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1、,#,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,發(fā)酵的種類,厭氧發(fā)酵,:,微生物體內(nèi)提供能量的氧化還原反應(yīng)，不需要氧的參與，同時形成多種代謝產(chǎn)物的生物化學(xué)過程。,需氧發(fā)酵,:,微生物體內(nèi)進行的氧化還原反應(yīng)需要氧的參與，同時產(chǎn)生若干種與微生物的生長繁殖相關(guān)和不相關(guān)的代謝產(chǎn)物的過程。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,1,頁,/,共,23,頁,微生物菌體發(fā)酵,微生物酶制劑與酶調(diào)節(jié)劑發(fā)酵,微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵,微生物轉(zhuǎn)化,工程菌發(fā)酵,動、植物細(xì)胞培養(yǎng),發(fā)酵產(chǎn)品類型,酵母發(fā)酵、冬蟲夏草,蛋白酶、淀粉酶,氨基酸、蛋白質(zhì)、抗生素,乙酸桿菌將乙醇氧化為乙酸

2、,基因工程菌的發(fā)酵,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,2,頁,/,共,23,頁,發(fā)酵培養(yǎng)方法,一、表面發(fā)酵培養(yǎng),二、液體深層發(fā)酵培養(yǎng),菌種,孢子制備,種子制備,發(fā)酵,發(fā)酵液預(yù)處理,提取精制,成品檢驗,成品包裝,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,3,頁,/,共,23,頁,菌種,菌種來源：,1,、重組菌株,2,、凍存菌株,3,、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的菌株,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,4,頁,/,共,23,頁,菌種的篩選,1,、將轉(zhuǎn)化菌或凍存菌,37,度培養(yǎng),46h,后，將菌鋪于含抗生素的,LB,瓊脂平板上，于,37,度過夜。,2,、挑選若干單一菌落分別放入試管進行培

3、養(yǎng)，移種，（擴增），誘導(dǎo)，收集。,3,、電泳觀察比較各樣品的目的蛋白表達(dá)，挑選表達(dá)最好的保存，留做菌種。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,5,頁,/,共,23,頁,發(fā)酵過程,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,6,頁,/,共,23,頁,接種,菌株名,101,eAg,TP03,培養(yǎng)基,LB,LB,LB,抗生素,卡那霉素,K,氨芐西林納,AMP,氨芐,+,卡那,AMP+K,接種量,510ul/,瓶,1015ul/,瓶,1020ul/,瓶,轉(zhuǎn)速,120130r,130140r,140150r,溫度,2830,度,2830,度,2830,度,時間,過夜,

4、過夜,過夜,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,7,頁,/,共,23,頁,擴增控制,菌株名,101,TP03,擴前,OD600,對數(shù)分長期,對數(shù)分長期,擴增量,1,擴,2,1,擴,2,轉(zhuǎn)速,170180r,180190r,溫度,37,度,2832,度,時間,4080min,60120min,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,8,頁,/,共,23,頁,誘導(dǎo)控制,菌株名,101,TP03,eAg,誘前,OD,600,0.81.0,0.70.9,0.60.8,誘導(dǎo)方式,IPTG,IPTG,溫度,誘導(dǎo)量,0.4mM/L,0.4mM/L,42,度,轉(zhuǎn)速,140150r,130140

5、r,140+-,溫度,37,度,28,度,42,度,時間,4h,5h,4h,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,9,頁,/,共,23,頁,收菌控制,菌株名,101,TP03,eAg,收菌,OD,600,1.61.8,1.11.3,1.21.4,洗菌液,10mM T,1mM E pH 8.0,10mM PB,1mM S pH 7.2,50mM PB 5mM E pH7.0,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,10,頁,/,共,23,頁,對數(shù)生長期,在液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌的生長通常包括遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。,對數(shù)生長期（,OD600=0.51.0,）,1.0

6、 OD,600,=2.5x,10,10,個細(xì)胞,/ml,此時的種子能很快適應(yīng)環(huán)境，生長繁殖快；可大大縮短在發(fā)酵罐中的調(diào)整期，縮短在發(fā)酵罐中的非產(chǎn)物合成時間，提高的發(fā)酵罐利用率，節(jié)省動力消耗。,此時細(xì)菌的生長是最活躍的，蛋白的合成速度也最快；此時加入,IPTG,進行誘導(dǎo)，通常可獲得較高表達(dá)效率。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,11,頁,/,共,23,頁,抗生素,硫酸卡那霉素 ：,2530ug/ml,氨芐西林鈉,:50100ug/ml,卡那霉素的抗藥性機制：,被一些相同細(xì)菌的氨基磷酸轉(zhuǎn)移酶（,APH,）所失活。來自轉(zhuǎn)座子,Tn903,的,APH,（,3,）,-I,和來自轉(zhuǎn)座子,Tn

7、5,的,APH,（,3,）,-II,基因編碼的,APH,通過將,ATP,的,-,磷酸轉(zhuǎn)移至,3,位上的羥基而造成卡那霉素的失活。,氨芐青霉素的抗藥性機制：,-,內(nèi)酰胺酶從分子克隆中使用的高拷貝載體中表達(dá)時，大量的酶會分泌至培養(yǎng)基中。足夠的酶水解掉周圍培養(yǎng)基中的抗菌素，形成一圈敏感菌可以生長的保護區(qū)，從而導(dǎo)致由于未轉(zhuǎn)化菌形成的衛(wèi)星克隆,.,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,12,頁,/,共,23,頁,收獲緩沖液,在培養(yǎng)基和收獲緩沖液中加入蛋白酶抑制劑可以提高表達(dá)量。,15mmol/L,的,EDTA,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,13,頁,/,共,23,頁,接種量,指移

8、入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。,接種量大小與菌種特性、種子質(zhì)量和發(fā)酵條件有關(guān)。,接種量大小與該菌生長繁殖的速度有關(guān)。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,14,頁,/,共,23,頁,生長溫度,大腸桿菌在室溫的生長速度比,37,度慢,4,倍。,最低溫度為,10.,大腸桿菌生長最適溫度為,37,，最高溫度為,45,。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,15,頁,/,共,23,頁,IPTG,帶,異丙基,-D-,硫代半乳糖苷（,IPTG,）,誘導(dǎo)啟動子的質(zhì)粒表達(dá)外源蛋白的總量可以達(dá)到全菌蛋白的,30%,以上。,IPTG,的濃度對表達(dá)水平影響非常大。,0.01-5.0mm

9、ol/L,的范圍,有些蛋白，必須誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒慢轉(zhuǎn)錄，才不致于使細(xì)菌的生物合成系統(tǒng)過載。,IPTG,濃度過低，可能會使誘導(dǎo)效應(yīng)降低；但其濃度過高，則可能會因?qū)λ拗骶膹娏叶拘宰饔枚种屏思?xì)菌自身的生長繁殖，從而使目的蛋白的產(chǎn)量降低。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,16,頁,/,共,23,頁,溫度誘導(dǎo),影響在大腸桿菌中獲得高水平表達(dá)的最重要因素可能是生長溫度，能過實驗確定最佳溫度，是表達(dá)外源蛋白的關(guān)鍵。,雖然在,15-42,度之間都獲得過成功表達(dá)，但表達(dá)某一種特定蛋白質(zhì)的最佳溫度范圍剛可能很窄，只有,24,度。,外源蛋白質(zhì)表達(dá)時，在較高溫度下有利于表達(dá)包涵體，在較低溫度下有利于表達(dá)

10、可溶性蛋白質(zhì)。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,17,頁,/,共,23,頁,溶 氧,微生物,呼吸臨界氧濃度,溫度,mM/L,mg/L,大腸肝菌,37.8,0.0082,0.26,15,0.0031,0.10,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,18,頁,/,共,23,頁,控制溶氧方法比較,方法,作用于,投資,運轉(zhuǎn)成本,效果,對生產(chǎn)作用,氣體成分,C*,中到低,高,高,好,攪拌轉(zhuǎn)數(shù),K,La,高,低,高,好,通氣速率,K,La,中,低,低,罐壓,C*,中到高,低,中,好,溫度需求,C*,低,低,變化,不一定,表面活性劑,K,La,低,低,變化,不一定,注：,C*,：氧飽和

11、度,K,La,：氧傳遞系數(shù),接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,19,頁,/,共,23,頁,培養(yǎng)基,LB,培養(yǎng)基：,NaCL 5,克,蛋白胨,10,克,酵母粉,5,克,補水至,1000ml,NaOH,調(diào),pH,至,7.07.2,提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物,.,主要成分包括碳源如,:,葡萄糖,淀粉,;,氮源如硫磺銨、玉米漿；無機鹽和微量元素；前體和誘導(dǎo)物等。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,20,頁,/,共,23,頁,pH,適宜大多數(shù)生物生長的,pH,范圍是,36,，最適,pH,的變化范圍為,0.51.0,。,生物

12、生長的上限一般在,pH8.5,左右，超過此上限，微生物將無法忍受而自溶，下限以酵母菌為最低，約,pH2.5,左右。,大腸桿菌適宜,pH,為,6.5,7.5,，最適,pH,為,7.2,7.4,。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,21,頁,/,共,23,頁,時間,誘導(dǎo)時間長短也是影響重組蛋白表達(dá)的一個重要因素。誘導(dǎo)時間過短，目的蛋白表達(dá)量較少；但如果時間過長，則目的蛋白可能會被細(xì)菌的蛋白酶降解。,接種,擴增,誘導(dǎo),收菌,返回,開始,結(jié)束,第,22,頁,/,共,23,頁,再見,如有雷同 純屬抄襲,感謝大家抽出寶貴的時間,敬請各位對本片提出寶貴意見！,移動用戶發(fā)短信,HG,至,2008,！,聯(lián)通用戶發(fā)短信,XQ,至,2008,！,小靈通用戶發(fā)短信,SM,至,2008,！,趕快行動吧，有驚喜大獎等您拿喲,!,感謝北京新創(chuàng)公司對活動獎品的支持！,策劃：小火,北京新創(chuàng)影視有限公司,電話：,010-12345678,第,23,頁,/,共,23,頁,