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1、熒 光 原 位 雜 交 技 術(shù) 簡(jiǎn) 介n 原 位 雜 交 技 術(shù) （ in situ hybridization， ISH） Gall和Pardue 1969年 建 立 。 用 標(biāo) 記 的 DNA或 RNA作 為 探 針 ， 對(duì) 組 織 細(xì) 胞 內(nèi) 的 核 酸 或 有絲 分 裂 中 期 的 染 色 體 進(jìn) 行 原 位 檢 測(cè) 和 觀 察 。n 最 初 的 探 針 大 多 以 同 位 素 3H、 32P等 標(biāo) 記 ， 但 因 同 位 素 標(biāo)記 探 針 對(duì) 人 體 有 放 射 損 害 、 實(shí) 驗(yàn) 周 期 長(zhǎng) 、 放 射 自 顯 影 的 分辨 率 有 限 、 環(huán) 境 污 染 等 缺 點(diǎn) ， 給 研

2、究 及 實(shí) 際 應(yīng) 用 帶 來(lái) 了 諸多 不 便 。 n 熒 光 原 位 雜 交 技 術(shù) （ Fluorescence in situ hybridization ， FISH） 利 用 熒 光 物 質(zhì) 標(biāo) 記 探 針 （ 直 接 或 間 接 ） ， 再 進(jìn) 行 雜 交 ， 可通 過(guò) 熒 光 顯 微 鏡 對(duì) 靶 序 列 進(jìn) 行 定 性 、 定 位 和 定 量 分 析n FISH技 術(shù) 的 應(yīng) 用 已 經(jīng) 證 實(shí) 或 發(fā) 現(xiàn) 了 用 經(jīng) 典 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 方法 無(wú) 法 證 實(shí) 或 發(fā) 現(xiàn) 的 腫 瘤 染 色 體 改 變 ， 成 為 銜 接 細(xì) 胞 遺 傳學(xué) 和 分 子 遺 傳 學(xué) 之 間

3、的 一 座 橋 梁 。 開(kāi) 創(chuàng) 了 一 個(gè) 新 的 學(xué) 科 分 子 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 。 雜 交 流 程a.兩 要 素 ： 探 針 和 靶 序 列b.標(biāo) 記 探 針 直 接 標(biāo) 記 和 間 接 標(biāo) 記c.變 性 探 針 和 靶 序 列 成 為 單 鏈d.混 合 雜 交e.間 接 標(biāo) 記 的 探 針 需 連 接熒 光 基 團(tuán) 的 步 驟 熒 光 標(biāo) 記 的 DNA探 針 （ 200-500bp）F I S H 熒 光 原 位 雜 交 特 點(diǎn)n 與 其 它 原 位 雜 交 技 術(shù) 相 比 ， FISH的 優(yōu) 點(diǎn) ： 經(jīng) 濟(jì) 安 全 ， 快 速 方 便 ； 敏 感 性 高 ， 特 異 性 強(qiáng) ，

4、背 景 低 ； 宜 于 多 靶 雜 交 ， 對(duì) 同 一 標(biāo) 本 同 時(shí) 進(jìn) 行 多 個(gè) 探 針雜 交 ， 不 同 的 探 針 可 以 顯 示 不 同 的 熒 光 顏 色 ； 使 用 G帶 玻 片 可 作 出 回 顧 性 分 析 ；n 缺 點(diǎn) ： 不 能 達(dá) 到 100%雜 交 ， 特 別 是 在 應(yīng) 用 較 短 的cDNA探 針 時(shí) 效 率 明 顯 下 降 。 n 基 因 特 異 探 針 靶 向 每 條 染 色 體 只 有 一 個(gè) 拷貝 的 DNA序 列 。n 主 要 用 于 間 期 或 中 期 染 色 體 中 識(shí) 別 染 色 體易 位 、 倒 位 、 重 復(fù) 和 缺 失 、 鄰 近 基 因

5、綜 合征 、 標(biāo) 記 染 色 體 和 染 色 體 擴(kuò) 增 等 ， 可 檢 測(cè)基 因 的 擴(kuò) 增 和 重 排 。常 用 探 針 類(lèi) 型 基 因 特 異 探 針 常 用 探 針 類(lèi) 型 重 復(fù) 序 列 探 針n 重 復(fù) 序 列 探 針 的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 是 基 因 組 中 多 拷貝 的 短 重 復(fù) 堿 基 對(duì) 序 列 （ 例 如 著 絲 粒 和 端粒 探 針 ） 所 在 的 染 色 體 區(qū) 域 。n 著 絲 粒 常 常 是 A-T豐 富 區(qū) ， 而 端 粒 已 知 含 有TTAGGG序 列 。 由 于 重 復(fù) 序 列 相 對(duì) 容 易 制 備和 分 辨 率 較 高 （ 0.5Mb） ， 這 種 F

6、ISH被 普 遍用 于 篩 查 一 般 的 染 色 體 非 整 倍 體 、 亞 端 粒缺 失 和 標(biāo) 記 染 色 體 。 n 21三 體 FISH 常 用 探 針 類(lèi) 型 WCP探 針n 全 基 因 組 繪 畫(huà) （ WCP） 探 針 是 一 種 復(fù) 合 DNA探 針 。除 著 絲 粒 和 端 粒 區(qū) 外 ， 全 基 因 組 繪 畫(huà) 探 針 對(duì) 全 長(zhǎng)染 色 體 有 高 度 親 和 力 。 這 些 探 針 最 適 用 于 識(shí) 別 中期 染 色 體 的 基 因 組 不 平 衡 ， 尤 其 是 在 許 多 癌 癥 中觀 察 到 的 復(fù) 雜 染 色 體 重 排 。n M-FISH用 特 殊 選 擇 的

7、 窄 帶 濾 色 片 連 續(xù) 捕 獲 5種 熒 光色 素 中 的 每 一 種 熒 光 色 素 圖 像 ； SKY用 于 熒 光 色 素組 合 分 析 的 成 像 設(shè) 備 不 同 ： 冷 電 荷 耦 合 器 (CCD)照相 機(jī) 和 Fourier變 換 光 譜 法 相 結(jié) 合 ， 同 步 曝 光 成 像 。n 這 些 技 術(shù) 目 前 在 國(guó) 內(nèi) 一 些 重 點(diǎn) 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 室中 開(kāi) 展 。 WCP探 針 （ SKY） 技 術(shù) 結(jié) 合 產(chǎn) 前 BoBSn BACs是 人 類(lèi) DNA的 長(zhǎng) 片 段 克 隆 序 列 ， 典 型 的 150-170kbp， 相 對(duì) 于 短 的 DNA探

8、針 具 有 更 好 的 信 噪 比 、 不受 DNA質(zhì) 量 影 響 、 更 高 的 覆 蓋 率 。n 將 BAC DNA探 針 耦 聯(lián) 至 Luminex xMAP熒 光 編 碼 的 微 球上 ， 將 FISH技 術(shù) 與 Luminex技 術(shù) 平 臺(tái) 結(jié) 合 ， BACs-on-Beads技 術(shù) 可 以 在 同 一 個(gè) 微 孔 內(nèi) 實(shí) 現(xiàn) 多 個(gè) FISH探 針 的檢 測(cè) ， 相 對(duì) 于 同 時(shí) 進(jìn) 行 成 百 上 千 次 FISH實(shí) 驗(yàn) 。n 高 通 量 、 標(biāo) 本 來(lái) 源 廣 、 快 速 、 結(jié) 果 明 確 ； 除 了 檢 測(cè)13， 18， 21， X， Y染 色 體 拷 貝 數(shù) 目 的

9、變 化 外 ， 還 可檢 測(cè) 9種 常 見(jiàn) 的 微 缺 失 綜 合 征 。 技 術(shù) 結(jié) 合 FQ-PCRn 來(lái) 自 于 分 子 生 物 學(xué) 技 術(shù) -定 量 熒 光 聚 合 酶 鏈反 應(yīng) 和 FISH的 結(jié) 合 ；n 對(duì) 染 色 體 13、 18、 21、 X和 Y采 用 熒 光 引 物對(duì) 染 色 體 特 異 性 高 度 多 態(tài) 性 DNA短 重 復(fù) 序列 進(jìn) 行 PCR擴(kuò) 增 ， 快 速 診 斷 非 整 倍 體 ； 特定 的 基 因 引 物 可 以 檢 測(cè) 基 因 的 缺 失 與 擴(kuò) 增n 檢 測(cè) “ 有 ” 或 “ 無(wú) ” 和 數(shù) 目 異 常 ； 位 置 異常 無(wú) 法 判 斷 ， 如 平

10、衡 性 染 色 體 重 排 。 技 術(shù) 13, 18, 21三 體 微 缺 失 解 釋 容 易 成 本 平 臺(tái) 費(fèi) 用產(chǎn) 前 BoBs + + + + +核 型 分 析 + - - - +FISH + + - - +QF-PCR + - + + - 幾 種 技 術(shù) 平 臺(tái) 比 較 細(xì) 胞 遺 傳 學(xué) 技 術(shù) 的 比 較 FISH相 關(guān) 項(xiàng) 目n 羊 水 細(xì) 胞 熒 光 原 位 雜 交 分 析 （ 包 括 未 培 養(yǎng)和 培 養(yǎng) ）n 血 細(xì) 胞 熒 光 原 位 雜 交 分 析n 其 他 各 類(lèi) 細(xì) 胞 熒 光 原 位 雜 交 分 析n SRY等 單 基 因 分 析n 胚 胎 染 色 體 病 診

11、斷 （ PGD） 結(jié) 合 技 術(shù) 相 關(guān) 檢 測(cè) 項(xiàng) 目n 染 色 體 病 快 速 產(chǎn) 前 診 斷 （ FISH、 qPCR、BoBs）n 產(chǎn) 前 單 基 因 病 診 斷n SNP Array 檢 測(cè)n 某 些 代 謝 病 的 產(chǎn) 前 診 斷 項(xiàng) 目 意 義n 1.快 速 且 準(zhǔn) 確 進(jìn) 行 檢 測(cè) 較 羊 水 染 色 體 分 析 ， FISH技 術(shù) 可 以 確 定 13、 18、 21、 X、 Y的 染 色 體 數(shù)目 信 息 ， 緩 解 唐 篩 陽(yáng) 性 患 者 或 高 齡 孕 婦 精 神 負(fù) 擔(dān) ； 緩 解 醫(yī) 生 核 型 分 析工 作 壓 力 ， 能 夠 有 針 對(duì) 性 的 對(duì) 樣 本 進(jìn)

12、 行 處 理 。n 2.彌 補(bǔ) 核 型 檢 測(cè) 失 敗 無(wú) 報(bào) 告 的 問(wèn) 題 FISH對(duì) 于 樣 本 要 求 比 較 低 ， 對(duì) 于 羊 水 量 少 、 羊 水 活 細(xì) 胞 數(shù) 目 少 、 孕 周偏 大 、 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 失 敗 、 核 型 結(jié) 果 難 以 判 讀 等 各 種 原 因 導(dǎo) 致 的 核 型 分 析失 敗 均 可 針 對(duì) 性 的 給 予 彌 補(bǔ) ， 解 決 占 染 色 體 數(shù) 目 異 常 的 80-90%問(wèn) 題 。n 3.FISH與 羊 水 染 色 體 核 型 分 析 構(gòu) 成 較 為 完 整 的 染 色 體 異 常診 斷 平 臺(tái) ， 提 高 了 產(chǎn) 科 胎 兒 產(chǎn) 前 診 斷

13、水 平 。n 4.BoBs可 檢 測(cè) 9種 常 見(jiàn) 的 微 缺 失 綜 合 征 ， 拓 寬 了 檢 測(cè) 范 圍 。 工 作 基 礎(chǔ)n 探 針 商 品 化 探 針n 原 位 雜 交 儀n Luminex xMAP液 相 芯 片 檢 測(cè) 平 臺(tái) 工 作 基 礎(chǔ)n工 作 人 員 1） 項(xiàng) 目 負(fù) 責(zé) 人 劉 紅 衛(wèi) ， 男 ， 婦 產(chǎn) 科 實(shí) 驗(yàn) 室 技 術(shù) 負(fù) 責(zé) 人 ， 畢業(yè) 于 四 川 大 學(xué) 生 物 工 程 系 遺 傳 學(xué) 專 業(yè) ， 臨 床 遺 傳優(yōu) 生 專 業(yè) 副 主 任 醫(yī) 師 ， 豐 富 的 技 術(shù) 操 作 和 管 理 能力 。 2） 項(xiàng) 目 組 成 員 趙 少 志 ， 男 ， 檢 驗(yàn) 師 ， 四 川 大 學(xué) 華 西 醫(yī) 院 醫(yī)學(xué) 遺 傳 學(xué) 碩 士 ， 中 國(guó) 遺 傳 醫(yī) 學(xué) 中 心 、 醫(yī) 學(xué) 遺 傳 學(xué)國(guó) 家 培 訓(xùn) 中 心 學(xué) 員 。