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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第五章 分子生物學研究方法,分子生物學研究之所以從20世紀中葉開始得到高速開展，其中最主要的原因就是現代分子生物學研究方法、特別

2、是基因操作和基因工程技術的進步。,DNA,分子的切割與連接,核酸分子雜交,凝膠電泳,細胞轉化,核酸序列分析,基因的人工合成,基因操作,基因的定點突變,PCR,擴增等,核心技術,基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。,外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達的過程.,基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力。,本章將在回憶重組DNA技術史上主要事件的根底上，討論DNA操作技術、基因克隆的常用載體系

3、統(tǒng)以及基因的別離與鑒定等三個環(huán)節(jié)。,三大,成就,：,1. 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質根底問題；,Bacterial,Strain,Injection,Results,Living S cells,Living R cells,Heat killed S cells,Heat killed S cells mixed with living R cells,Living S cells in blood sample from dead mouse,capsule,1928,Frederick Griffith,&1944,Oswald

4、,Avery,Transformation of,Streptococcus pneumoniae,1952年,Hershey,和,Chase,證實噬菌體,D,NA,侵染細菌,實驗,2. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半 保存復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；,X-ray source,Crystallized DNA,Rosalind Franklin,Maurice Wilkins,Photographic,film,1953- Franklin & Wilkins,Description of the 3-D structure of DNA,Francis Cr

5、ick & James Watson,Conservative Model,Semiconservative Model,Frank Stahl,Matt Meselson,Parent cell,First replication,Second replication,1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway,3. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法那么和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了

6、遺傳信息的流動和表達。,Jacob and Monod,但是，如果沒有別離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質進行直接的生化分析。,兩大,技術保證：,1.,DNA,的體外切割和連接,1962,年,Arber,發(fā)現限制性核酸內切酶，1967,Gellert,發(fā)現了,DNA,連接酶,DNA ligase covalently links two DNA strands,Restriction,enzyme,Restriction,enzyme,Ligase,Ligase,3,5,3,5,Herbert Boyer,Stanley Cohen,1972,年獲得第一個重組,DNA,分子,

7、Herbert Boyer,重組,DNA,實驗中常見的主要工具酶,酶 類,功 能,限制性核酸內切酶,識別并在特定位點切開,DNA,DNA,連接酶,通過磷酸二酯鍵把兩個或多個,DNA,片段連接成一個,DNA,分子,DNA,聚合酶,I,（大腸桿菌）,按,5,到,3,方向加入新的核苷酸，補平,DNA,雙鏈中的缺口,反轉錄酶,按照,RNA,分子中的堿基序列，根據堿基互補原則合成,DNA,鏈,多核苷酸激酶,把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的,5-OH,末端（進行末端標記實驗或用來進行,DNA,的連接,末端轉移酶,在雙鏈核酸的,3,末端加上多聚單核苷酸,DNA,外切酶,III,從,DNA,鏈的,3,末端逐個切除

8、單核苷酸,噬菌體,DNA,外切酶,從,DNA,鏈的,5,末端逐個切除單核苷酸,堿性磷酸酯酶,切除位于,DNA,鏈,5,或,3,末端的磷酸基團,到目前為止，科學家已經幾乎能隨心所欲地把任何,DNA,分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。,1972 - Paul Berg,Produced first recombinant DNA using,Eco,RI,Eco,RI recognition sites,phage DNA,Eco,RI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The t

9、wo fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。,DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上載體上，并轉入寄主細胞中進行繁殖。,這就是基因克隆，或分子克隆 。,分子克隆的載體-具備自主復制能力的DNA分子vector，如病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體。,從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉化受體。,197

10、0年,Mandel,和,Higa,發(fā)現，大腸桿菌細胞經適量氯化鈣處理后，能有效地吸收,噬菌體,DNA。,1972,年，,Cohen,等人又報道，經氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質粒,DNA。,1973 - Boyer, Cohen & Chang,Transform,E. coli,with recombinant plasmid,Stanley Cohen & Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E. coli,transformed

11、 with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,說明：,1像pSC101這樣的質粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導入寄主細胞；,2像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉移到原核細胞中并實現其功能表達；,3質粒DNA-大腸桿菌細胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用

12、。,2.,DNA,的核苷酸序列分析技術,DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的根底上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術學，這門技術，對于從分子水平上研究基因的結構與功能的關系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。,General process of gene engineering,1. 從生物有機體基因組中，別離出帶有目的基因的DNA片段。,2.,將帶有目的基因的外源,DNA,片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組,DNA,分子。,3. 將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞亦稱寄主細胞并與之一起增殖。,4.,從大量的細胞繁殖群體中，篩選

13、出獲得了重組,DNA,分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。,5.,將目的基因克隆到,表達載體,上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，研究核酸序列與蛋白質功能之間的關系。,5.2,DNA,操作技術,核酸的凝膠電泳,自從瓊脂糖agarose和聚丙烯酰胺polyacrylamide凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小別離DNA的凝膠電泳技術，已經開展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現在通用的許多分子生物學研究方法，如：,DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術根底，受到科學界的高度重視。,根本原理

14、,一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。就是說，電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多，其遷移的速度越快，反之那么較慢。由于在電泳中往往使用無反響活性的穩(wěn)定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數成反比。,摩擦系數是分子大小、極性及介質粘度的函數，因此，根據分子大小的不同、構型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此別離開來。,在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，

15、是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子polyanions，把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。,大分子量的,DNA,移動的慢,小分子量的,DNA,移動的快,電泳緩沖液,陽極,陰極,DNA,加樣孔,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠分辨,DNA,片段的范圍為0.250,kb,之間,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1

16、000個堿基對之間,凝膠類型及濃度,分離,DNA,片段的大小范圍（,bp,）,0.3%,瓊脂糖,50 0001 000,0.7%,瓊脂糖,20 0001 000,1.4%,瓊脂糖,6 000300,4.0%,聚丙烯酰胺,1 000100,10.0%,聚丙烯酰胺,50025,20.0%,聚丙烯酰胺,501,凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的上下影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。,在凝膠電泳中，參加適量溴化乙錠ethidium bromide，簡稱EtBr染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光

17、下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。,在紫外線的照射下結合溴化乙錠的,DNA,分子發(fā)出熒光,稱樣,溶解,加熱,制板,倒膠,電泳操作根本程序,取樣,點樣,電泳,檢測,結果,核酸的分子雜交,將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈,DNA,或,RNA,混合在一起，其相應的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結構。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為,雜種核酸分子,。,不同溫度下,DNA,的構型變化一,DNA/DNA,的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關系，而形成,DNA/RNA

18、,間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。,不同溫度下,DNA,的構型變化二,在大多數核酸雜交反響中，經過凝膠電泳別離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交。,Southern Blotting,E.M. Southern,于1975年首先設計出來的,。,材料：尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜DEAE,步驟：,第一，將別離的核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上核酸印跡轉移,電泳凝膠核酸印跡法、,斑點和狹線印跡法、,菌落和噬菌斑印跡法,第二，是將具有核酸印跡

19、的濾膜與帶有放射性或其它標記的,DNA,或,RNA,探針進行雜交,雜交模式圖,放射自顯影,DNA,印跡轉移,探針雜交,Southern Blotting的過程,1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳別離的DNA,2.通過電泳液的移動轉移膠中的DNA,3.固定膠中的DNA,4.預雜交和雜交放射性和熒光檢測,5.結果檢測,在理想條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害，近年來又開展了熒光法檢測雜交信號的技術，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實驗變得更為平安。,常用的熒光染料：,C,5,、C,3,等,2

20、.Northern blotting諾賽恩RNA印跡技術,是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。,Northern Hybridization,Isolate mRNA,(Different Lengths),Probe with labeled DNA,3.Western blotting韋斯頓蛋白質雜交技術,將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反響。,Step 1. Antibody Recognition,of target protein/antigen,Step

21、2. Secondary Antibody,recognition of primary Ab,Step 3. Color Development,檢測重組體克隆的菌落雜交技術,原位雜交,In situ hybridization,Localization of DNA,Localization of RNA,1.將快速生長中的大腸桿菌置于經低溫0預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹形成原生質球。,所謂細菌轉化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉化DNA的細菌菌株那么被稱為受體菌株。,處于能夠

22、接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。,5.2.3 細菌轉化,步驟：,2.與轉化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞外表的復合物。,3.立即將該體系轉移到42下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。,4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉化基因實現表達、細胞活性恢復,5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中別離轉化子。,基因擴增,聚合酶鏈式反響，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。,DNA,聚合酶,具有在核苷酸底物的存在下，以一條,DNA,鏈為模板催化新鏈的合成,需要具有,3 -OH,的引物,具有 5 到3 方向聚合的能力,通常具有 3到,5,外切酶活性,PC

23、R,技術的原理并不復雜：,一,DNA,體外擴增技術,1.PCR反響體系,1) 根本原理,PCR技術的根本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個根本反響步驟構成：,PCR Cycle - Step 1,- Denaturation Template DNA by Heat (95,o,C),Target Sequence,Target Sequence,PCR,原理示意圖,模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反響作準備；

24、,PCR Cycle - Step 2 ,Temperature is lowered (T,m,) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板,DNA,與引物的退火,(,復性,),：模板,DNA,經加熱變性成單鏈后，溫度降至,55,左右，引物與模板,DNA,單鏈的互補序列配對結合；,PCR Cycle - Step 3 -,At 72,o,C,Taq,DNA polymerase catalyses primer exte

25、nsion as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反響原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保存復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。,End of the 1st PCR Cycle ,Results in two copies of target sequence,Target Sequence,

26、Target Sequence,每完成一個循環(huán)需,2,4,分鐘，,2,3,小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,1,cycle = 2 Amplicon,2,cycle = 4 Amplicon,3,cycle = 8 Amplicon,4,cycle = 16 Amplicon,5,cycle = 32 Amplicon,6,cycle = 64 Amplicon,7

27、,cycle = 128 Amplicon,2.降低反響溫度約50，致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上;,3.將反響混合物的溫度上升到72左右保溫1-數分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3-端參加脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互補鏈,1.首先是將含有待擴增DNA樣品的反響混合物放置在高溫91環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA；,4.重復以上操作,PCR,的過程,DNA,解鏈（變性）,引物與模板,DNA,相結合（退火）,DNA,合成（鏈的延伸）,一次循環(huán)2,二次循環(huán)4,三次循環(huán)8

28、,兩條引物結合位點之間的,DNA,區(qū)段的拷貝數，理論上的最高值應是2,n,PCR,儀,核苷酸序列分析,1968年 華裔科學家吳瑞設計出引物延伸測序策略,Sanger在它的根底之上開展了快數測定DNA的末端終止法,K Mullis,完善了,PCR,擴增,DNA,方法,5.2.5.1. Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-termination sequencing),原理：雙脫氧2，3-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。,不能

29、和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來,AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5,3,添加,DNA polymerase,所有4,dNTPs,其中一種標記的,ddNTP,ddTTP ddCTP ddGTP ddATP,在四個不同的反響管中各只包含一種ddNTP.,AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5,3,T,TCGA,T,TCGAT,T,TCGATT,T,T,C,TCGATTT,C,TCGATTTC,C,TC,G,TCG,A,T,reaction,C reaction,G,reaction,A,reaction,每一管中的復制的序列都停留在,ddNTPs,處,5,反響

30、終止后，四個反響管中的反響混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳別離.,這四個反響管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基.,電泳結構通過顯色指示.,T,C,G,A,3,C,C,T,T,T,A,G,C,T,5,過程：制備ss-DNA與引物退火分為4個反響系統(tǒng)每個系統(tǒng)中參加dNTP其中dATP常帶同位素標記和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反響反響產物變性后電泳凝膠枯燥放射自顯影。,該法亦適合mRNA的序列分析。,GC富集區(qū)常出現“隱影或“停止現象，如在反響中參加dITP脫氧三磷酸次黃嘌呤或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序。,2. DNA定序的一般程序,酶法測序(Sanger) 化學測序法(Ma

31、xam-Gilbert),待測DNA片段 待測DNA片段, ,次克隆 5-末端標記,篩選重組子 鏈別離 限制酶切,模板增殖與純化 , 純化標記的ss-DNA,與引物退火 , 定序反響,定序反響,聚丙烯酰胺凝膠電泳,真空枯燥,放射自顯影,閱讀序列和計算機錄入,核苷酸序列的分析與比較,二. DNA序列測定的自動化,1. DNA測序步驟與自動化,1模板制備 可自動化,2定序反響 可自動化,3凝膠電泳 自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠枯燥，放射自顯影。,4核苷酸序列閱讀與計算機輸入 可自動化,2.自動測序儀,Conney等人于1987年設計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱

32、讀序列。,紅色引物+T反響系統(tǒng)引物+DNA+dNTP+ddTTP,黃色引物+G反響系統(tǒng)引物+DNA+dNTP+ddGTP,綠色引物+A反響系統(tǒng)引物+DNA+dNTP+ddATP,蘭色引物+C反響系統(tǒng)引物+DNA+dNTP+ddCTP,優(yōu)點：i. 四個反響系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間；,ii. 可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需枯燥凝膠和放射自顯影；,iii.可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。,缺點：無法保存原始記錄, 四個反響產物點在一條道上,相互間會發(fā)生干擾, 導致讀序時分辨率下降。,DNA序列分析自動化包括兩個方面的內容，,一是指“分析反響的自動化，,另一方面那么是指“讀片過程

33、的自動化。,5.2.5.3.,雜交測序,自從70年代末期DNA測序技術問世以來，人們已經做了大量重要的改進，但從根本原理上創(chuàng)新的那么只有雜交測序法sequencing by hybridization，SBH一種。它利用一組序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長的靶DNA分子進行雜交，從而測定其核苷酸的序列。,DNA雜交測序實質上包括兩個主要的步驟,首先是將待測定的靶DNA分子同一組其核苷酸順序的寡核苷酸探針進行雜交，然后與那些能夠同靶DNA形成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據此推算出靶DNA的核苷酸序列。,如果將一種核苷酸順序為5-,AGCCTAGCTGAA-3,的12

34、-,mer,的靶,DNA，,與一組完全隨機的8-,mer,寡核苷酸探針混合雜交，在總數為4,8,=65 536種的8-,mer,探針群體中，僅有5種會與靶,DNA,形成完全互補的雙鏈體分子。根據這5種發(fā)生了完全雜交作用的8-,mer,寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關系，便可推算出這段12-,mer,的靶,DNA,分子的核苷酸順序,。,當然，這只是一種理想化狀態(tài)，實際上此種雜交模式要復雜得多，因為那些沒有同靶,DNA,片段完全互補的寡核苷酸探針，也仍然會與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子。,上圖是兩條長度均為17-mer的靶DNA片段I和II的雜交測序結果，兩者僅在第8位堿基有不同，分別為C和T。靶DN

35、A片段I可與18共8段彼此相互重疊的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。根據相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有7個堿基的重疊情況，可以構建出互補的DNA序列。靶DNA片段II的雜交結果說明，橫跨其第8位堿基T的6段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內部的堿基錯配，因此其雜交效率明顯下降；但與第1和第8兩段8-mer寡聚體形成的具有末端G-T錯配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段8-mer寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體分子，證實與片段I相比，它在第8位發(fā)生了由C堿基到T堿基的變化。,基因芯片測序),基因芯片測序流程,5.2.6

36、.1. 凝膠阻滯試驗,凝膠阻滯試驗gel retardation assay，又叫作DNA遷移率變動試驗DNA mobility shift assay，是用于體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質相結合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內朝正電極移動的距離也就相應縮短了。所以，當某個DNA片段與細胞提取物混合之后，假設它在凝膠電泳中的移動距離變小了，就說明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質分子相結合了。,5.2.6,DNA

37、,與蛋白質相互作用研究,凝膠阻滯實驗的根本原理圖,放射性標記的DNA由于與一種細胞蛋白質B結合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現滯后的條帶,A,C,B,放射自顯影,*,*,*,*,凝膠電泳,放射性標記的,DNA,細胞蛋白質提取物,蛋白質與,DNA,結合,*,*,*,*,*,*,B,DNA-,蛋白質結合物電泳遷移緩慢,滯后帶說明DNA與蛋白質結合,5.2.6.2. DNaseI足跡試驗,在DNaseI足跡試驗DNA foot-printing assay過程中，首先將待檢測的雙鏈DNA分子用32P作末端標記，并用限制性內切酶去掉其中的一個末端，得到只有一條鏈的單個末端標記的雙鏈D

38、NA分子，與細胞蛋白質提取物混合。待二者結合之后，再參加少量的DNaseI它可沿著靶DNA作隨機單鏈切割消化DNA分子，并控制酶的用量使之到達平均每條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特異蛋白質，經DNaseI消化之后便會產生出距放射性標記末端1個、2個、3個核苷酸等等一系列前后長度均僅相差一個核苷酸的連續(xù)的DNA片段梯度群體。,如果有一種蛋白質已經結合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么，它就將保護這一區(qū)段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能產生出相應長度的切割條帶。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應于蛋白質結合的部位是沒有放射標記條帶的，出

39、現了一個空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡。,32,p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,參加蛋白質X,參加DNaseI凝膠電泳放射自顯影,1,5,10,A B,足跡,(,a),(,c),(,b),DNaseI,足跡實驗,5.3,基因克隆的主要載體系統(tǒng),1. 至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。,2.至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。,3.至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞,4.平安性,大腸桿菌載體,pBR322,結構圖,載體特點,基因工程載體是一類可供外源,DNA,插入并攜帶重組,DNA,分子進入適當宿主細胞自主復制的,DNA

40、,分子。,質粒DNA及其別離純化,細菌質粒是存在于細胞質中的一類獨立于染色體并能自主復制的遺傳成份。絕大多數的質粒都是由環(huán)形雙鏈,DNA,組成的復制子，也有線性質粒 的報道。,質粒,DNA,分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。,應用質粒作為基因克隆的載體分子，最重要的前提是要獲得大量純化的質粒,DNA,分子。,Ecoli的質粒種類,1) colE1因子大腸桿菌素因子多數不能進行接合轉移DNA，屬高拷貝松弛型。,2) R因子抗藥性因子,可接合轉移DNA，屬低拷貝,嚴緊型， 質粒較大，操作不便,

41、3) F因子性因子,關鍵步驟：寄主細胞的裂解作用是別離質粒DNA實驗操作。,通常參加溶菌酶或十二烷基硫酸鈉SDS來促使大腸桿菌細胞裂解。如果寄主細胞沒有完全裂解，就會顯著降低質粒DNA的回收率。假設細胞裂解反響相當溫和，同時實驗操作又十分謹慎仔細，那么絕大局部的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來，可以用高速離心的方法使之與細胞碎片一起被沉淀除去，得到高純度的質粒DNA。,質粒載體DNA的別離,關鍵：如何使質粒DNA與宿主染色體DNA分開,原理：質粒DNA比染色體DNA 小得多，在DNA抽提過程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質粒DNA仍保持超螺旋構型,變性法： 變性條件可采用加

42、熱煮沸法或堿變性法,上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNA RF型的別離, 質粒DNA的氯霉素擴增使用并不廣泛菌株和載體,5.3.1.1.,氯化銫密度梯度離心法,實驗說明，在細胞裂解及DNA別離的過程中，大分子量的細菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應的線性片段，而質粒DNA那么由于其分子量較小、結構緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。這種差異對質粒DNA的純化是十分有用的。,上清液 加入固體,CsCl,與,EtBr,溶液 室溫下超速離心(45,000,rpm）16,小時 穿孔取出,DNA（320nm）,異丙醇抽提溴乙錠 緩沖液透析除去殘余,CsCl,兩倍體積冷乙醇沉淀,DNA,離心、洗滌、干燥,5.3.

43、1.2. 堿變性法,通過氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質量的質粒DNA，但它操作復雜，需要價格昂貴的氯化銫和超速離心機設備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質，如果操作不慎，不僅會造成環(huán)境污染，還會危及實驗工作人員的身心健康。,實驗觀察發(fā)現，在pH值介于12.012.5的條件下加熱DNA溶液，使染色體DNA變?yōu)閱捂?，而質粒DNA仍保持環(huán)狀結構，當變性條件發(fā)生迅速變化時，前者仍不能復性，而后者又可回復到天然構型。,隨機斷裂產生的線性染色體DNA分子，彼此已經別離的互補鏈之間的復性作用就不會那么迅速而準確，往往聚集形成網狀結構，與變性的蛋白質及RNA一道被離心沉淀下來。,用酒精沉淀

44、法可以收集仍然滯留在上清液中的質粒DNA。,重要的大腸桿菌質粒載體,5.3.2.1.,pSC101,質粒載體,pSC101是一種嚴緊型復制控制的低拷貝數的大腸桿菌質粒載體，平均每個寄主細胞僅有12個拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因tetr。,pSC101質粒不僅具有可插入外源DNA的多個限制性核酸內切酶的單克隆位點，而且還具有四環(huán)素抗性的強選擇記號，因此，它被選為第一個真核基因的克隆載體。當然，這個質粒載體也有其明顯的缺點，它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質粒，從帶有該質粒的寄主細胞中提取pSC101 DNA，其產量就要比其它質粒載體低得多。,5.3.2.2.,ColE1

45、,質粒載體,ColE1質粒屬于松弛型復制控制的多拷貝質粒。在正常生長條件下，當培養(yǎng)基中用于蛋白質合成的氨基酸被耗盡，或是在對數生長末期的細胞培養(yǎng)物中參加氯霉素以抑制蛋白質的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。此時，松弛型復制控制的質粒DNA仍然可以繼續(xù)進行復制達數小時之久，使每個寄主細胞中所累積的ColE1質?？截悢翟黾拥?0003000個之多，質粒DNA大約可占細胞總DNA的50%左右。由此可見，由于質?？截悢蹈?，插入的外源DNA片段的產量也就得到相應的提高。,5.3.2.3.,pBR322,質粒載體,為改進轉化子篩選技術，有必要用人工的方法構建一種既帶有多種抗藥性的

46、強選擇記號、又具有低分子量、高拷貝、以及外源DNA插入不影響復制功能的多種限制性核酸內切酶單切割位點等優(yōu)點的新的質粒載體。,pBR322質粒是由三個不同來源的局部組成的：,第一局部來源于pSF2124質粒轉座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因ampr；,第二局部來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因tertr；,第三局部那么來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點ori。,1,2,3,第一個優(yōu)點：具有較小的分子量，其長度為4,363bp。由于分子量小，不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。,第二個優(yōu)點：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉化子的選擇記號。

47、質粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應，是檢測重組體質粒的一種十分有用的方法。,第三個優(yōu)點：具較高的拷貝數，假設經過氯霉素擴增，每個細胞中可累積10003000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。,pBR322,質粒載體的優(yōu)點,5.3.2.4.,pUC,質粒載體,pUC系列質粒載體包括如下四個局部：,(i)來自pBR322質粒的復制起點ori；,(ii)氨芐青霉素抗性基因ampr，但它的核苷酸序列已經發(fā)生了變化，不再含有原來的限制性核酸內切酶的單識別位點；,(iii)大腸桿菌-半乳糖酶基因lacZ的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ基因；,(iv)位于lac

48、Z基因中的靠近5-端的一段多克隆位點MCS區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。,第一，更小的分子量和更高的拷貝數。在pBR322根底上構建pUC質粒載體時，僅保存下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，使其分子縮小了許多，如pUC8為2 750bp，pUC18為2 686bp。同時，由于rop基因缺失，使pUC8質粒的拷貝數比帶有pMB1或ColE1復制起點的質粒載體都要高得多，不經氯霉素擴增，平均每個細胞即可達500700個拷貝。,第二，可用組織化學方法檢測重組體。pUC8質粒結構中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用。因此，可用X-gal顯色法實現對重組體轉化

49、子的鑒定。,第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端如EcoRI和BamHI的外源DNA片段直接克隆到pUC8質粒載體上。,pUC,質,粒載體優(yōu)點：,5.3.2.5.,pGEM-3Z,質粒,pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子質粒載體，總長度為2,743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ基因。,pGEM-3Z具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。由于這兩個啟動子分別位于lacZ基因中多克隆位點區(qū)的兩側，故假設在反響試管中參加純化的T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉錄出

50、相應的mRNA。質粒載體pGEM-4Z和pGEM-3Z在結構上根本相似，兩者之間的差異僅僅在于SP6和T7這兩個啟動子的位置互換、取向相反而已。,5.3.2.6.,穿梭質粒載體,所謂穿梭質粒載體shuttle plasmid vector，是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體。,早期開展的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒載體，大多是由這兩種細菌的質粒載體融合構建的。例如，pHV14是由pBR322和pC194融合而成，pEB10是由pBR322和pUB110融合而成的。,大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體，含有兩種分別來自大腸桿菌和釀酒

51、酵母的復制起點與選擇標記。它使研究工作者可以自如地在這兩種不同的寄主細胞之間來回轉移基因，并單獨或同時在兩種寄主細胞中研究目的基因的表達活性及其它調節(jié)功能。例如，可將酵母的某種基因亞克隆到穿梭質粒載體上，置于大腸桿菌中進行定點突變處理后，再把突變體基因返回到酵母細胞，以便在天然寄主中觀察研究此種突變的功能效應。,大腸桿菌,-,釀酒酵母穿梭載體,5.3.3,噬菌體載體,噬菌體是一類細菌病毒的總稱，英文名叫作Bacteriophage，來源于希臘文“phagos，如同質粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴增特定的DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。作為細菌寄生物的噬菌體，它可以在脫離寄主細胞的狀

52、態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了寄主細胞，就既不能生長也不能復制，因為大多數的噬菌體只能利用寄主核糖體、合成蛋白質的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進行生長和增殖。,我們將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。而溶源生長周期是指在感染過程中沒有產生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA被整合到寄主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成局部。具有這種溶源周期的噬菌體，叫作溫和噬菌體。,以噬菌體DNA分子作載體，克隆含有目的基因的外源DNA片段，如果沒有導致重要的噬菌體基因失活，那么當這種重組的噬菌體DNA分子感染了寄主細胞之后，插入的外源DNA片段便會隨著噬菌體DNA分子一道增殖。用放射性同位素32P標

53、記的特異性探針作噬菌斑放射自顯影雜交，可以十分敏感地檢測出含有這種重組體DNA分子的噬菌斑即陽性斑點。獲得了陽性噬菌斑之后，我們就可按照類似于制備質粒DNA的方法，別離到大量的重組體噬菌體DNA，實現克隆基因的擴增。,噬菌體可被分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。,噬菌體整個基因組可分為三個局部,左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質。,中段：長約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長所需的序列。,右臂：長約10kb，是調控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調控基因和序列、以及DNA復制起始均在這區(qū)域內。,左右臂包含DNA復制、噬菌體結構蛋白

54、合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。,在噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補的5單鏈突出序列，即通常所說的粘性末端。注入到感染寄主細胞內的噬菌體的線性DNA分子，會迅速地通過粘性末端之間的互補作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5-P和3-OH基團封閉起來，并進一步超盤繞。這種粘性末端結合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點cohesive-end site，粘性末端位點.,5.3.3.1.插入型載體,外源的DNA克隆到插入型載體分子上，就會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應。根

55、據插入失活效應的特異性，插入型載體又可以進一步被分為免疫功能失活和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活兩種亞型。,(1) 免疫功能失活插入型載體。這類載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種限制性核酸內切酶的單切割位點。當外源DNA片段插入到這種位點上時，就會破壞載體所具有的合成功能性阻遏物的能力，阻礙其進入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)學上的差異，為別離重組體分子提供了方便的標志。,(2) -半乳糖甙酶失活插入型載體。許多種載體的基因組中含有大腸桿菌的lacZ區(qū)段，編碼-半乳糖苷酶基因lacZ。由這種載

56、體感染大腸桿菌的lac-指示菌，涂布在補加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色的噬菌斑，但在克隆過程中，如果外源DNA插入到lacz區(qū)段上，阻斷了-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，那么由這種重組體感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成無色的噬菌斑。,5.3.3.2.替換型載體,替換型載體又叫作取代型載體substitution vector是一類在噬菌體根底上改建的、在其中央局部有一個可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。在構建此類載體時，安排在中央可取代片段兩側的多克隆位點是反向重復序列，因此當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA片段便會

57、被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。,“cosmid一詞是由英文“cos site-carrying plasmid縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點的質粒。因此我們說，所謂柯斯質粒其實是一類由人工構建的含有DNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。在柯斯質粒載體pHC79中，除cos位點之外，其兩側還具有與噬菌體包裝有關的DNA短序列。質粒DNA局部那么是一個完整的復制子，包括一個復制起點和兩個抗菌素抗性基因ampr和tetr。很明顯，pHC79柯斯質粒兼具了噬菌體載體和pBR322質粒載體兩方面的優(yōu)點，其克隆能力為3145kb，而且能夠被包裝成為具有感染能力的

58、噬菌體顆粒。,柯斯質粒載體,用限制性內切酶處理質粒和噬菌體，再將,cos,位點拼接到質粒上,再酶切位點將重組質粒線形化，再插入相應,的基因組,DNA,通過含有氨芐青霉素的選擇性培,養(yǎng)平板篩選,存活的細胞可能含有相應,的重組質粒,第一，具有噬菌體的特性?？滤官|粒載體在克隆了適宜長度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效轉染對噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞之后的柯斯質粒DNA分子，能按照噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化。,第二，具有質粒載體的特性?？滤官|粒載體具有質粒復制子，因此能像質粒DNA一樣在寄主細胞內進行復制，并且能在氯霉素作用下，獲得進一步擴增。此外，柯斯質粒載體通

59、常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標記，其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點。,第三，具有高容量的克隆能力?？滤官|粒載體的分子僅具有一個復制起點，一兩個選擇記號和cos位點等三個組成局部，其分子量較小，一般只有57kb左右。因此，可以插入到柯斯質粒載體上并能被包裝成噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，即柯斯質粒載體的克隆極限可達45kb左右。,柯斯質粒載體的特點：,pBluescript是專用的商品名稱，系指由Stratagene公司開展的一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS+/-，如今那么更多地叫作pBluescript KS+/-或pBluescript SK+

60、/-。 SK表示多克隆位點區(qū)的一種取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向轉錄；+/ -表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。f1+起點表示當pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1-起點那么表示當pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA。,5.3.5,pBluescript,噬菌粒載體,(i) 在多克隆位點區(qū)MCS的兩側，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉錄活動；,(ii) 同時具有一個單鏈噬菌體M13或f1的復

61、制起點和一個來自ColE1質粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；,(iii) 編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉化子克隆的選擇標記；,(iv) 含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。,5.4 基因的別離與鑒定,克隆：,多細胞的高等生物個體水平上:表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數個個體組成的群體，所以說，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子monozygotic twins便是屬于同一克隆。,在細胞水平上:指由同一個祖細胞progenitor

62、cell分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。,根本步驟：,(1) 用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；(2) 外源DNA片段與載體分子的體外連接反響；(3) 將人工重組的DNA分子導入它們能夠進行正常復制的寄主細胞；(4) 重組體分子的轉化子克隆的選擇或篩選。,克隆基因的別離,1、應用核酸探針別離克隆目的基因,2、應用mRNA差異顯示技術別離克隆目的基因,3、應用cDNA差示分析法克隆基因,4、應用酵母雙雜交體系克隆基因,5、基因的圖位克隆法,6、DNA微列陣技術進行基因克隆,基因克隆的第一步是要從實驗材料中制備包括“目的基因在內的DNA片段群體，而且這個DNA片段群體必須包容整個基因組的全部序列，DNA片段的大小要適合于基因操作的要求。最簡單的方法是利用限制性核酸內切酶消化供體基因組DNA，并直接將消化產物與載體分子相連接。這個被稱為鳥槍法shot-gun approach的方法最明顯的缺點，是所形成的重組體分子帶有大小不同的插入片段。由于高等真核生物的基因組龐大，按一般載體承受外源DNA插入能力大約為10003000bp計算，能產生幾十萬個大小不同的DNA片段，形成由幾十萬個大小不同的重組體分子組成的克隆群體。要想從如此巨大的群體中，選出帶有目的基因的克隆，顯然是十分費事