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1、,#,Hgskolan i Bors,Mohammad Taherzadeh,第九章,甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化,第一節(jié) 概述,甾類激素,是指分子結(jié)構(gòu)中含有,環(huán)戊烷多氫菲核,的一類藥物。甾體化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖,91,。,甾類激素根據(jù)其生理活性可分為,腎上腺皮質(zhì)激素,、,性激素,和,蛋白同化激素,三大類。,在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用非常廣泛，用于,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,、控制炎癥、,哮喘病,、,皮膚病,、避孕、利尿等各方面的治療上，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。,早期甾類激素藥物的生產(chǎn)主要靠化學(xué)合成。,脫氧膽酸-醋酸可的松,甾體激素類藥物生產(chǎn)新的途徑,微生物轉(zhuǎn)化,。,少根根霉,及,黑根霉,能使黃體酮轉(zhuǎn)化成11,-,羥基黃

2、體酮,，,收率達(dá)85。,細(xì)菌,、,酵母,、,霉菌,和,放線菌,的某些種類都可能使甾類化合物的一定部位發(fā)生有價值的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，微生物轉(zhuǎn)化已成為甾體工業(yè)中不可缺少的部分，在生產(chǎn)中常采用化學(xué)合成與微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的辦法。,微生物轉(zhuǎn)化在生產(chǎn)工藝上有如下特點,:,可減少化學(xué)合成步驟，簡化生產(chǎn)流程，縮短生產(chǎn)路線。,能提高產(chǎn)物的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。,可進(jìn)行化學(xué)法難以實現(xiàn)的反應(yīng)。,微生物轉(zhuǎn)化避免和減少了強酸、強堿或化學(xué)有毒物質(zhì)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。,第二節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型,對甾體激素藥物合成比較重要的主要有:,氧化反應(yīng):,其中氧化反應(yīng)又包括甾體骨架上的,羥基化,和,脫氫,(,生成雙鍵,)、,甾醇,氧化成,

3、甾酮,、支鏈降解作用以及,D,環(huán)的切斷和,D,環(huán)開裂,形成內(nèi)酯環(huán),等。,還原反應(yīng),水解反應(yīng),一,、,羥化反應(yīng),通過微生物羥化酶能非常專一地選擇某個碳位置上將某空間位置上的,氫,取代氧化成原來空間構(gòu)型的,羥基,。,1,C,9,羥化,2,C,11,羥化,C,11,羥化是微生物轉(zhuǎn)化的,特有反應(yīng),，人體內(nèi)的,酶,也不能將甾體,C,11,羥化。,在,C,11,羥化菌株中，以,黑根霉,為最好,利用微生物轉(zhuǎn)化的方法實現(xiàn)、,C,11,、,C16,、,C,17,和,C,19,位的羥化反應(yīng)，這些也是制藥工業(yè)中很有價值的反應(yīng)。,二、環(huán)氧化反應(yīng),用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團的反應(yīng)。,三、脫氫反應(yīng),當(dāng)抗炎甾體

4、激素等藥物的母核,C,1,、,C,2,位置導(dǎo)入,雙鍵,后，其抗炎作用會,成倍,增加。,化學(xué)法,脫,C,1,、,C,2,氫是采用二氧化硒法，由于硒在生產(chǎn)中難以除盡會使產(chǎn)品中帶有少量對人體有害的物質(zhì)，所以采用,微生物轉(zhuǎn)化脫氫,是甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步。,微生物對甾體羥化與脫氫能力是相反的，,細(xì)菌,的脫氫能力比,真菌,大，特別以,棒狀桿菌,和,分枝桿菌,活力最大。球形芽孢桿菌、諾卡菌對可的松和皮質(zhì)醇也有較高的脫氫活力。,四、還原反應(yīng),微生物催化的還原反應(yīng)有各種,類型,：有的是甾類化合物上的醛或酮基被,還原,成伯醇或仲醇基；也有的是甾類核的,A,環(huán)或,B,環(huán)中的雙鍵被,加氫,還原成飽和鍵

5、等。,五、水解反應(yīng),微生物進(jìn)行的水解反應(yīng)包括脫,?；磻?yīng),、,環(huán)氧化,物的水解反應(yīng)等。,第三節(jié) 甾類激素的生產(chǎn)工藝過程,甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同，,發(fā)酵的產(chǎn)物,不是,目的產(chǎn)物,，而只是利用微生物的,酶,對,甾體底物,的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來獲得一定的產(chǎn)物。,整個生產(chǎn)過程，微生物的,生長,和甾體的,轉(zhuǎn)化,完全可以分開。,一般先進(jìn)行菌的培養(yǎng)，在菌生長過程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶，然后利用這些酶來改造分子的某一部位。,為了獲得較多的酶，首先需保證菌體的充分生長，但,微生物的生長與酶的生產(chǎn)條件不是完全一致的,。,一、甾類激素生產(chǎn)的原料,早期合成甾類激素的起始原料大多來自動

6、物的,膽甾醇,、,膽酸,等。因這些原料的來源少、含量低、成本高，不能滿足生產(chǎn)的需要。因而促使從植物中尋找起始原料并獲得成功。,已經(jīng),大量投產(chǎn)的甾類原料,：膽固醇、膽酸、薯蕷皂苷配基（穿龍薯蕷和盾葉薯蕷）、豆甾醇、澳洲茄堿等,。,二、甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程,甾體的微生物轉(zhuǎn)化通常分兩個階段：,第一階段是,生長階段,；,第二階段是,轉(zhuǎn)化階段,大多數(shù),甾體化合物難溶于水,，通常是先把底物溶于,有機溶劑,，如丙酮、乙醇、甲醇，濃度在,2,時對微生物無毒性?；蛴帽砻婊钚詣?(,如吐溫,80),來提高基質(zhì)溶解度。,甾體氧化需要較大的,通氣量,，一般,1,：,0.8,(vvm),。,甾體加入的,速度,隨

7、菌種轉(zhuǎn)化能力和基質(zhì)的性質(zhì)而定，一般濃度約,200,800mg,L,，采用,基質(zhì),的定期加入和連續(xù)加入的辦法來解決基質(zhì)或產(chǎn)物的,毒性,問題。,轉(zhuǎn)化時間隨菌種而異，一般范圍在,12,72h,。,轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物大多不溶于水，所以采用,溶劑萃取法,進(jìn)行提取。,如果產(chǎn)物分泌在發(fā)酵液中，則發(fā)酵濾液采用離子交換樹脂吸附法吸附甾體化合物，洗脫后，減壓濃縮進(jìn)行結(jié)晶。,二、甾體微生物轉(zhuǎn)化方式,進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以利用不同形式的微生物細(xì)胞，如菌體培養(yǎng)物、靜止細(xì)胞懸液、孢子懸液、混合培養(yǎng)物、固定化細(xì)胞或固定化酶等。,靜態(tài)菌體懸液,優(yōu)點：,能自由地改變反應(yīng)液中的基質(zhì)和菌體量的比例，與生長培養(yǎng)法相比一般能縮短反應(yīng)時間，在

8、轉(zhuǎn)化生長物中雜質(zhì)較少，分離提純比較容易等,。,混合培養(yǎng),混合培養(yǎng),進(jìn)行反應(yīng)是將具有,1,，,2,脫氫能力和,11,羥化能力的微生物并用進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)?？?省略抽提,操作。,第四節(jié) 氫化可的松的制備,氫化可的松又稱為皮質(zhì)醇。,化學(xué)名稱為,11,，,17a,，,21,一三羥基孕甾,-4,烯,-1,，,20-,二酮。其結(jié)構(gòu)式為：,氫化可的松為皮質(zhì)激素類藥物，具有,影響糖代謝,、,抗炎,、,抗毒,、,抗休克,及,抗過敏,等作用。主要用于腎上腺皮質(zhì)功能不足和自體免疫性疾??；應(yīng)用于某些感染的綜合治療。,消化性潰瘍病,、,骨質(zhì)疏松癥,、,精神病,、,重癥高血壓,患者忌用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用

9、。由于氫化可的松療效確切，為重要的甾體激素類藥物之一，在國內(nèi)生產(chǎn)的激素類藥物中產(chǎn)量最大。,1,反應(yīng)原理,2,工藝過程,將犁頭霉菌接種到土豆斜面培養(yǎng)基，,28,培養(yǎng),7,9,天，成熟孢子用無菌生理鹽水制成孢子懸液后。種子培養(yǎng)基用,葡萄糖,、,玉米漿,、,硫酸銨,等配制，,pH,值為,5,8,6,3,，接入孢子懸液后，在通氣攪拌下,28,培養(yǎng),28,32h,。待培養(yǎng)液菌濃度達(dá)到,35,以上，無雜菌污染，即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。,將玉米漿、酵母膏、硫酸銨、葡萄糖及水投入發(fā)酵罐中攪拌，用,NaOH,調(diào)整物料,pH,值到,5.7,6.3,，加入,O.03,豆油，滅菌溫度,120,，通入無菌空氣，降溫至,27,28,，接入犁頭霉孢子懸浮液，通氣攪拌發(fā)酵,28,32h,。,用,NaOH,調(diào),pH,值到,5.5,6.0,，投入發(fā)酵液體積,0.15,的,萊氏化合物,S,，氧化,48h,后，取樣做比色試驗檢查反應(yīng)終點。,到達(dá)終點后濾除,菌絲,，濾液用,樹脂,吸附，然后用乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮至適量，冷卻到,0,10,，過濾、干燥得到粗品，收率,46,左右。,以上所得粗品中主要為,體，并混有部分,體，必須進(jìn)行分離精制?？梢詫⒋制芳尤?16,18,倍含,8,甲醇,的二氯乙烷溶液中，,加熱回流,，趁熱過濾，濾液冷卻至,O,5,，,冷凍,、,結(jié)晶,、,過濾,、,干燥,得氫化可的松。,