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1、 第一章第一章緒緒論論n教學重點教學重點:酶工程的概念、固定化酶活性測定、酶工程的概念、固定化酶活性測定、酶的生產方法。酶的生產方法。n講授要點：講授要點：1、酶工程概念、酶工程概念2、酶工程發(fā)展概況、酶工程發(fā)展概況3、酶的基本知識（復習）、酶的基本知識（復習）4、酶的生產方法、酶的生產方法一、一、酶工程酶工程(enzymeengineering)概念概念n酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶是具有生物催化功能的生物大分子。n酶酶工工程程又又稱稱酶酶技技術術，是是圍圍繞繞著著酶酶所所特特有有的的生生物物催催化化性性能能使使其其在在工工農農業(yè)業(yè)、醫(yī)醫(yī)學學和和其其他他方方面面發(fā)發(fā)揮揮作作用用的的應

2、應用用技技術術，是是酶酶學學基基本本原原理理與與化化學學工工程程技技術術、基基因因重重組組技技術術及及微微生生物物學學技技術術有有機機結結合合的產物的產物。第一節(jié)第一節(jié)酶工程概念、研究內容和主要任務酶工程概念、研究內容和主要任務二、二、酶工程的主要內容包括：酶工程的主要內容包括：1、酶的生產和分離純化；、酶的生產和分離純化；2、酶分子改造與化學修飾、遺傳修飾、酶分子改造與化學修飾、遺傳修飾；3、酶、細胞和原生質體固定化；、酶、細胞和原生質體固定化；4、酶反應器；、酶反應器；5、酶的非水相催化；、酶的非水相催化；6、核酸酶、抗體酶的研究、核酸酶、抗體酶的研究7、模模擬擬酶酶、合合成成酶酶以以及及

3、酶酶分分子子的的人人工工設設計計、合合成成的研究的研究8、酶的應用。、酶的應用。三、酶工程的主要任務三、酶工程的主要任務通通過過預預先先設設計計，經經過過人人工工操操作作控控制制而而大大量量所所需需的的酶酶，并并通通過過各各種種方方法法使使酶酶發(fā)發(fā)揮揮其其最最大大的的催化功能。催化功能。對酶及生物催化劑的認識的發(fā)展對酶及生物催化劑的認識的發(fā)展生物催化劑生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質類：蛋白質類：天然酶（天然酶（Enzyme）極端酶（極端酶（extremozyme）抗體酶抗體酶（abzyme）生物工程生物工程酶酶核酸類：核酸類：Ribozyme模擬生物催化劑模擬生物催化劑 克隆酶克隆

4、酶 遺傳修飾酶遺傳修飾酶 蛋白質工程新酶蛋白質工程新酶采用生物體生產酶劑是從采用生物體生產酶劑是從19世紀末開始的。世紀末開始的。1894年年，日日本本的的高高峰峰讓讓吉吉首首先先從從米米曲曲霉霉中中制制備備得得到到高高峰峰淀淀粉粉酶酶，用用作作消消化化劑劑，開開創(chuàng)創(chuàng)了了近近代代酶的生產和應用的先例。酶的生產和應用的先例。1908年年，德德國國的的羅羅姆姆（Rohm)從從動動物物胰胰臟臟中中制得制得胰酶胰酶，用于皮革的軟化；，用于皮革的軟化；第二節(jié)第二節(jié)酶工程發(fā)展概況酶工程發(fā)展概況1908年，法國的波伊登制備得到年，法國的波伊登制備得到細菌淀粉酶細菌淀粉酶，應用于紡織品的退漿；應用于紡織品的退

5、漿；1911年美國的華勒斯坦制成年美國的華勒斯坦制成木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶，用于，用于除去啤酒中的蛋白質渾濁。此后，酶的生產和除去啤酒中的蛋白質渾濁。此后，酶的生產和應用逐步發(fā)展。應用逐步發(fā)展。1949年年，用用液液體體深深層層培培養(yǎng)養(yǎng)法法進進行行細細菌菌-淀淀粉粉酶酶的的發(fā)發(fā)酵酵生生產產，揭揭開開了了近近代代酶酶工工業(yè)業(yè)的的序序幕幕。50年年代代以以后后，隨隨著著生生化化工工程程的的發(fā)發(fā)展展，大大多多數數酶酶制制劑劑的的生生產已轉向微生物液體深層發(fā)酵的方法。產已轉向微生物液體深層發(fā)酵的方法。1960年年，法法國國的的雅雅各各和和莫莫諾諾德德提提出出操操縱縱子子學學說說，闡闡明明了了酶酶生生物物

6、全全面面的的調調節(jié)節(jié)機機制制。使使酶酶的的生生物物合合成成可可以以按按照照人人們們的的意意愿愿加加以以調調節(jié)節(jié)控控制制。通通過過酶酶的誘導和解除阻遏，可以顯著地提高酶的產量。的誘導和解除阻遏，可以顯著地提高酶的產量。20世世紀紀80年年代代迅迅速速發(fā)發(fā)展展起起來來的的動動、植植物物細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)技技術術。植植物物細細胞胞、動動物物細細胞胞都都可可以以如如同同微微生生物物細細胞胞一一樣樣，在在人人工工控控制制條條件件的的生生物物反反應應器器中中進進行行培培養(yǎng)養(yǎng)，通通過過細細胞胞的的生生命命活活動動，得得到到人人們們所所需需的的各各種種產產物物，其中包括各種酶。其中包括各種酶。例例如如，通通過過

7、植植物物細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)可可以以獲獲得得超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶、木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶、過過氧氧化化物物酶酶、糖糖苷苷酶酶、糖糖化化酶酶等等。通通過過動動物物細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)可可以以獲獲得得血血纖纖維維蛋白酶原活化劑、膠原酶等。蛋白酶原活化劑、膠原酶等。1953年年，德德國國的的格格魯魯布布霍霍費費和和施施來來斯斯首首先先將將聚聚氨氨基基苯苯乙乙烯烯樹樹脂脂重重氮氮化化，然然后后將將淀淀粉粉酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶、羧羧肽肽酶酶和和核核糖糖核核酸酸酶酶等等與與上上述述載載體體結結合合，制制成成固定化酶。固定化酶。1969年年，日日本本的的千千煙煙一一郎郎首首次次

8、在在工工業(yè)業(yè)上上應應用用固固定化氨基?；付ɑ被；笍膹腄L-氨基酸生產氨基酸生產L-氨基酸。氨基酸。學學者者們們開開始始用用“酶酶工工程程”這這個個新新名名詞詞來來代代表表有有效效地地利利用用酶酶的的科科學學技技術術領領域域。1971年年第第一一次次國國際際酶酶工工程程學學術術會會議議在在美美國國召召開開，當當時時壓壓倒倒的的主主題題是是固定化酶。固定化酶。此此后后，為為了了省省去去酶酶的的分分離離純純化化過過程程，出出現現了了固固定化菌體定化菌體（固定化死細胞）技術。（固定化死細胞）技術。1973年年日日本本在在工工業(yè)業(yè)上上成成功功地地利利用用固固定定化化大大腸腸桿桿菌菌菌菌體體中中的

9、的天天門門冬冬氨氨酸酸酶酶，由由反反丁丁烯烯二二酸酸連連續(xù)續(xù)生生產產L-天門冬氨酸。天門冬氨酸?，F現在在已已經經有有多多種種固固定定化化酶酶用用于于大大規(guī)規(guī)模模工工業(yè)業(yè)化化生生產產。例例如如，利利用用固固定定化化葡葡萄萄糖糖異異構構酶酶由由葡葡萄萄糖糖生生產產果果葡葡糖糖漿漿；利利用用固固定定化化青青霉霉素素酰酰化化酶酶生生產產半半合合成成青青霉霉素素或或頭頭孢孢霉霉素素；利利用用固固定定化化-半半乳乳糖糖苷苷酶酶生產低乳糖奶等。生產低乳糖奶等。在在此此基基礎礎上上，70年年代代后后期期，出出現現了了固固定定化化細細胞胞（又又稱稱固固定定化化活活細細胞胞或或固固定定化化增增殖殖細細胞胞）技技術

10、術。固固定定化化細細胞胞是是指指固固定定在在載載體體上上，在在一一定定的的空空間間范范圍圍內內進進行行生生命命活活動動（包包括括生生長長、增增殖殖、新新陳陳代代謝謝）的的細細胞胞，可可以以反反復復或或連連續(xù)續(xù)使使用用在在發(fā)發(fā)酵生產上。酵生產上。1978年年，日日本本的的鈴鈴木木等等人人用用固固定定化化細細胞胞生生產產淀淀粉粉酶酶研研究究成成功功。此此后后用用固固定定化化細細胞胞生生產產蛋蛋白白酶酶、糖糖化化酶酶、溶溶菌菌酶酶、天天冬冬酰酰胺胺酶酶、果果膠膠酶酶等等的的研研究究蓬蓬勃勃展展開開。然然而而，固固定定化化細細胞胞只只能能用用于于生生產產胞胞外外酶酶等等容容易易分分泌泌到到細細胞胞外外

11、的的產產物物。對對于于胞胞內內酶酶及及其其他他胞胞內內產產物物的的生生產產必必須須采采用用8080年年代代中中期期才才發(fā)發(fā)展展起起來來的的固定化原生質體技術。固定化原生質體技術。19861986年年開開始始，華華南南理理工工大大學學生生物物工工程程研研究究所所用用固固定定化化原原生生質質體體發(fā)發(fā)酵酵生生產產堿堿性性磷磷酸酸酶酶、葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、谷谷氨氨酸酸脫脫氫氫酶酶等等的的研研究究相相繼繼取取得得成成功功，為為胞胞內內酶的連續(xù)生產開辟了嶄新的途徑。酶的連續(xù)生產開辟了嶄新的途徑。20世世紀紀80年年代代以以來來，酶酶分分子子修修飾飾技技術術發(fā)發(fā)展展很很快快，修修飾飾的的方方法法主主要

12、要有有：酶酶分分子子主主鏈鏈修修飾飾，酶酶分分子子側側鏈鏈基基團團修修飾飾，酶酶分分子子組組成成單單位位置置換換修修飾飾，酶酶分分子子中中金金屬屬離離子子置置換換修修飾飾和和物物理理修修飾飾等等。通通過過酶酶分分子子修修飾飾，可可以以提提高高酶酶活活力力，增增加加酶酶的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性，消消除除或或降降低低酶酶的抗原性等，的抗原性等，尤尤其其是是20世世紀紀80年年代代中中期期發(fā)發(fā)展展起起來來的的蛋蛋白白質質工工程程，已已把把酶酶分分子子修修飾飾與與基基因因工工程程技技術術結結合合在在一一起起。通通過過基基因因定定位位突突變變技技術術，可可把把酶酶分分子子修修飾飾后后的的信信息息儲儲存存于于DN

13、A之之中中，經經過過基基因因克克隆隆和和表表達達，就就可可以以通通過過生生物合成的方法獲得具有新的特性和功能的酶。物合成的方法獲得具有新的特性和功能的酶。1984年年，克克利利巴巴諾諾夫夫（Klibanov)等等人人進進行行了了有有機機介介質質中中酶酶的的催催化化作作用用的的研研究究，發(fā)發(fā)現現脂脂肪肪酶酶在在有有機機介介質質中中不不但但具具有有催催化化活活性性，而而且且還還具具有有很很高高的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性。改變了酶只能在水溶液中進行催化的傳統(tǒng)概念。改變了酶只能在水溶液中進行催化的傳統(tǒng)概念。與與水水溶溶液液中中酶酶的的催催化化相相比比，酶酶在在有有機機介介質質中中的的催催化化具具有有提提高高非非

14、極極性性底底物物或或產產物物的的溶溶解解度度、進進行行在在水水溶溶液液中中無無法法進進行行的的合合成成反反應應、減減少少產產物物對對酶酶的的反反饋饋抑抑制制作作用用、提提高高手手性性化化合合物物不不對對稱稱反反應應的的對對映映體體選選擇擇性性等等顯著特點。顯著特點。近近2020多多年年來來，在在酶酶和和細細胞胞固固定定化化技技術術發(fā)發(fā)展展的的同同時時，其其他他的的酶酶分分子子修修飾飾技技術術也也不不斷斷發(fā)發(fā)展展。此此外外，核核酶酶、抗抗體體酶酶、酶酶的的化化學學合合成成、人人工工模模擬擬，以以及及各各種種酶酶的的應應用用技技術術的的研研究究，使使酶酶工工程程已已經經成成為為生生物物工工程程的的

15、主主要要內內容容。今今后后將將不不斷斷地地向向廣廣度度和和深深度度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。一、酶作用的特點一、酶作用的特點 極高的催化效率極高的催化效率 高度的專一性高度的專一性 酶酶催化作用的條件溫和催化作用的條件溫和 酶酶活性可調控活性可調控 有的酶需輔助因子有的酶需輔助因子第三節(jié)第三節(jié)酶的基本知識酶的基本知識（一）、酶的專一性（一）、酶的專一性酶酶催催化化作作用用的的專專一一性性是是酶酶是是最最重重要要的的特特性性之之一一，是酶與其他非酶催化劑的最主要的不同之處。是酶與其他非酶催化劑的最主要的不同之處。酶酶的的專專一一性性是是指指一一種種酶酶只只能能催

16、催化化一一種種或或一一類類結結構構相似的底物進行某種類型的反應。相似的底物進行某種類型的反應。酶酶的的專專一一性性可可以以按按其其嚴嚴格格程程度度的的不不同同，分分為為下下列列兩大類兩大類：1、結構專一性、結構專一性 概概念念：酶酶對對所所催催化化的的分分子子（底底物物，Substrate）化化學結構的特殊要求和選擇學結構的特殊要求和選擇類別類別：絕對專一性絕對專一性和和相對專一性相對專一性2、立體異構專一性、立體異構專一性概概念念：酶酶除除了了對對底底物物分分子子的的化化學學結結構構有有要要求求外外，對其立體異構也有一定的要求對其立體異構也有一定的要求類別類別：旋光異構專一性旋光異構專一性和

17、和幾何異構專一性幾何異構專一性絕對專一性和相對專一性絕對專一性和相對專一性 絕對專一性絕對專一性 有的酶對底物的化學結構要求非常有的酶對底物的化學結構要求非常嚴格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質。嚴格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質。相對專一性相對專一性有的酶對底物的化學結構要求比有的酶對底物的化學結構要求比上述絕對專一性略低一些，它們能作用于一類化合上述絕對專一性略低一些，它們能作用于一類化合物或一種化學鍵。物或一種化學鍵。1）鍵專一性鍵專一性有的酶只作用于一定的鍵，而對有的酶只作用于一定的鍵，而對鍵鍵兩端的基團并無嚴格要求。兩端的基團并無嚴格要求。2）基團專一性基團專一性另

18、一些酶，除要求作用于一定另一些酶，除要求作用于一定的鍵以外，對鍵兩端的基團還有一定要求，往往的鍵以外，對鍵兩端的基團還有一定要求，往往是對其中一個基團要求嚴格，對另一個基團則要是對其中一個基團要求嚴格，對另一個基團則要求不嚴格。求不嚴格。鎖鎖鑰鑰學學說說：將將酶酶的的活活性性中中心心比比喻喻作作鎖鎖孔孔，底底物物分分子子象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。誘誘導導契契合合學學說說：酶酶的的活活性性中中心心在在結結構構上上具具柔柔性性，底底物物接接近近活活性性中中心心時時，可可誘誘導導酶酶蛋蛋白白構構象象發(fā)發(fā)生生變變化化，這這樣樣就就使使使使酶酶活

19、活性性中中心心有有關關基基團團正正確確排排列列和和定定向向，使使之之與底物成互補形狀有機的結合而催化反應進行。與底物成互補形狀有機的結合而催化反應進行。3、有關酶專一性的學說、有關酶專一性的學說酶專一性的酶專一性的“鎖鑰學說鎖鑰學說”酶專一性的酶專一性的“誘導契合學說誘導契合學說”4、酶的專一性的確定酶的專一性的確定確定某種酶的專一性有好幾個步驟。確定某種酶的專一性有好幾個步驟。（1）首首先先要要選選擇擇一一種種酶酶可可催催化化的的物物質質作作為為該該酶酶的的作作用用底底物物，通通過過試試驗驗確確定定其其最最適適的的pH值值、溫溫度度等等反反應應條件；條件；（2）其其次次是是試試驗驗底底物物濃

20、濃度度對對反反應應速速度度的的影影響響，確確定定其米氏常數其米氏常數Km和最大反應速度；和最大反應速度；（3）然然后后用用其其他他有有可可能能是是該該酶酶作作用用底底物物的的物物質質，在在相相同同的的條條件件下下逐逐個個進進行行試試驗驗，有有時時要要在在不不同同的的條條件件下下逐逐個個試試驗驗，觀觀察察是是否否有有催催化化反反應應發(fā)發(fā)生生，從從而而確確定定該該酶是屬于絕對專一性還是相對專一性。酶是屬于絕對專一性還是相對專一性。（4）對對于于相相對對專專一一性性的的酶酶，可可作作用用于于一一類類物物質質?？煽梢砸赃x選擇擇幾幾種種有有代代表表性性的的底底物物，求求出出各各自自的的Km值值。在在某某

21、些些情情況況下下，不不同同的的底底物物有有不不同同的的最最適適pH值值，而而pH值值對對Km有有一一定定的的影影響響。此此時時必必須須作作出出不不同同底底物物各各自自的的pH曲曲線線。然然后后再再在在各各自自的的最最適適pH值值條條件件下下進行試驗，以確定各底物相應的進行試驗，以確定各底物相應的Km值。值。（5）在在進進行行酶酶的的專專一一性性試試驗驗時時，所所使使用用的的酶酶和和各各種種底底物物都都要要盡盡可可能能地地純純。對對于于有有不不對對稱稱碳碳原原子子的的物物質，應分別對不同的光學異構體進行試驗。質，應分別對不同的光學異構體進行試驗。（二）酶具有很高的二）酶具有很高的催化效率催化效率

22、 酶的催化效率可比一般催化劑高酶的催化效率可比一般催化劑高10106 610102020倍。倍。如：如：H H2 2O O2 2 H H2 2O+OO+O2 2 H H2 2O O2 2酶為酶為 5 510106 6 mol mol ；Fe Fe2+2+為為6 61010-4-4 molmol（三）反應條件溫和，酶易三）反應條件溫和，酶易變性失活變性失活（四）體內酶活性是受（四）體內酶活性是受調控調控的的（五）酶的催化活性與輔基、輔酶和金屬離子（五）酶的催化活性與輔基、輔酶和金屬離子有關有關E+SP+EES能能量量水水平平反應過程反應過程 G E1 E2酶（酶（E）與底物（與底物（S）結合生成

23、不穩(wěn)定的中間結合生成不穩(wěn)定的中間物（物（ES），），再分解成產再分解成產物（物（P）并釋放出酶，使并釋放出酶，使反應沿一個低活化能的反應沿一個低活化能的途徑進行，降低反應所途徑進行，降低反應所需活化能，所以能加快需活化能，所以能加快反應速度。反應速度。酶催化的中間產物理論酶催化的中間產物理論 二、酶催化機理二、酶催化機理1、鄰近效應和定向效應、鄰近效應和定向效應 鄰鄰近近效效應應(proximity effect)是是指指在在酶酶促促反反應應中中，底底物物分分子子結結合合到到酶酶的的活活性性中中心心，底底物物在在酶酶活活性性中中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應速度；心的有效濃度大大增加，有

24、利于提高反應速度；定定向向效效應應(orientation effect)是是指指酶酶的的活活性性中中心心的的立立體體結結構構和和相相關關基基團團的的誘誘導導和和定定向向作作用用，使使底底物物分分子子中中參參與與反反應應的的基基團團相相互互接接近近，并并被被嚴嚴格格定向定位，使酶促反應具有高效率和專一性特點。定向定位，使酶促反應具有高效率和專一性特點。（二）（二）底物形變底物形變（張力學說）（張力學說）酶酶與與底底物物結結合合，不不僅僅使使酶酶分分子子構構象象發(fā)發(fā)生生變變化化，同同時時也也使使底底物物分分子子發(fā)發(fā)生生扭扭曲曲變變形形，稱稱為為應應變變或或形形變變效效應應（strain effe

25、ct)。這這是是由由于于酶酶與與底底物物結結合合之之后后,一一部部分分結結合合能能被被用用來來削削弱弱底底物物分分子子中中的的敏敏感感鍵鍵,產產生生鍵鍵扭扭變變,有有助助于于過過渡渡態(tài)態(tài)的的形形成成,降降低低了了底底物物反應的活化能反應的活化能,從而使反應速度大大加快。從而使反應速度大大加快。（三）、共價催化（三）、共價催化 某某些些酶酶分分子子的的催催化化基基團團可可以以通通過過共共價價鍵鍵與與底底物物分分子子結結合合形形成成不不穩(wěn)穩(wěn)定定的的共共價價中中間間產產物物，這這個個中中間間產產物物極極易易變變成成過過渡渡態(tài)態(tài)，因因而而大大大大降降低低了了活活化化能能，使使反反應應速速度度大大為為提

26、提高高。這這種種催催化化稱稱為為共共價價催催化化（covalent catalysis)。1、親親核核催催化化（nucleophilic catalysis)是是指指酶酶活活性性中中心心的的親親核核催催化化基基團團提提供供一一對對電電子子，與與底底物物分分子子中中的的缺缺少少電電子子具具有有部部分分正正電電荷荷的的碳碳原原子子形形成成共共價價鍵鍵，從從而而產產生生不不穩(wěn)穩(wěn)定的共價中間物。定的共價中間物。酶分子中可作為親核基團酶分子中可作為親核基團2、親親電電子子催催化化 是是指指酶酶活活性性中中心心上上的的親親電電子子催催化化基基團團從從底底物物分分子子的的親親核核原原子子上上爭爭奪奪一一對對

27、電電子子，形形成成共共價價鍵鍵，從從而而產產生生不不穩(wěn)穩(wěn)定定的的共共價價中間物。中間物。（四）、酸堿催化（四）、酸堿催化 在在酶酶活活性性中中心心上上，有有些些催催化化基基團團是是酸酸催催化化基基團團向向底底物物分分子子提提供供質質子子；有有些些催催化化基基團團是是堿堿催催化化基基團團從從底底物物分分子子接接受受質質子子。當當酸酸催催化化基基團團和和堿堿催催化化基基團團共共同同發(fā)發(fā)揮揮作作用用時時，可可以以大大大大提提高高底底物物反反應應速速度度，這這種種催催化化就就稱稱為為酸酸堿堿催催化化。His咪咪唑唑基基就是許多酶的酸堿催化基團。就是許多酶的酸堿催化基團。酶分子中可作為酸鹼催化的功能基團

28、酶分子中可作為酸鹼催化的功能基團（五）活性部位疏水空穴的影響（五）活性部位疏水空穴的影響 已已知知某某些些化化學學反反應應，在在非非極極性性（低低介介電電常常數數）的的介介質質中中，其其反反應應速速度度比比在在極極性性（高高介介電電常常數數）介介質質中中快快得得多多。酶酶分分子子的的活活性性中中心心是是位位于于非非極極性性的的空空穴穴中中的的，因因此此，非非極極性性的空穴有利于提高酶促底物反應速度。的空穴有利于提高酶促底物反應速度。與酶的高效率有關的主要因素與酶的高效率有關的主要因素“鄰近鄰近”和定向效應和定向效應張力學說張力學說共價催化共價催化酸堿催化酸堿催化微環(huán)境影響微環(huán)境影響三、影響酶催

29、化作用的因素三、影響酶催化作用的因素（一）底物濃度與酶反應速度的關系（一）底物濃度與酶反應速度的關系nMichaelisMichaelis&MentenMenten 于于19131913年年推推導導出出了了上上述述矩矩形形雙雙曲曲線線的的數數學學表表達達式式，即著名的即著名的米氏方程米氏方程。Vmax 米氏常數的意義米氏常數的意義 （1 1）當當=V=Vmaxmax/2/2時，時，K Km m=S=S。因此，因此，K Km m等于酶等于酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。促反應速度達最大值一半時的底物濃度。（2 2）K Km m可以反映酶與底物親和力的大小可以反映酶與底物親和力的大小K Km

30、 m越小，酶與底物的親和力越大。越小，酶與底物的親和力越大。（3 3）可可用用于于判判斷斷反反應應級級數數：當當 S0.01KS100KS100Km m時時，=V Vmaxmax，反反應為零級反應應為零級反應.（4 4）.K Km m是是酶酶的的特特征征性性常常數數：在在一一定定條條件件下下，某某種種酶酶的的K Km m值值是是恒恒定定的的，因因而而可可以以通通過過測測定定不不同同酶酶（特特別別是是一一組組同同工工酶酶）的的K Km m值值，來來判判斷斷是是否否為不同的酶。為不同的酶。（5 5）.K Km m可可用用來來判判斷斷酶酶的的最最適適底底物物：當當酶酶有有幾幾種種不不同同的的底底物物

31、存存在在時時，通通過過測測定定酶酶在在不不同同底底物物存存在在時時的的K Km m值值，K Km m值值最最小小者者，即即為為該該酶酶的的最最適適底底物。物。（二）、抑制劑對反應速度的影響（二）、抑制劑對反應速度的影響n 凡凡是是能能降降低低酶酶促促反反應應速速度度，但但不不引引起起酶酶分分子子變變 性性 失失 活活 的的 物物 質質 統(tǒng)統(tǒng) 稱稱 為為 酶酶 的的 抑抑 制制 劑劑(inhibitor)inhibitor)。n 按按照照抑抑制制劑劑的的抑抑制制作作用用，可可將將其其分分為為不不可可逆逆抑抑制制作作用用(irreversible irreversible inhibition)i

32、nhibition)和和可可逆逆抑制作用抑制作用(reversible inhibition)reversible inhibition)兩大類。兩大類。1、可逆抑制作用、可逆抑制作用：n 抑抑制制劑劑以以非非共共價價鍵鍵與與酶酶分分子子可可逆逆性性結結合合造造成成酶酶活活性性的的抑抑制制，且且可可采采用用透透析析等等簡簡單單方方法法去去除除抑抑制制劑劑而而使使酶酶活活性性完完全全恢恢復復的的抑抑制制作作用用就就是是可可逆抑制作用。逆抑制作用。n 可可逆逆抑抑制制作作用用包包括括競競爭爭性性和和非非競競爭爭性性抑抑制制兩兩種類型。種類型。競競爭爭性性抑抑制制的的速速度度方方程程與與圖圖形形特特

33、征征競爭性抑制的雙倒數圖形特征競爭性抑制的雙倒數圖形特征n 競爭性抑制的特點競爭性抑制的特點：競爭性抑制劑往往是酶的競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物底物類似物或反應產物；或反應產物；抑抑制制劑劑與與酶酶的的結結合合部部位位與與底底物物與與酶酶的的結結合合部部位位相相同；同；抑抑制制劑劑濃濃度度越越大大，則則抑抑制制作作用用越越大大；但但增增加加底底物物濃度可使抑制程度減??；濃度可使抑制程度減??；動力學參數：動力學參數：KmKm值增大，值增大，VmVm值不變值不變。非競爭性抑制作用非競爭性抑制作用：n抑抑制制劑劑既既可可以以與與游游離離酶酶結結合合，也也可可以以與與ESES復復合合物物結結合合，

34、使使酶酶的的催催化化活活性性降降低低，稱稱為為非非競競爭性抑制。爭性抑制。非非競競爭爭性性抑抑制制的的速速度度方方程程與與圖圖形形特特征征非競爭性抑制的雙倒數圖形特征非競爭性抑制的雙倒數圖形特征n非競爭性抑制的特點：非競爭性抑制的特點：非非競競爭爭性性抑抑制制劑劑的的化化學學結結構構不不一一定定與與底底物物的的分子結構類似；分子結構類似；底底物物和和抑抑制制劑劑分分別別獨獨立立地地與與酶酶的的不不同同部部位位相相結合；結合；抑抑制制劑劑對對酶酶與與底底物物的的結結合合無無影影響響，故故底底物物濃濃度的改變對抑制程度無影響；度的改變對抑制程度無影響；動力學參數：動力學參數：KmKm值不變，值不變

35、，VmVm值降低值降低。競爭性抑制作用競爭性抑制作用非競爭性抑制作用非競爭性抑制作用競競爭爭性性非非競競爭爭性性抑抑制制作作用用機機理理示示意意圖圖底物與酶專一性結合底物與酶專一性結合2 2、不可逆抑制作用、不可逆抑制作用n 抑抑制制劑劑與與酶酶分分子子的的必必需需基基團團共共價價結結合合引引起起酶酶活活性性的的抑抑制制，且且不不能能采采用用透透析析等等簡簡單單方方法法使使酶酶活活性性恢恢復的抑制作用就是復的抑制作用就是不可逆抑制作用。不可逆抑制作用。n 酶酶的的不不可可逆逆抑抑制制作作用用（如如有有機機磷磷農農藥藥對對膽膽堿堿酯酯酶酶的抑制和的抑制和重金屬、碘乙酰胺重金屬、碘乙酰胺對巰基酶的

36、抑制）。對巰基酶的抑制）。專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑 這類抑制劑選擇性很強，它只能專一性地與這類抑制劑選擇性很強，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團不可逆結合，引起酶的活酶活性中心的某些基團不可逆結合，引起酶的活性喪失。性喪失。實例：實例：有機磷殺蟲劑有機磷殺蟲劑-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX非專一性不可逆抑制劑非專一性不可逆抑制劑抑抑制制劑劑作作用用于于酶酶分分子子中中的的一一類類或或幾幾類類基基團團，這這些些基團中包含了必需基團，因而引起酶失活。基團中包含了必需基團，因而引起酶失活。類型類型：（三）、激活劑對反應速度的影響（三）、激活劑對反應速度的

37、影響n 能能夠夠促促使使酶酶促促反反應應速速度度加加快快的的物物質質稱稱為為酶酶的激活劑。的激活劑。n 酶酶的的激激活活劑劑大大多多數數是是無無機機離離子子，如如K K+、MgMg2+2+、MnMn2+2+、ClCl-等。等。（四）、酶濃度對反應速度的影響四）、酶濃度對反應速度的影響n當當反反應應系系統(tǒng)統(tǒng)中中底底物物的的濃濃度度足足夠夠大大時時，酶酶促促反應速度與酶濃度成反應速度與酶濃度成正比正比，即，即=kEkE。（五）、溫度對反應速度的影響（五）、溫度對反應速度的影響n一一般般來來說說，酶酶促促反反應應速速度度隨隨溫溫度度的的增增高高而而加加快快。但但當當溫溫度度增增加加達達到到某某一一點

38、點后后，由由于于酶酶蛋蛋白白的的熱熱變變性性作作用用，反反應應速速度度迅迅速速下下降降，直直到到完全失活。完全失活。n 酶酶促促反反應應速速度度隨隨溫溫度度升升高高而而達達到到一一最最大大值值時時的溫度就稱為的溫度就稱為酶的最適溫度酶的最適溫度。溫度對酶促反應速度的影響溫度對酶促反應速度的影響（六）、溶液（六）、溶液pHpH對反應速度的影響對反應速度的影響n 觀觀察察pHpH對對酶酶促促反反應應速速度度的的影影響響，通通常常為為一一“鐘鐘形形”曲曲線線，即即pHpH過過高高或或過過低低均均可可導導致致酶酶催化活性的下降。催化活性的下降。n 酶酶催催化化活活性性最最高高時時溶溶液液的的pHpH值

39、值就就稱稱為為酶酶的的最適最適pHpH。pHpH對酶促反應速度的影響對酶促反應速度的影響n 人體內大多數酶的最適人體內大多數酶的最適pHpH在在6.56.58.08.0之間。之間。n 酶的最適酶的最適pHpH不是酶的特征性常數不是酶的特征性常數。n pHpH對酶促反應速度的影響，其原因主要是由對酶促反應速度的影響，其原因主要是由于于pHpH的改變導致了酶的催化基團以及底物分的改變導致了酶的催化基團以及底物分子的解離狀態(tài)改變或者導致了酶蛋白的變性。子的解離狀態(tài)改變或者導致了酶蛋白的變性。四、酶的活力測定四、酶的活力測定在在酶酶的的生生產產及及應應用用過過程程中中，經經常常要要進進行行酶酶的的活活

40、力測定，以確定酶量的多少及其變化情況。力測定，以確定酶量的多少及其變化情況。酶酶活活力力是是指指在在一一定定條條件件下下，酶酶所所催催化化的的反反應應速速度。反應速度越大，意味著酶活力越高。度。反應速度越大，意味著酶活力越高。酶催化反應速度，用單位時間內底物的減少量酶催化反應速度，用單位時間內底物的減少量或產物的增加量表示。即：或產物的增加量表示。即：V=S/tV=S/t或或P/tP/t1、酶活力測定方法、酶活力測定方法酶酶活活力力測測定定方方法法多多種種多多樣樣?？偪偟牡囊笄笫鞘强炜焖偎?、簡便、準確。簡便、準確。酶酶活活力力測測定定均均包包括括兩兩個個階階段段。首首先先要要在在一一定定的

41、的條條件件下下，酶酶與與其其作作用用底底物物反反應應一一段段時時間間，然然后后再再測測定定反反應應液液中中底底物物或或產產物物變變化化的的量量。一一般般采采取取如下步驟：如下步驟：（1）根根據據酶酶的的專專一一性性，選選擇擇適適宜宜的的底底物物，并并配配制制成一定濃度的底物溶液。成一定濃度的底物溶液。（2）根根據據酶酶的的動動力力學學性性質質，確確定定酶酶促促反反應應的的溫溫度度，pH值、底物濃度、激活劑濃度等值、底物濃度、激活劑濃度等條件條件。（3）在在一一定定條條件件下下，將將一一定定量量的的酶酶液液與與底底物物溶溶液液混合均勻，適時記下反應開始的混合均勻，適時記下反應開始的時間時間。（4

42、 4）反應到一定的時間，取出適量的反應液運用）反應到一定的時間，取出適量的反應液運用各種生化檢測技術，各種生化檢測技術，測定產物的生產量或底物的減測定產物的生產量或底物的減少量。少量。為了準確地反映酶促反應的結果，應盡量采為了準確地反映酶促反應的結果，應盡量采用快速、簡便的方法，立即測出結果。若不能立即用快速、簡便的方法，立即測出結果。若不能立即測出結果的，則要及時終止酶反應，然后再測定。測出結果的，則要及時終止酶反應，然后再測定。終止酶反應終止酶反應的方法很多，的方法很多，常用的有：常用的有：反應時間一到，立即取出適量的反應液，置于沸水反應時間一到，立即取出適量的反應液，置于沸水浴中，浴中，

43、加熱加熱使酶失活；使酶失活；立即加入適宜的立即加入適宜的酶變性劑酶變性劑，如三氯醋酸等，使酶變，如三氯醋酸等，使酶變性失活；性失活；加入加入酸或堿溶液酸或堿溶液，使反應液的，使反應液的pH值迅速遠離酶催化值迅速遠離酶催化反應的最適反應的最適pH，從而終止反應；從而終止反應；將取出的反應液立即置于低溫冰箱、冰粒堆或冰鹽將取出的反應液立即置于低溫冰箱、冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應液的溶液中，使反應液的溫度迅速降低至溫度迅速降低至100C以下以下等等。等等。測定反應液中物質的變化量，可采用光學檢測法，測定反應液中物質的變化量，可采用光學檢測法，化學檢測法等化學檢測法等生化檢測技術生化檢測技術。例如，用

44、分光光度法測定堿性磷酸酶催化硝基酚磷例如，用分光光度法測定堿性磷酸酶催化硝基酚磷酸水解生成的對硝基酚的量；酸水解生成的對硝基酚的量；用化學滴定法測定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄用化學滴定法測定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。糖的量等等。一種酶可能有多種測定方法，要根據實際情況選用。一種酶可能有多種測定方法，要根據實際情況選用。2、酶活力單位酶活力單位活力單位活力單位（activeunit）習慣單位（習慣單位（U）:底物底物(或產物或產物)變化量變化量/單位時間單位時間國際單位（國際單位（IU）:1moL變化量變化量/分鐘分鐘Katal（Kat）：）：1moL變化量變化量/秒秒比活力比活

45、力=總活力單位總活力單位總蛋白總蛋白mg數數=U(或或IU)mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小量度酶純度量度酶純度比活力比活力（specificactivity）3.固定化酶的活力測定固定化酶的活力測定 與與水水不不溶溶性性載載體體結結合合，在在一一定定的的空空間間范范圍圍內內起起催催化化作作用用的的酶酶稱稱為為固固定定化化酶酶。固固定定化化酶酶的的性性質質與與游游離離酶酶有有一一些些區(qū)區(qū)別別。所所以以固固定定化化酶酶的的活活力力測測定定與與游離酶活力測定方法也有一些不同。游離酶活力測定方法也有一些不同。常用的固定化酶測定方法：常用的固定化酶測定方法：（1）振振蕩蕩測測定定：稱稱

46、取取一一定定重重量量的的固固定定化化酶酶，放放在在一一定定形形狀狀，一一定定大大小小的的容容器器中中，加加入入一一定定量量的的底底物物溶溶液液,在在特特定定的的條條件件下下,一一邊邊振振蕩蕩或或攪攪拌拌,一一邊邊進進行行催催化化反反應應，經過一定時間，取出一定量的反應液進行測定。經過一定時間，取出一定量的反應液進行測定。固固定定化化酶酶反反應應液液的的測測定定方方法法與與游游離離酶酶反反應應液液的的測測定定方方法法完完全全相相同同，振振蕩蕩或或攪攪拌拌速速度度對對反反應應速速度度有有很很大大影影響響。過過大大過過小小都都對對反反應應速速度度有有明明顯顯影影響響。所所以以，在在測測定定固固定定化

47、化酶酶的的活活力力時時，要要在在一一定定的的振振蕩蕩或或攪攪拌拌速速度度下進行。下進行。（2 2）柱法測定）柱法測定：將一定量的固定化酶裝進具有：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應柱中，讓底物溶液以一定的速度恒溫裝置的反應柱中，讓底物溶液以一定的速度流過酶柱，收集流出的反應液。按常規(guī)方法測定流過酶柱，收集流出的反應液。按常規(guī)方法測定底物的消耗量或產物的生成量。測定方法與游離底物的消耗量或產物的生成量。測定方法與游離酶反應液的測定方法相同。酶反應液的測定方法相同。但在測定固定化酶活力要在但在測定固定化酶活力要在固定的流速條件固定的流速條件下下進行。而且酶柱的形狀和徑高比都對反應速度有進行。

48、而且酶柱的形狀和徑高比都對反應速度有明顯影響。所有明顯影響。所有這些條件都必須固定不變。這些條件都必須固定不變。（3）連連續(xù)續(xù)測測定定法法：利利用用連連續(xù)續(xù)分分光光光光度度法法等等測測定定方方法法可可以以對對固固定定化化酶酶反反應應液液進進行行連連續(xù)續(xù)測測定定，從從而而測測定定固固定定化化酶酶的的酶酶活活力力。測測定定時時，可可將將振振蕩蕩反反應應器器中中的的反反應應液液連連續(xù)續(xù)引引起起連連續(xù)續(xù)測測定定儀儀（例例如如，雙雙束束紫紫外外光光分分光光光光度度計計等等）的的流流動動比比色色杯杯中中進進行行連連續(xù)續(xù)分分光光測測定定?；蚧蛘哒呤故构坦潭ǘɑ该噶髁鞒龀龅牡姆捶磻獞阂哼B連續(xù)續(xù)流流經經流

49、流動動比比色色杯杯進行連續(xù)分光測定。進行連續(xù)分光測定。酶酶活活力力的的連連續(xù)續(xù)測測定定，可可以以及及時時并并準準確確地地知知道道某某一一時時刻刻的的酶酶活活力力變變化化情情況況，對對利利用用固固定定化化酶酶進進行行連連續(xù)續(xù)生生產產和和自自動動控控制制有有重重大大意意義義，這這方方面面正正在在不不斷斷地地研究發(fā)展之中。研究發(fā)展之中。（4）固定化酶的比活力測定固定化酶的比活力測定：游游離離酶酶的的比比活活力力可可以以用用每每1ml酶酶蛋蛋白白所所具具有有的的酶酶活活力力單單位位數數表表示示。在在固固定定化化酶酶中中，一一般般要要采采用用每每1mg干干固固定定化化酶酶所所具有的酶活力單位數表示，即為

50、具有的酶活力單位數表示，即為單位單位/mg干固定化酶干固定化酶。為為此此，測測定定固固定定化化酶酶比比活活力力時時，首首先先用用濕濕固固定定化化酶酶測測定定其其酶酶活活力力，然然后后將將固固定定化化酶酶在在一一定定條條件件下下干干燥燥，稱稱取取一一定定量量的的干干重重，然然后后計計算算兩兩者者的的商商,才才得得到到固固定定化化酶酶的的比比活活力力。也也可可稱稱取取一一定定量量的的干干固固定定化化酶酶，讓讓它它在在一一定定條條件件下下充充分分溶溶漲漲后后進行固定化酶活力測定，再計算比活力。進行固定化酶活力測定，再計算比活力。對對于于酶酶膜膜，酶酶板板或或酶酶管管等等固固定定化化酶酶，其其比比活活

51、力力則則以以單單位位面面積的活力單位表示。即為積的活力單位表示。即為酶活力（單位）酶活力（單位）/cm2。（5）酶結合效率與酶活力回收率的測定）酶結合效率與酶活力回收率的測定：將將一一定定量量的的酶酶進進行行固固定定化化時時，不不是是全全部部都都成成為為固固定定化化酶酶，而而總總是是有有一一部部分分酶酶沒沒有有與與載載體體結結合合在在一一起起。為為了了確確定定固固定定化化的的效效果果，需需要要測測定定酶酶的的結結合合效效率率或或酶活力回收率。酶活力回收率。酶酶結結合合效效率率一一般般由由加加入入的的總總酶酶活活力力減減去去未未結結合合的的酶活力的差值與加入的酶活力的百分比來表示。酶活力的差值與

52、加入的酶活力的百分比來表示。未未結結合合酶酶活活力力，包包括括固固定定化化后后濾濾出出固固定定化化酶酶后后的的濾濾液液以以及及洗洗滌滌固固定定化化酶酶的的洗洗滌滌液液中中所所含含有有的的酶酶活活力力的和。的和。酶酶活活力力回回收收率率是是指指固固定定化化酶酶的的總總活活力力與與用用于于固固定化酶總活力的百分比。定化酶總活力的百分比。當當固固定定化化方方法法對對酶酶活活力力沒沒有有明明顯顯影影響響時時，酶酶結結合合效效率率與與酶酶活活力力回回收收率率的的數數值值相相近近。然然后后固固定定化化方方法法往往往往對對酶酶活活力力有有一一定定影影響響，兩兩者者的的數數值值往往往往有有較較大大的的差差別別

53、。所所以以，通通常常都都通通過過測測定定酶酶結結合合效效率來表示固定化的效果。率來表示固定化的效果。（6）相對酶活力測定）相對酶活力測定：具具有有相相同同酶酶蛋蛋白白量量的的固固定定化化酶酶活活力力與與游游離離酶酶活活力的比值稱為相對酶活力。力的比值稱為相對酶活力。固固定定化化酶酶的的相相對對酶酶活活力力與與載載體體結結構構，顆顆粒粒大大小小，底底物物分分子子量量大大小小及及酶酶結結合合效效率率等等有有密密切切關關系系。相相對對酶酶活活力力的的高高低低表表明明了了固固定定化化酶酶應應用用價價值值的的大大小小。故故此此，在在固固定定化化酶酶的的研研制制過過程程中中，應應從從固固定定化化載載體體，

54、固固定定化化技技術術等等方方面面進進行行研研究究和和改改進進，以以提提高高固固定定化化酶的相對酶活力。酶的相對酶活力。第四節(jié)第四節(jié)酶的生產方法酶的生產方法n酶酶的的生生產產是是指指經經過過預預先先設設計計，通通過過人人工工操操作作控控制制而獲得所需的酶的過程。而獲得所需的酶的過程。n酶酶的的生生產產方方法法可可分分為為提提取取法法、發(fā)發(fā)酵酵法法以以及及化化學學合合成成法法等等3 3種種。其其中中，提提取取法法是是最最早早采采用用而而沿沿用用至至今今的的方方法法，發(fā)發(fā)酵酵法法是是5050年年代代以以來來酶酶生生產產的的主主要要方方法。而化學合成法仍在實驗室階段。法。而化學合成法仍在實驗室階段。一

55、、提取分離法一、提取分離法 提提取取分分離離法法是是指指將將酶酶從從細細胞胞或或其其他他含含酶酶原原料料中中提提取取出出來來，再再與與雜雜質質分分開開，而而獲獲得得符符合合研研究究或或使使用用要要求求的的酶酶制制品品的的過過程程。提取法分離法是最早采用的酶生產方法。提取法分離法是最早采用的酶生產方法。酶酶的的提提取取是是指指在在一一定定的的條條件件下下，用用適適當當的的溶溶劑劑處處理理含含酶酶原原料料，使使酶酶充充分分溶溶解解到到溶溶劑劑中中的的過過程程，也也稱稱為為酶酶的的抽抽提提。酶酶提取時首先應根據酶的結果和溶解性質，選擇適當的溶劑。提取時首先應根據酶的結果和溶解性質，選擇適當的溶劑。根

56、根據據酶酶提提取取時時所所采采用用的的溶溶劑劑或或溶溶液液的的不不同同，酶酶的的提提取取方方法法主主要要有有鹽鹽溶溶液液提提取取、酸酸溶溶液液提提取取、堿堿溶溶液液提提取取和和有有機機溶溶劑劑提取提取等方法。等方法。酶酶的的分分離離純純化化是是采采用用各各種種生生化化分分離離技技術術使使酶酶與與各各種種雜雜質分離，達到所需的純度，以滿足使用的要求。質分離，達到所需的純度，以滿足使用的要求。酶的分離純化方法主要有：酶的分離純化方法主要有：1 1、沉淀分離、沉淀分離 （1 1）鹽鹽析析沉沉淀淀法法 （2 2）等等電電點點沉沉淀淀法法 （3 3）有有機機溶溶劑劑沉淀法沉淀法 （4 4）復合沉淀法）復

57、合沉淀法 （5 5）選擇性變性沉淀法）選擇性變性沉淀法 2 2、離心分離、離心分離 3 3、過濾與膜分離、過濾與膜分離 4 4、層析分離、層析分離 （1 1）吸附層析）吸附層析 （2 2）分配層析）分配層析 （3 3）離子交換層析）離子交換層析 （4 4）凝膠層析）凝膠層析 （5 5）親和層析）親和層析 （6 6）層析聚焦）層析聚焦 5、電泳分離、電泳分離（1）紙電泳）紙電泳（2）薄層電泳）薄層電泳（3）薄膜電泳）薄膜電泳（4）凝膠電泳）凝膠電泳（5）等電點聚焦電泳）等電點聚焦電泳6、萃取分離、萃取分離（1）有機溶劑萃取有機溶劑萃?。?）雙水相萃取）雙水相萃?。?）超臨界萃取）超臨界萃?。?）

58、反膠束萃?。┓茨z束萃取7、結晶、結晶（1）鹽析結晶法）鹽析結晶法（2）有機溶劑結晶法）有機溶劑結晶法（3）透析平衡結晶法）透析平衡結晶法（4）等電點結晶法）等電點結晶法8、濃縮與干燥、濃縮與干燥選用酶的分離純化的要點：選用酶的分離純化的要點：1、目標酶分子特性及其他物理化學性質；、目標酶分子特性及其他物理化學性質；2、酶分子和雜質的主要性質差異；、酶分子和雜質的主要性質差異；3、酶的使用目的和要求；、酶的使用目的和要求；4、技術實施的難易程度；、技術實施的難易程度；5、分離成本的高低；、分離成本的高低；6、是否會造成環(huán)境污染等、是否會造成環(huán)境污染等 從從動動物物、植植物物或或微微生生物物的的組

59、組織織、細細胞胞中中提提取取分分離離所所需需的的酶，至今仍然使用。酶，至今仍然使用。例例如如，從從動動物物胰胰臟臟中中提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰淀淀粉粉酶酶、胰胰脂脂肪肪酶酶或或這這些些酶酶的的混混合合物物胰胰酶酶；從從動動物物胃胃中中提提取取胃胃蛋蛋白白酶酶；從從動動物物小小腸腸中中提提取取堿堿性性磷磷酸酸酶酶；從從木木瓜瓜中中提提取取木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶；從從菠菠蘿蘿中中提提取取菠菠蘿蘿蛋蛋白白酶酶；從從檸檸檬檬酸酸發(fā)發(fā)酵酵的的廢廢菌菌體體黑黑曲霉菌體中提取果膠酶等。曲霉菌體中提取果膠酶等。酶酶的的分分離離提提取取技技術術不不但但在在酶酶的的提提取取分分離離法法生生產產中中使使用用，而

60、而且且在在采采用用其其他他生生產產方方法法生生產產酶酶的的過過程程中中也也是是不不可可缺缺少少的的技技術術，此此外外，在在酶酶的的結結構構與與功功能能、酶酶的的催催化化機機制制、酶酶催催化化動力學等酶學研究方面也是不可缺少的重要手段。動力學等酶學研究方面也是不可缺少的重要手段。二、生物合成法二、生物合成法 生生物物合合成成法法是是5050年年代代以以來來酶酶生生產產的的主主要要方方法法。它它是是利利用用微微生生物物細細胞胞、植植物物細細胞胞或或動動物物細細胞胞的的生生命命活活動動而而獲獲得人們所需酶的技術過程。得人們所需酶的技術過程。生物合成法產酶程序生物合成法產酶程序1 1、經經過過篩篩選選

61、、誘誘變變、細細胞胞融融合合、基基因因重重組組等等方方法法獲獲得得優(yōu)良的產酶細胞；優(yōu)良的產酶細胞；2 2、在在人人工工控控制制條條件件的的生生物物反反應應器器中中進進行行細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)，通通過細胞內物質的新陳代謝作用，生成各種代謝產物。過細胞內物質的新陳代謝作用，生成各種代謝產物。3 3、再經過分離純化得到所需的酶。、再經過分離純化得到所需的酶。經經過過預預先先設設計計，通通過過人人工工操操作作，利利用用微微生生物物細細胞胞的的生生命命活活動動合合成成所所需需酶酶的的方方法法又又稱稱為為發(fā)發(fā)酵酵法法，根根據據微微生生物物培培養(yǎng)養(yǎng)方方式式的的不不同同，發(fā)發(fā)酵酵法法可可分分為為固固體體培培養(yǎng)養(yǎng)發(fā)

62、發(fā)酵酵、液液體體深深層層發(fā)發(fā)酵酵、固固定定化化細細胞胞發(fā)發(fā)酵酵和和固固定化原生質體發(fā)酵等。定化原生質體發(fā)酵等。固固體體培培養(yǎng)養(yǎng)發(fā)發(fā)酵酵的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基,以以麩麩皮皮、米米糠糠為為原原料料，加加入入其其他他必必要要的的營營養(yǎng)養(yǎng)成成分分，制制成成固固體體或或半半固固體體的的麩麩曲曲，經經過過滅滅菌菌、冷冷卻卻后后，接接種種菌菌株株后后在在一一定定條條件下進行發(fā)酵，已獲得所需的酶。件下進行發(fā)酵，已獲得所需的酶。其其優(yōu)優(yōu)點點是是：設設備備簡簡單單，操操作作方方便便，麩麩曲曲中中酶酶的的濃度較高，特別適合各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產酶。濃度較高，特別適合各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產酶。其其缺缺點點是是勞勞動動強強度

63、度較較大大，原原料料利利用用率率較較低低，生生產周期較長。產周期較長?，F現在在普普遍遍使使用用的的是是液液體體深深層層發(fā)發(fā)酵酵技技術術。是是置置于于生生物物反反應應器器中中，經經過過滅滅菌菌、冷冷卻卻后后，接接種種產產酶酶細細胞胞，在在一一定定條條件件下下，進進行行發(fā)發(fā)酵酵，生生產產所所需需的的酶酶。例例如如，利利用用枯枯草草桿桿菌菌細細胞胞生生產產淀淀粉粉酶酶、蛋蛋白白酶酶，利利用用黑黑曲曲霉霉生生產產糖糖化化酶酶、果果膠膠酶酶，利利用用大大腸腸桿桿菌菌生生產產谷谷氨氨酸酸脫脫羧羧酶酶、多多核核苷苷酸酸聚聚合合酶等。酶等。其其特特點點是是：機機械械化化程程度度較較高高，技技術術管管理理較較嚴

64、嚴格格，酶酶的的產率較高，質量穩(wěn)定，產品回收率較高。產率較高，質量穩(wěn)定，產品回收率較高。用用固固定定化化細細胞胞生生產產胞胞外外酶酶。固固定定化化細細胞胞是是指指固固定定在在水水不不溶溶性性的的載載體體上上，在在一一定定空空間間范范圍圍內內進進行行生生命命活活動動的的細細胞胞。例例如如，固固定定化化枯枯草草桿桿菌菌細細胞胞生生產產 淀粉酶，固定化黑曲霉細胞生產糖化酶、果膠酶等。淀粉酶，固定化黑曲霉細胞生產糖化酶、果膠酶等。其其特特點點是是：1 1、細細胞胞密密度度大大，可可提提高高產產酶酶能能力力；2 2、發(fā)發(fā)酵酵穩(wěn)穩(wěn)定定性性好好，可可以以反反復復使使用用或或連連續(xù)續(xù)使使用用較較長長時時間間；

65、3 3、細細胞胞固固定定在在載載體體上上，流流失失較較少少，可可以以在在高高稀稀釋釋率率的的條條件件下下連連續(xù)續(xù)發(fā)發(fā)酵酵，利利于于自自動動化化生生產產；4 4、發(fā)發(fā)酵酵液液中中含菌教少，利于產品分離純化，提高質量等。含菌教少，利于產品分離純化，提高質量等。利利用用固固定定化化原原生生質質體體生生產產胞胞內內酶酶。是是指指固固定定在在載載體體上上、在在一一定定空空間間范范圍圍內內進進行行生生命命活活動動的的原原生生質質體體。例例如如，固固定定化化枯枯草草桿桿菌菌原原生生質質體體生生產產堿堿性性磷磷酸酸酶酶；固固定定化化黑黑曲曲霉霉原原生生質質體體生生產產葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶；固固定定化化谷氨

66、酸棒桿菌原生質體生產谷氨酸脫氫酶等。谷氨酸棒桿菌原生質體生產谷氨酸脫氫酶等。其其特特點點是是：1、有有利利于于胞胞內內物物質質透透過過細細胞胞膜膜分分泌泌到到細胞外。細胞外。2、有利于細胞間質中的物質游離到細胞外。、有利于細胞間質中的物質游離到細胞外。3、穩(wěn)定性好，可以連續(xù)或重復使用一段時間。、穩(wěn)定性好，可以連續(xù)或重復使用一段時間。8080年年代代以以來來，除除了了利利用用微微生生物物細細胞胞進進行行發(fā)發(fā)酵酵以以外外，還還發(fā)發(fā)展展起起了了用用植植物物細細胞胞或或動動物物細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)技技術術，即即通通過過特特定定技技術術獲獲得得優(yōu)優(yōu)良良的的動動、植植物物細細胞胞，然然后后在在人人工工控控制制的的條條件件的的反反應應器器中中進進行行細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)以以得得到所需的酶的過程。到所需的酶的過程。例例如如，利利用用大大蒜蒜細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)生生產產超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶；利利用用木木瓜瓜細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)生生產產木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶；利利用用人人黑黑色色素素瘤瘤細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)生生產產血血纖纖維維蛋蛋白白溶酶原激活劑等。溶酶原激活劑等。動物細胞的獲得：動物細胞