DNA合 成 儀 上 用 化 學(xué) 方 法 合 成 優(yōu) 點(diǎn) ： 形 成 雜 交 體 快 速 （ 序 列 短 鏈 ， 雜 交 時(shí) 易

10、于 穿 透 ） 缺 點(diǎn) ： 特 異 性 較 低 （ 短 鏈 和 簡(jiǎn) 單 ） 短 鏈 探 針 (長(zhǎng) 度 10-50個(gè) 核 苷 酸 ) 3、 寡 核 苷 酸 二 ） 、 探 針 標(biāo) 記1、 標(biāo) 記 物 （ 1） 放 射 性 標(biāo) 記 物 （ 2） 非 放 射 性 標(biāo) 記 物2、 標(biāo) 記 方 法 （ 1） DNA探 針 標(biāo) 記 （ 2） RNA探 針 標(biāo) 記 （ 3） 寡 核 苷 酸 探 針 標(biāo) 記 1、 標(biāo) 記 物 高 度 靈 敏 性 ； 標(biāo) 記 物 與 核 酸 探 針 結(jié) 合 ， 應(yīng) 絕 對(duì) 不 能 影 響 核 酸 探 針 與模 板 的 結(jié) 合 能 力 及 結(jié) 合 的 特 異 性 ； 當(dāng) 用 酶

11、促 方 法 進(jìn) 行 標(biāo) 記 時(shí) ， 應(yīng) 對(duì) 酶 促 活 性 （ Km值 ） 無多 大 影 響 ， 以 保 證 標(biāo) 記 反 應(yīng) 的 效 率 和 標(biāo) 記 產(chǎn) 物 的 比 活 性 ； 高 度 特 異 性 ； 較 高 的 化 學(xué) 穩(wěn) 定 性 ， 保 存 時(shí) 間 長(zhǎng) ， 標(biāo) 記 及 檢 測(cè) 方 法 簡(jiǎn)單 ； 對(duì) 環(huán) 境 無 污 染 ， 對(duì) 人 體 無 損 傷 ； 價(jià) 格 低 廉 等 。 放 射 性 標(biāo) 記 物 ： 同 位 素 5S、 33P、 32P 和 3H等非 放 射 性 標(biāo) 記 物 ： 熒 光 素 生 物 素 地 高 辛 溴 脫 氧 尿 嘧 啶 等某 種 單 核 苷 酸 在 單 核 苷 酸 分 子

12、 中 導(dǎo) 入 某 個(gè) 原 子 、 功 能 基 團(tuán) 或 側(cè) 鏈 分 子 作 為 標(biāo) 記 物 ， 對(duì) 堿 基 配 對(duì) 不 造 成 影 響 35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP32P-dATP等 等四 甲 基 羅 達(dá) 明 -UTP 生 物 素 -UTP (Bio-UTP) 地 高 辛 -dUTP (Dig-dUTP) 溴 脫 氧 尿 嘧 啶 本 身 為 標(biāo) 記 分 子 2、 標(biāo) 記 方 法（ 1） DNA探 針 標(biāo) 記 切 口 移 位 法 隨 機(jī) 引 物 法（ 2） RNA探 針 標(biāo) 記在 體 外 轉(zhuǎn) 錄 技 術(shù) 中 與 探 針 制 備 同 時(shí) 完 成（ 3） 寡 核

13、苷 酸 探 針 標(biāo) 記末 端 轉(zhuǎn) 移 法 切口平移法 隨機(jī)引物法 三 ） 、 靶 核 酸 分 子或 靶 序 列 ） ： 指 所 要 探 測(cè) 的 核 酸 分 子 或 核 苷 酸 序 列 （ DNA 或 RNA）可 以 是 中 期 染 色 體 上 的 或 是 間 期 細(xì) 胞 核 內(nèi) 的 ， 也 可 以 是 線 粒 體 DNA或 病 毒 DNA可 以 是 編 碼 細(xì) 胞 合 成 的 任 何 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 mRNA， 也 可 以 是 核 糖 體 rRNA 線 粒 體 或 病 毒 RNA 四 ） 、 雜 交 1、 雜 交 體 hybrids DNA-DNA雜 交 雙 鏈 分 子 2、 雜 交

14、條 件（ 1） 雜 交 液 （ 2） 探 針 濃 度 （ 3） 溫 度 （ 4） pH （ 5） 時(shí) 間（ 1） 、 雜 交 液 鈉 鹽 （ 雜 交 效 率 非 特 異 反 應(yīng) ） 甲 酰 胺 （ 使 雜 交 所 需 溫 度 降 低 ） 硫 酸 葡 聚 糖 （ 提 高 探 針 濃 度 ） 牛 血 清 白 蛋 白 和 載 體 DNA等 （ 阻 斷 探 針 與 組 織 非 特 異 結(jié) 合 ， 背 景 ） 雜 交 條 件（ 2） 、 探 針 濃 度探 針 濃 度 影 響 雜 交 反 應(yīng) 的 速 度 放 射 性 標(biāo) 記 探 針 0.5 g/ml 非 放 射 性 為 2 g/ml 最 適 宜 的 探 針

15、 濃 度 要 經(jīng) 實(shí) 驗(yàn) 摸 索 得 到 確 定（ 1） 雜 交 液 （ 2） 探 針 濃 度 （ 3） 溫 度 （ 4） pH （ 5） 時(shí) 間 雜 交 條 件（ 3） 、 溫 度雜 交 時(shí) 溫 度 一 般 低 于 相 應(yīng) 雜 交 體 的 Tm值 25Tm值 ： 是 核 酸 的 融 解 溫 度 ， 是 一 半 雙 鏈 分 子 解 鏈 時(shí) 的 溫 度 ） 當(dāng) 雜 交 液 含 50%甲 酰 胺 、 鹽 濃 度 0.75mol/L左 右 時(shí) 雜 交 溫 度 ： 對(duì) DNA探 針 是 42 對(duì) RNA探 針 是 50-55 對(duì) 寡 核 苷 酸 探 針 是 371） 雜 交 液 （ 2） 探 針 濃

16、度 （ 3） 溫 度 （ 4） pH （ 5） 時(shí) 間 雜 交 條 件（ 4） 、 PHpH在 5-9范 圍 內(nèi) ， 雜 交 體 形 成 不 受 影 響 常 用 緩 沖 液 pH為 6.5-7.5（ 5） 、 時(shí) 間一 般 探 針 濃 度 下 ， 雜 交 反 應(yīng) 在 4-6小 時(shí) 內(nèi) 完 成 孵 育 6小 時(shí) 后 - 雜 交 信 號(hào) 不 再 增 強(qiáng) 反 應(yīng) 超 過 24小 時(shí) 后 - 已 形 成 的 雜 交 體 可 能 發(fā) 生 解 鏈 ， 雜 交 信 號(hào) 反 而 減 弱（ 1） 雜 交 液 （ 2） 探 針 濃 度 （ 3） 溫 度 （ 4） pH （ 5） 時(shí) 間 3、 嚴(yán) 格 度在 某 些

17、 條 件 下 ， 探 針 可 以 與 含 不 相 配 堿 基 的 核 酸 序 列 結(jié) 合 而 形 成 不 穩(wěn) 定 的 雜 交 體 高 嚴(yán) 格 度 條 件 下 堿 基 完 全 互 補(bǔ) 的 雙 鏈 可 形 成雜 交 體 低 嚴(yán) 格 度 條 件 下 堿 基 對(duì) 不 完 全 互 補(bǔ) 的 雙 鏈 也能 形 成 雜 交 體嚴(yán) 格 度 （ stringency） 決 定 探 針 是 否 與 含 不 相 配 堿 基 的 核 酸 序 列 結(jié) 合 的 條 件 稱 為 嚴(yán) 格 度 五 ） 、 雜 交 體 的 探 測(cè)使 標(biāo) 記 的 雜 交 體 在 光 鏡 或 電 鏡 下 可 見 （ 一 ） 放 射 自 顯 影 方 法

18、 （ 二 ） 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 方 法 （ 一 ） 、 放 射 自 顯 影 方 法方 法 ： 切 片 上 涂 覆 核 子 乳 膠 膜 置 于 暗 盒 中 于 4 干 燥 處 自 顯 影 經(jīng) 顯 影 和 定 影 后 在 顯 微 鏡 下 觀 察 銀 粒 在 細(xì) 胞 和 細(xì) 胞 器 的 分 布 情 況用 同 位 素 標(biāo) 記 探 針 來 顯 示 雜 交 反 應(yīng) 的 方 法 （ 二 ） 、 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 方 法報(bào) 告 分 子 （ reportermolecules） 在 雜 交 后 探 測(cè) 技 術(shù) 中 ， 為 顯 示 探 針 標(biāo) 記 物 而 使 用 的 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 標(biāo) 記 物

19、 常 被 叫 做 報(bào) 告 分 子 即 與 抗 體 （ 或 親 和 素 、 A蛋 白 、 ） 聯(lián) 結(jié) ， 最 終 在 顯 微 鏡 下 可 見 的 分 子 ： 熒 光 素 膠 體 金 酶 -過 氧 化 物 酶 -H 2O2和 DAB 堿 性 磷 酸 酶 -NBT/BCIP 用 地 高 辛 標(biāo) 記 的 探 針 用 熒 光 素 、 膠 體 金 、 酶 標(biāo) 記 抗 地 高 辛 抗 體 來 顯示 依 據(jù) 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 原理 用 直 接 法 或 間 接 法來 顯 示 探 針 標(biāo) 記 物 四 、 原 位 雜 交 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 細(xì) 胞 特 異 mRNA轉(zhuǎn) 錄 的 定 位 ， 用 于 基 因 圖 譜 、 基 因表 達(dá) 和 基 因 組 進(jìn) 化 的 研 究 。 感 染 組 織 中 病 毒 DNA/RNA的 檢 測(cè) 和 定 位 。 癌 基 因 、 抑 癌 基 因 和 各 種 功 能 基 因 在 轉(zhuǎn) 錄 水 平 的表 達(dá) 和 變 化 的 檢 測(cè) 。 基 因 在 染 色 體 上 的 定 位 和 檢 測(cè) 染 色 體 的 變 化 間 期 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 的 研 究 疾 病 的 基 因 變 化 的 研 究