《醫(yī)學(xué)碩士答辯-歐琴答辯》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《醫(yī)學(xué)碩士答辯-歐琴答辯（43頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,EBV LMP2 B,細胞表位的預(yù)測、克隆、表達及其融合蛋白免疫原性的初步研究,溫州醫(yī)學(xué)院,2004,級碩士學(xué)位論文答辯,答辯人：歐 琴,導(dǎo) 師：張麗芳 教授,夏克棟 教授,專 業(yè)：病原生物學(xué),2007.5.17,主 要 內(nèi) 容,研究背景,研究目的,研究方案,結(jié) 果,分析與討論,結(jié) 論,研 究 背 景,EB,病毒,(Epstein-Barr,virua,EBV,),屬于,皰疹病毒科。引起的主要疾病包括傳染性單核細胞增多癥、移植后淋巴細胞增多癥,(PTLD),、霍奇金病、,Burkitt,淋巴瘤以及鼻咽癌,

2、(NPC),。,研 究 背 景,腫瘤 亞型,EBV,陽性率,表,1 EBV,相關(guān)的增生性疾病,Burkitt,淋巴瘤,E-BL 100%,S-BL 15%-85%,AIDS-BL 100%,NPC,低分化或未分化,100,霍奇金病,mc/ld 80%-90%,ns 30,T,細胞淋巴瘤,fatal IM 100%,AILD 40%,淋巴母細胞瘤,fatal IM 100%,與器官移植相關(guān),100,與,AIDS,相關(guān),70,-80%,研 究 背 景,LMP2,不是轉(zhuǎn)化基因，維持,EBV,潛伏感染。,LMP2,成為,NPC,等,EBV,相關(guān)腫瘤治療的理想,靶抗原之一。,研 究 背 景,表位疫苗是目

3、前研制感染性疾病與惡性腫瘤疫苗的方向。,多表位疫苗能選擇性誘導(dǎo)多價、多特異性應(yīng)答和控制免疫應(yīng)答類型。,研 究 背 景,NPC,患者血清中能檢測,LMP2,抗體。,B,細胞表位的研究為單克隆抗體的制備提,供更充分的依據(jù)，以,B,細胞表位為基礎(chǔ)的多肽,抗原可用于血清學(xué)檢測。,研 究 目 的,1.,預(yù)測,EBV LMP2,的,B,細胞表位，可為其單克隆抗體的制備及表位疫苗設(shè)計等研究提供理論依據(jù)。,2.,分別構(gòu)建含預(yù)測,B,細胞表位多肽的原核重組質(zhì)粒，采用,6,個組氨酸標簽,(,His.tag,),表達表位融合蛋白，并用,Ni-NTA,樹脂親和層析法分別純化表位融合蛋白。,3.,將純化的蛋白分別免疫小

4、鼠，檢測其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的特異性,IgG,抗體；選擇抗原性強的融合蛋白作包被抗原，用,ELISA,檢測,NPC,組、,CA,疾病對照組和健康對照組的血清特異性抗體。為,B,細胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在,NPC,血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值進行初步探討。,研 究 方 案,一、,EBV LMP2,的二級結(jié)構(gòu)分析,和,B,細胞表位預(yù)測,研 究 方 案,采用,EXPASY,服務(wù)器提供的,SwissProt,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索,LMP2,完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列,(,http:/,www.expasy.org/sprot,/,);,采用,EXPASY,服務(wù)器提供的,SOPMA,、,GOR,、,nnPredi

5、ct,、,HNN,方法,預(yù)測,LMP2,二級結(jié)構(gòu),(,http:/,www.expasy.ch,/tools,),；,采用,EXPASY,服務(wù)器提供的,SOSUI,方法預(yù)測,LMP2,跨膜區(qū)域,(,http:/,www.expasy.ch,/tools,),；,采用,EXPASY,服務(wù)器提供的,Hopp&Woods,、,Emini,、,Jameson-Wolf,、,Zimmerman,方法預(yù)測,LMP2,的親水性、表面可及性、抗原性、極性及,柔韌性參數(shù),(,http:/www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl,),；,對上述方法預(yù)測的結(jié)果進行綜合分析，推斷,LMP

6、2,的,B,細胞表位，并,用吳玉章等建立的抗原性指數(shù),(AI),綜合評判,EBV LMP2,的,B,細胞優(yōu)勢,表位。,研 究 方 案,二、,EBV LMP2 B,細胞表位的克隆、,表達及其融合蛋白的純化,研 究 方 案,引物設(shè)計與合成,退火獲得目的基因,pET32a(+)/EBV-LMP2 B,細胞表位重組質(zhì)粒的構(gòu)建,純化、連接、轉(zhuǎn)化,DH5,大腸桿菌,轉(zhuǎn)化,BL21,大腸桿菌，誘導(dǎo)、表達、純化表位融合蛋白,SDS-PAGE,、,Western blot,分析,pET32a(+),質(zhì)粒酶切,酶切、測序鑒定,研 究 方 案,引物 堿基序列 酶切位點,OZLF-67 5TCGAGTTACAGCAG

7、GCTGTTAA,BamHI,AGGGCGGATCTTCGATGCGG 3,OZLF-68 5GATCCCGCATCGAAGATCCGCC,XhoI,CTTTAACAGCCTGCTGTAAC 3,OZLF-69 5TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG 3,BamHI,OZLF-70 5GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC 3,XhoI,OZLF-71 5TCGAGTTAATTCGGGATAAATTC,BamHI,TGTGCTGGACAATGATTTG 3,OZLF-72 5GATCCAAATCATTGTCCAGCACA,XhoI,GAATTTATCCCGAATTAAC

8、3,圖,1 pET32a/B,細胞表位的重組質(zhì)粒圖,研 究 方 案,研 究 方 案,層析純化蛋白：,灌 膠,Buffer B,液調(diào)節(jié)吸光度和透光度,樣本處理,樣本加入層析柱中，收集濾液,Buffer B,液洗滌，至,A,0.01,，收集濾液,Buffer D,液洗滌，至,A,0.01,，收集濾液,Buffer E,液洗滌，至,A,0.01,，收集濾液,樣本收集,SDS-PAGE,分析濾液中目的蛋白分布情況,Buffer B:8M,尿素,(pH8.0),Buffer D:8M,尿素,(pH6.8),Buffer E:8M,尿素,(pH4.0),研 究 方 案,三、,EBV LMP2 B,細胞表位

9、融合蛋白,免疫原性的初步研究及血清學(xué)檢測,研 究 方 案,動物：,ICR,小鼠,免疫方式：背部皮下多點注射,采血方式：眶靜脈采血，,3,只,/,組,表,2,動物實驗設(shè)計,組別 數(shù)量,(,只,),蛋白 劑量,(,ug,/,只,),注射時間 取血時間,9 ozlf-67 50 0,、,2,、,3W 2,、,3,、,6W,9 ozlf-69 50 0,、,2,、,3W 2,、,3,、,6W,9 ozlf-71 50 0,、,2,、,3W 2,、,3,、,6W,9,is,蛋白,50 0,、,2,、,3W 2,、,3,、,6W,9 PBS,0,、,2,、,3W 2,、,3,、,6W,研 究 方 案,EL

10、ISA,檢測：,以純化的融合蛋白作包被抗原,以,B95.8,細胞作包被抗原,選擇抗原性強的融合蛋白作包被抗原，檢測,NPC,組、,CA,疾病對照組和健康對照組的血清特異性抗體,結(jié) 果,一、,EBV LMP2,的二級結(jié)構(gòu) 分析和,B,細胞表位預(yù)測,結(jié) 果,H:,-,螺旋；,e:,-,片層；,c:,無規(guī)卷曲；,-:,未預(yù)測結(jié)構(gòu)；,t:,-,轉(zhuǎn)角,圖,2 EBV LMP2,二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié) 果,aa,144,150 202,208 265,268 318,322 375,390 445,455,圖,2,按,SOSUI,程序預(yù)測,EBV LMP2,蛋白跨膜區(qū),膜內(nèi)區(qū)域,跨膜區(qū),膜外區(qū)域,結(jié) 果,圖,3

11、,各種不同參數(shù)對,EBV,LMP2,的預(yù)測結(jié)果,a.,親水性參數(shù),b.,極性參數(shù),c.,柔韌性參數(shù),d.,表面可及性,e.,抗原性,二級結(jié)構(gòu),10,82,89,108,116,126,142,149,198,206,288,295,317,321,339,348,379,389,414,422,481,497,膜外區(qū)域,144,150,202,208,265,268,318,322,375,390,445,455,親水性,15,26,36,41,43,60,65,74,90,96,101,119,176,179,199,205,236,242,414,416,483,492,表面可及性,13,

12、18,20,22,25,32,39,64,67,82,90,92,95,112,114,116,73,178,199,201,203,204,235,240,378,380,383,384,416,420,484,496,抗原性,10,83,88,109,111,121,174,179,198,207,235,241,290,293,340,348,380,387,413,421,471,476,483,491,極性,20,23,45,55,57,59,65,74,90,94,102,117,198,203,234,342,483,491,柔韌性,10,85,89,121,199,205,21

13、8,222,236,244,289,296,342,347,370,378,381,383,385,388,412,420,483,493,預(yù)測方法 預(yù)測結(jié)果,結(jié) 果,表,3,應(yīng)用不同方法預(yù)測,EBV LMP2,蛋白,B,細胞表位的肽段位置,結(jié) 果,145,150 TASVST 0.005,199,209 RIEDPPFNSLL 0.037,318,322 TLNLT 0.036,381,391 KSLSSTEFIPN 0.028,B,細胞表位區(qū)域 氨基酸序列 抗原性指數(shù),表,4 EBV LMP2,的,B,細胞表位優(yōu)勢區(qū)域的平均抗原性指數(shù),二、,EBV LMP2 B,細胞表位的克隆、,表達及其

14、融合蛋白的純化,結(jié) 果,結(jié) 果,圖,4,重組質(zhì)粒,pET32a/ozlf-67,酶切鑒定,1:DNA/Hind DNA Marker;,2.pET32a/ozlf-67;3:pET32a/ozlf-67/EcoR I;,4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I,圖,5,重組質(zhì)粒,pET32a/ozlf-69,酶切鑒定,1:DNA/Hind DNA Marker;,2.pET32a/ozlf-69;3:pET32a/ozlf-69/EcoR I;,4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I,圖,6,重組質(zhì)粒,pET32a/ozlf-71,酶切鑒定,1:DNA

15、/Hind DNA Marker;,2.pET32a/ozlf-71;3:pET32a/ozlf-71/EcoR I;,4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I,重組質(zhì)粒酶切鑒定,結(jié) 果,測序結(jié)果,圖,7 3,個重組的目的基因的測序圖,結(jié) 果,B,細胞表位融合蛋白鑒定,圖,8 B,細胞表位融合蛋白表達產(chǎn)物,SDS-PAGE,和,Western-Blot,分析,1:,蛋白分子標準物；,2:IPTG,誘導(dǎo)重組質(zhì)粒,pET32a/ozlf-67,蛋白表達；,3:IPTG,誘導(dǎo)重組質(zhì)粒,pET32a/ozlf-69,蛋白表達；,4:IPTG,誘導(dǎo)重組質(zhì)粒,pET32a/ozlf-7

16、1,蛋白表達；,5:IPTG,誘導(dǎo)重組質(zhì)粒,pET32a,蛋白表達；,6:BL21,結(jié) 果,ozlf-67,、,ozlf-69,、,ozlf-71,融合蛋白和,His,蛋白的純化,圖,9,純化的,ozlf-67,蛋白,SDS-PAGE,電泳分析,1,：蛋白分子標準物；,2,：樣品穿透液；,3,：,Buffer B,液濾液；,4,：,Buffer C,液,濾,液；,5-7,：,Buffer E,液,濾,液,圖,10,純化的,ozlf-69,蛋白,SDS-PAGE,電泳分析,1,：蛋白分子標準物；,2,：樣品穿透液；,3,：,Buffer B,液,濾,液；,4,：,Buffer C,液,濾,液；,5-8,：,Buffer E,液,濾,液,圖,11,純化的,ozlf-71,蛋白,SDS-PAGE,電泳分析,1,：蛋白分子標準物；,2,：樣品穿透液；,3,：,Buffer B,液濾液；,4,：,Buffer C,液濾液；,5-6,：,Buffer E,液濾液,圖,12,純化的,His,蛋白,SDS-PAGE,電泳分析,1,：蛋白分子標準物；,2,：樣品穿透液；,3,：,Buffer B,液濾液