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1、單擊此處編輯母版標題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級,,第三級,,第四級,,第五級,,,*,第九章,,發(fā) 酵 工 藝 控 制,,第一節(jié),,溫度對發(fā)酵的影響及其控制,,一、 發(fā)酵熱,------,發(fā)酵過程中釋放出的凈熱量。,[ J / m,3,· h ],,,或,,,------,單位體積的發(fā)酵液在單位時間內釋放出來的凈熱量。,,,,Q,發(fā)酵,= Q,生物,,+ Q,攪拌,,- Q,蒸發(fā),,- Q,顯,,– Q,輻射,,,1,、生物熱 （,Q,生物,）,◇,產生菌在生長繁殖過程中本身會產生大量的熱，此為生物熱。,◇,,這種熱的主要來源是培養(yǎng)基中的碳水化合物、脂肪和蛋白質等的分解。,◇,

2、,釋放出的能量部分用來合成高能化合物,(ATP),,部分用來合成產物，其余的則以熱的形式散發(fā)出來,,影響生物熱的因素：,,,菌株特性 培養(yǎng)基成分和濃度 發(fā)酵時期,◇,菌株對營養(yǎng)物質利用的速率越大，培養(yǎng)基成分越豐富，生物熱也就越大。,,◇,發(fā)酵旺盛期的生物熱大于其它時間的生物熱 （四環(huán)素,20-50,小時； 蘇云金桿菌,10-18,小時）,,2,、攪拌熱 （,Q,攪拌,）,,攪拌帶動發(fā)酵液作機械運動，造成液體之間、液體和設備之間的摩擦，產生數(shù)量可觀的熱。,,攪拌熱與攪拌軸功率有關，可用下式計算：,,,,Q = P ×860 ×4186.8 (J / h),,,P ---,攪拌軸功率

3、，,kW,,860×4186.8 ---,機械能轉變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ斄浚?J /kW.h,影響因素：,,攪拌器的類型及攪拌速度,,3,、蒸發(fā)熱 （,Q,蒸發(fā),),空氣進入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進行熱交換，同時必然會引起水分的蒸發(fā)，蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。,4,、顯熱 （,Q,顯,）,排出氣體所帶的熱,,5,、輻射熱 （,Q,輻射,）,◇,因,罐,內外的溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。,,,◇,輻射熱的大小決定于罐內外的溫差,,1,）菌種特性,,2,）培養(yǎng)基 （成分及配比）,,3,）發(fā)酵階段,,4,）攪拌類型及攪拌速度,,5,）通氣速度 （影響,Q,蒸發(fā)和,Q,顯）,,6,）

4、罐內外的溫差,影響發(fā)酵溫度的因素：,,由于,Q,生物、,Q,蒸發(fā)、,Q,顯在發(fā)酵過程中隨時間而變化，因此發(fā)酵熱在整個發(fā)酵過程中也隨時間變化。為了使發(fā)酵在一定溫度下進行，必須采取措施加以控制。,,二、發(fā)酵熱的測定,方法一：,,,通過測定一定時間內冷卻水的流量和冷卻水的進出口溫度，由下式求得這段時間內的發(fā)酵熱：,,,,Q,發(fā)酵,= GC (t,2,- t,1,) / V (J / m,3,· h),,G ---,冷卻水流量，,kg/h,,C ---,水的,比熱，,J/kg · ℃,,t,1,、,t,2,---,進、出口的冷卻水溫度，℃,,,V ----,發(fā)酵液體積 ，,m,3,,方法二：

5、,,,通過罐溫的自動控制，先使罐溫達到恒定，再關閉自動控制裝置測得溫度隨時間上升的速率,S,,按下式可求得發(fā)酵熱 ：,,,,Q,發(fā)酵,,= K · S,S ---,溫度隨時間上升的速率，,℃,/h,,K ---,總參數(shù)，代表系統(tǒng)的熱容量，,J/L·℃,,K,值可由下式,求得：,,,,K = (,MCp,),發(fā)酵液,,+ (,MCp,),容器,,+ (,MCp,),附件,M —,以每升發(fā)酵液計的發(fā)酵液、容器、附件的重量,,Cp —,代表各自的比熱,一般微生物發(fā)酵過程中的最大發(fā)酵熱約為,,,4.186× (3000,～,8000) kJ / m,3,· h,,三、溫度與發(fā)酵的關系,1

6、,、溫度對微生物生長的影響,,◇,嗜,冷菌在,溫度低于,20℃,下生長速率最大,,嗜中溫菌在,30-35℃,左右生長速率最大,,嗜熱菌在,50℃,以上生長速率最大,◇,曲線形狀相似；當溫度增加,10℃,，生長速率大致增長一倍。,,,◇,當溫度超過最適生長溫度，生長速率隨溫度增加而迅速下降,,,微生物產物的生成與微生物的生長一樣受溫度的影響，但適于生長和適于產物合成的溫度不一定相同；必須分別考察，在考慮培養(yǎng)溫度時需要采用折中的辦法。,,溫度也會影響微生物培養(yǎng)的其它重要方面，如細胞得率系數(shù)等。,當溫度超過一定數(shù)值，細胞得率降低。主要原因是生命活動維持方面的需求增加,,2,、溫度對發(fā)酵的影響,●,,

7、溫度對發(fā)酵的影響是各種因素綜合表現(xiàn)的結果,,從酶動力學來看，溫度升高，反應速率加大，代謝加快，生產期提前；但因酶本身很易因熱而失去活性，溫度越高，酶的失活也越快，表現(xiàn)在菌體易于衰老，發(fā)酵周期縮短，影響產物的最終產量。,1,）,溫度影響產物合成的速率及產量,●,,溫度除了直接影響發(fā)酵過程中各種反應速率外，還通過改變發(fā)酵液的物理性質，間接影響菌的生物合成。,,2,）溫度可能會影響終產物的質量,,,例如：,,蘇云金桿菌的發(fā)酵，一般在,30-31℃,進行，這樣形成的晶體毒力強。若發(fā)酵溫度提高到,37℃,以上，雖然菌體生長繁殖較快，最終含菌數(shù)也較高，但生物毒力較低，直接影響產品的質量。,3,）溫度還可能

8、影響生物合成的方向,,,例如：,,四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時能產生金霉素。在低于,30℃,下，該菌合成金霉素能力較強；溫度提高，合成四環(huán)素的比例提高；在溫度達到,35℃,時，則只產生四環(huán)素，金霉素的合成停止,,四、最適溫度的選擇,◇,,最,適,溫度是指在該溫度下最適于菌的生長或產物的形成。,◇,,在發(fā)酵的整個周期內僅選一個溫度不一定好。,,因為最適合菌生長的溫度不一定適合產物的合成。,,例如：,,,青霉素產生菌的最適生長溫度是,30℃,，而最適于青霉素合成的溫度是,20℃,。,,,發(fā)酵過程中，在生長初期抗生素還未開始合成，菌絲還未長濃，這時的溫度應適于微生物的生長；到抗生素分泌期，菌絲已長到一

9、定濃度，積累抗生素是重點考慮，此時應滿足生物合成的最適溫度。,,溫度的選擇還要參考其它發(fā)酵條件靈活掌握,,●,,通氣條件,,,在通氣條件差的情況下，最適的發(fā)酵溫度應比在正常良好通氣條件下低一些；這是由于在較低的溫度下，氧溶解度相應大些，菌的生長速率相應小些，從而彌補可能因通氣不足而造成的代謝異常。,,●,,培養(yǎng)基成分和濃度,,,在使用較稀薄或較易利用的培養(yǎng)基時，提高培養(yǎng)溫度則養(yǎng)料往往過早耗竭，導致菌絲過早自溶，使抗生素產量降低。,,利用計算機模擬確定最佳發(fā)酵條件，正逐步得到推廣應用。,,,●,根據(jù)模擬計算機對發(fā)酵溫度最佳點的計算，得到青霉素發(fā)酵的最適溫度是：,,起初,5h,維持在,30℃,；,

10、隨后降到,25℃,，,培養(yǎng),35h,；,再降到,20℃,培養(yǎng),85h,；,最后回升到,25℃,培養(yǎng),40h,放,罐。,,●,,采用這種變溫培養(yǎng)，比在,25℃,恒溫培養(yǎng)青霉素產量提高,15%,。,,五、溫度的控制,方法：,,,罐壁調溫,,夾層調溫,,罐內調溫,,,,第二節(jié),,pH,對發(fā)酵的影響及其控制,,一、,pH,對菌體生長和產物合成的影響,1,）,pH,影響酶的活性,,,,當,pH,抑制菌體中某些酶的活性時，使菌體的新陳代謝受阻,2,）,pH,影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，從而改變細胞膜的滲透性，影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收及代謝產物的排泄，因此影響代謝的正常進行。,,4,）,pH,不同，往

11、往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例發(fā)生改變。,3,）影響培養(yǎng)基某些組分和中間產物的離解，從而影響微生物對這些物質的利用。,●,例如：黑曲霉在,pH2-3,時，發(fā)酵產生檸檬酸，在,pH,接近中性時，則產生草酸。,,●,又如：丙酮丁醇發(fā)酵中，發(fā)酵后期,pH,為,4.3-5.3,時積累丙酮丁醇，,pH,升高則丙酮丁醇產量減少，而丁酸、乙酸含量增加。,,二、發(fā)酵過程中,pH,的變化及影響,pH,變化的因素,1,、發(fā)酵過程中,pH,的變化,1,）生長階段,,,,,pH,有,上升或下降趨勢（相對于接種后起始,pH,而言）,,,如：,利福霉素,B,發(fā)酵起始,pH,為,中性，但生長初期由于菌體產

12、生的蛋白酶水解蛋白胨而生成銨離子，使,pH,上升至堿性；接著，隨著銨離子的利用及葡萄糖利用過程中產生的有機酸使,pH,下降到酸性范圍。,,2,）生產階段,,在生產階段，,pH,趨于穩(wěn)定，維持在最適,,產物合成的范圍,3,）自溶階段,,,,菌絲自溶階段，隨著基質的耗盡，菌體蛋白酶的活,,躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使,pH,上升，此時菌,,絲趨于自溶而代謝活動終止。,,2,、引起發(fā)酵液中,pH,變化的因素,◇,發(fā)酵過程中,pH,的,變化取決于微生物的種類、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件。,,,◇,在菌體代謝過程中，菌體本身有建成其生長最適,pH,的,能力，但外界條件發(fā)生較大變化時，,pH,將會不斷波動。,

13、,引起,pH,下降的因素：,,,（凡是導致酸性物質生成或釋放及堿性物質消耗的發(fā)酵，其,pH,都會下降）,1,）培養(yǎng)基中碳氮比例不當，碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加之溶解氧不足，致使有機酸大量積累而,pH,下降。,2,）消泡油加得過多,3,）生理酸性物質的存在，氨被利用，,pH,下降,,引起,pH,上升的因素：,,,（凡是導致堿性物質生成或釋放及酸性物質消耗的發(fā)酵，其,pH,都會下降）,1,）培養(yǎng)基中碳氮比例不當，氮源過多，氨基氮釋放，使,pH,上升。,2,）生理堿性物質存在,3,）中間補料中氨水或尿素等堿性物質的加入過多使,pH,上升。,,三、最適,pH,的選擇,1,、微生物生

14、長和產物合成的最適,pH,,●,大多數(shù)細菌生長的最適,pH6.3,～,7.5,,●,霉菌最適生長,pH3,～,6,●,放線菌生長最適,,,pH7,～,8,,,,,微生物生長階段和產物合成階段的最適,pH,往往不同，這不僅與菌種特性有關，也取決于產物的化學性質。,例如：,,一般產生堿性抗生素的，如灰色鏈霉菌生產鏈霉素、紅色鏈霉菌產生紅霉素，其合成產物的最適,pH,為,6.8-7.3,，中性偏堿；而產生兩性抗生素的，如金色鏈霉菌生產金霉素，其合成產物的最適,pH,為,5.9-6.3,,弱酸性。,,2,、最適,pH,的選擇,◇,,,選擇合適,pH,值的準則是有利于菌的生長和產物的合成，以獲得較高的產

15、量,◇,,生長期和生產期的,pH,不一定相同,,例如利福霉素,B,發(fā)酵的最佳,pH,方案,是：生長期,pH,保持在,6.5,，生產期,pH,為,7.0,。,,四、,pH,的控制,1,、在基礎培養(yǎng)基配方中考慮到維持,pH,的需要,,,例如加入,CaCO,3,，,使用緩沖液等,2,、通過補加酸、堿來調節(jié)控制,3,、通過中間補料來控制,,,例如可以根據(jù)生產菌的代謝需要用改變加糖速率來控制,pH,,也可通過中間補加尿素或硫酸銨等調節(jié),,第三節(jié),,基質濃度對發(fā)酵的影響及其控制,,一、基質濃度對發(fā)酵的影響,1,、,,對生長的影響,,可用,Monod,方程來描述基質濃度與生長速率的關系,,? = ?,max

16、,S,,Ks + S,?,---,比生長速率,,?,max,---,最大比生長速率,,S ---,基質濃度,,K,s,---,飽和常數(shù),,（?,= 0.5?,max,時的基質濃度）,,●,,S,＞＞,Ks,，,?,趨向于?,max,,,●,,然而，由于代謝產物或基質濃度過濃可能會導,,致抑制作用，出現(xiàn)比生長速率下降,,,●,當濃度超過某值，還可能導致細胞脫水,,2,、 對產物形成的影響,●,基,質,濃度對產物形成的影響類似于生長,,●,在一定范圍內，基質濃度大，通常產物產量高,,●,過濃，使菌體生長過于旺盛，發(fā)酵液非常粘稠，,,傳質狀況差，對產物的合成不利,例如：,,,以乙醇為碳源發(fā)酵谷氨

17、酸，當乙醇濃度達,35g/L,，,可延長谷氨酸生產時間，提高產量；但在更高濃度下，菌體生長受到抑制，產量降低,,二、 基,質,濃度的控制,——,補料控制,,為解除基質過濃的抑制、產物的反饋抑制和葡萄糖效應，以及避免在分批發(fā)酵中因一次性投糖（料）過多造成細胞大量生長，耗氧過多而供氧不足的狀況，通常采用中間補料工藝。,,補料的,方式：,,,,1,）于預定時間一次性補料或間歇補料,,,2,）連續(xù)恒速補料,,,3,）變速補料（指數(shù)流加,）,,,為有效地進行中間補料，須選擇恰當?shù)姆答伩刂茀?shù)；掌握這些參數(shù)與微生物生長、基質利用和產物形成之間的關系。,,反饋控制操作分,直接法,和,間接法,1,）直接法：,

18、◇,,直接以限制性營養(yǎng)物質濃度作為反饋控制參數(shù),,,例如碳源、氮源、碳氮比,◇,,由于缺乏直接測量重要參數(shù)的傳感器，該法的使用受到,,一定限制。,,,目前只有少數(shù)基質，如甲醇、乙醇、葡萄糖等可直接測量,,2,）間接法,,,,以溶氧、呼吸商、代謝物濃度等作為反饋控制參數(shù),,第四節(jié),,溶氧濃度對發(fā)酵的影響及控制,,一、溶氧測定的意義,1,、溶氧作為發(fā)酵中氧是否足夠的度量，了解菌對氧利用的規(guī)律。,2,、溶氧作為發(fā)酵異常情況的指示,?,,溶氧一反往常，在較短的時間內跌到零附近，且跌零后長時間不回升，這很可能說明污染了好氣菌,,?,,如發(fā)酵過程中溶氧迅速回升，發(fā)酵液變稀，則很可能是污染了噬菌體,3,、溶

19、氧作為發(fā)酵中間控制的手段之一,?,補糖后，溶氧出現(xiàn)明顯下降的趨勢,,?,因此可利用溶氧作為參數(shù)來控制加料的次數(shù)、流加速度和加入量,4,、溶氧作為考查設備、工藝條件對氧供需與產物形成影響的指標之一,,二、適當溶解氧的選擇,◆,在好氧微生物反應中，一般取,[DO],＞,[DO],cri,,以,保證反應的正常進行,。,臨界氧濃度是不影響菌的呼吸所允許的最低氧濃度。,◆,,氧的滿足度,——,實際溶解氧濃度與臨界氧濃度之比。,,合適溶解氧選擇的原則：,,如果要使菌體快速生長繁殖（如發(fā)酵前期），則應達到臨界氧濃度；如果要促進產物的合成，則應根據(jù)生產的目的不同，使溶解氧控制在最適濃度（不同的滿足度）,例如：

20、,,黃色短桿菌可生產多種氨基酸 ，但要求的氧濃度可能不同,?,,對谷氨酸和天門冬氨酸的生產，當溶解氧濃度低于臨界氧濃度時，氨基酸產量下降，也就是說要求氧的滿足度,= 1,?,但對于苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸的生產，則在低于臨界氧濃度時獲得最大生產能力，它們的最佳氧濃度分別為臨界氧濃度的,0.55,、,0.66,、,0.85,。,,三、發(fā)酵液中溶解氧的控制,,培養(yǎng)液中溶解氧濃度的任何變化都是供需平衡的結果，因此調節(jié)發(fā)酵液中溶氧量不外乎從供、需兩方面考慮、著手,,G/,? =,K,L,a,· V · (C* - C,L,),G ---,溶解于液體中的氧量，,mmol,,? ---,氣,-,液接觸時

21、間，,h,,V ---,培養(yǎng)液的體積，,L,,C,L,,---,液相中氧的濃度，,mmol,/L,,C* ---,與氣相中氧分壓相平衡的液相中的氧飽和濃度，,mmol,/L,,K,L,---,以濃度差表示推動力的傳質系數(shù)（氧傳質系數(shù)），,m/h,,a---,比表面積（即單位體積的液體中所含的氣,-,液接觸面積），,m,2,/m,3,,,1,、供氧方面,1,）增加空氣中氧的含量，使氧分壓增加，進行富氧通氣,,富氧,空氣制備：,,深冷分離法 （可得,99.9%),,,吸附分離法 （吸去,N,2,和,CO,2,),,,膜分離法 （有機物高分子膜；,30%,）,,成本高，易爆炸 ；但關鍵時期使用

22、也是明智的,2,）提高罐壓,?,但同時會增加,CO,2,的溶解度（比氧氣高,30,倍），影響,pH,、,可能會影響菌的代謝。,,?,一般,0.3,～,1,kg /cm,2,3,）改變通氣速率,4,）增加攪拌速度,,2,、需,氧,方面,,rO,2,=Q,O2,·X,1,）調整養(yǎng)料的濃度,2,）調節(jié)控制溫度,Note,：,溶氧濃度必須與其它參數(shù)配合起來分析,,第五節(jié),,泡沫對發(fā)酵的影響及控制,,一、泡沫對發(fā)酵的影響,1,）降低了發(fā)酵罐的裝液系數(shù),,2,）增加了菌群的非均一性,,3,）增加了污染雜菌的機會,,4,）導致產物的損失,,二、起泡機理,?,當氣體通入純水的氣,-,液界面時，氣泡只能維持幾分

23、之一秒，其穩(wěn)定性等于零，這是由于能學上的不穩(wěn)定性和圍繞氣泡的液膜強度很低所致。,,?,,當氣體通入起泡劑液體，因這些物質具有某些親水基團和疏水基團，分子帶極性的一端向著水溶液，而非極性一端向著空氣，并力圖在表面作定向排列，增加了泡沫的機械強度。,,?,培養(yǎng)基中蛋白質以及微生物菌體等為起泡物質，具有穩(wěn)定泡沫的作用,,?,培養(yǎng)基的成分、溫度、酸堿度、濃度及泡沫的表面積對泡沫的穩(wěn)定性都有一定影響,,三、泡沫的消長規(guī)律及影響因素,1,、消長規(guī)律,◇,發(fā)酵過程中泡沫的消長表現(xiàn)出一定的規(guī)律,,,◇,但不同微生物的不同發(fā)酵通常不同,,2,、影響泡沫的因素,1,）與通氣量、通氣速度和攪拌速度等有關,2,）與所

24、用培養(yǎng)基的成分有關,玉米漿、蛋白胨、花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、糖蜜是主要的發(fā)泡因素；且起泡能力隨品種、產地、貯藏和加工條件而不同。,3,）與培養(yǎng)基的滅菌方法、滅菌溫度和時間有關,例如：,糖蜜培養(yǎng)基從,110℃,升高到,130℃,（皆為,30,分鐘），發(fā)泡系數(shù)增加一倍,,四、泡沫的控制,一） 機械消泡,內部：耙式、梳齒式、渦輪式,,外部：離心式、碟片式,優(yōu)點：,,不需引入外界物質（如消泡劑），可減少培養(yǎng)液性質復雜化程度，便于產物的提取。,,缺點：,,不能從根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素,,二） 化學消泡,1,、消泡機理,1,）降低泡沫的機械強度，使泡沫破裂,2,）降低液膜的表面黏度，使液膜的液體

25、流失，導致泡沫破裂,當泡沫表層存在著由極性的表面活性物質形成的雙電層時，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機械強度；或加入某些具有強極性的物質與發(fā)泡劑爭奪膜上的空間，降低液膜強度，使泡沫破裂。,當泡沫的液膜具有較大的表面黏度時，可以加入某些分子內聚力較小的物質，以降低液膜黏度,,2,、消泡劑選擇的原則：,① 對發(fā)酵過程無毒，對人、畜無害，不影響生物合成。,,② 消泡作用迅速，效果高和持久性能好。,,③ 能耐高壓蒸汽滅菌而不變性，在滅菌溫度下對設備無腐蝕性或不形成腐蝕性產物。,,④ 不影響以后的提煉過程。,,⑤ 不干擾分析系統(tǒng)，如溶解氧、,pH,測定儀的探頭。,,⑥ 消泡劑的來

26、源多，價格低，添加裝置簡單。,,⑦ 最好還能做到不影響氧的傳遞。,,1,）天然油脂,3,、消泡劑的種類,常用豆油、玉米油、米糠油,（能兼作碳源）,2,）聚醚類,3),高級醇類,主要是十八醇,4,）硅酮類,?,主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物,,?,結構通式為,:,(,CH,3,),3,Si[,Si,(CH,3,),2,],nSi,(CH,3,),3,,,?,單獨使用效果差，常與分散劑（微晶二氧化硅）一起使用,,3,、消泡劑的使用,1,）分散,◇,消沫劑的消沫效果與使用方式很有關系。,,◇,消沫劑加到發(fā)酵罐中能否起作用取決于它的擴散能力。,,◇,消沫劑的分散可借助于機械方法，也可加入某種分散劑將消

27、沫劑乳化成細小液滴。,2,）加量,,聚醚類,0.03,～,0.035%,3),加入時機,有的可先加入培養(yǎng)基；有的則在泡沫初起或大起時加入,,第六節(jié),,雜菌與噬菌體的防治,,,◇,純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。,,,◇,所謂染菌，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入了有礙生產的其它微生物。,,,◇,幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都有可能遭遇雜菌或噬菌體的污染。染菌的結果，輕者影響產量或質量，重者可能導致倒罐，甚至停產，造成原料、人力和設備動力的浪費。,,防止雜菌和噬菌體污染是保證發(fā)酵正常進行的關鍵之一,,一、雜菌污染的原因與防治,,1,、 從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因,,,1,）從染菌的時間分析,●

28、,早期（如接種后,12,h,或,24,h,），,除了種子帶菌外，主要是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底。,,●,相反，中、后期染菌則可能與中間補料、設備滲漏以及操作不合理等有關，也可能是空氣過濾器不嚴所致。,2,）從污染的雜菌類型分析,●,污染耐熱的芽孢桿菌，多數(shù)是因培養(yǎng)基滅菌不徹底或設備存在死角所致；,,●,污染無芽孢桿菌、球菌等不耐熱菌，可能是從蒸汽的冷凝水中帶來的，或空氣系統(tǒng)不嚴造成。,3,）從發(fā)酵罐及批次分析,大批發(fā)酵罐染菌是指整個工廠各個產品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)雜菌現(xiàn)象，而且染的是同一種菌，主要是空氣過濾器除菌不凈，空氣帶菌而造成的。,個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌，較多地是由于設備問題而造成的。如閥門的滲漏或

29、罐體破損，特別是蛇形管的穿孔，有時不易察覺。有時設備破損引起的染菌會出現(xiàn)每批染菌時間前移現(xiàn)象。,個別發(fā)酵罐偶然染菌的原因最為復雜，各種染菌途徑都有可能引起。,,,根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設備問題（設備滲漏、管道不嚴、設備死角）和空氣問題（過濾器不嚴、過濾器失效、過濾器受潮）為主，種子（二級種子染菌）次之，而培養(yǎng)基消毒不透的情況較少。,,2,、 防止染菌要點,（,1,）空氣系統(tǒng),提高空壓機進口空氣的潔凈度、防止空氣帶油、水及過濾器失效。,,如提高空壓機吸氣口位置并加強壓縮前的過濾；防止空氣冷卻器漏水而進入空氣系統(tǒng)；在空氣過濾器滅菌時要防止沖翻介質而短路，防止烤焦介質或著火；裝填纖維介質

30、時要壓緊；操作中要防止空氣的壓力劇變和流速激增等。,,,（,2,）設備,●,發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免形成“死角”。與物料、空氣、下水道連接的閥門皆需保證嚴密度。,,,●,,用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。,,,●,,連消設備的連消塔要簡單，易拆裝清理，操作時蒸汽能與物料均勻混合，并易控溫度；維持罐在料液輸送時培養(yǎng)基在罐中能均勻地緩慢上升，不走短路。,,（,3,）工藝操作,,① 空罐準備,,,,放罐后應進行全面檢查和清洗。要清理罐內殘渣，去除罐壁污垢，清除空氣分布管、溫度計套管等處堆積的污垢及罐內的“死角”。要防止端面軸封漏氣、攪拌添料箱及閥門滲漏等。蛇管和夾

31、層要按設計規(guī)定的壓力定期試壓?？障麜r應先將罐內空氣排盡，保持蒸汽暢通，閥門、管道均要徹底滅菌。,② 實罐滅菌,,,,配制培養(yǎng)基時要防止原料結塊。配料罐出口應有篩板過濾器（篩孔直徑≤,0.5mm,），,以防塊狀物及異物進入罐內。滅菌時，要保證各路進氣暢通及罐內料液翻騰激烈，控制好溫度與壓力，嚴防泡沫冒頂及料液倒流到空氣系統(tǒng)中。,,,③ 連消,,,,料液進入連消塔前需先預熱。滅菌過程中，料液溫度及其在維持罐停留的時間都必須符合要求，確保滅菌徹底。當冷卻管開放冷水時，防止因突然冷卻造成負壓而吸入外界空氣。為確保滅菌溫度穩(wěn)定，連消必須實現(xiàn)自動控制。,,④ 補料,,,,補入發(fā)酵罐內的料液一定要保證無菌。

32、,⑤ 種子,,,,有關種子操作的制度要嚴格遵守；搖瓶瓶塞要確保嚴密。,,⑥ 無菌試驗,,,,無菌試驗要嚴格取樣操作，力求減少誤差。應同時用肉湯和雙碟作對照，以便迅速作出判斷。當發(fā)現(xiàn)染菌時，要通過分辨菌型來探索菌源，并對雜菌做耐熱試驗考察。如果懷疑種子罐染菌，則種子不能輕率進發(fā)酵罐。,,,3,、 無菌檢查與染菌的處理,,為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過程中污染雜菌，在接種前后、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中分別進行無菌檢查，以便及時發(fā)現(xiàn)染菌，并在染菌后及時進行必要處理是很重要的。,,（,1,）無菌檢查,,◆,,染菌通常通過,3,個途徑發(fā)現(xiàn)：無菌試驗、發(fā)酵液直接鏡檢、發(fā)酵液的生化分析。其中無菌試驗是判斷染菌的主要

33、依據(jù)。,,,,◆,,無菌試驗方法有雙碟培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、肉湯培養(yǎng)等，其中以雙碟和肉湯培養(yǎng)為主。,,（,2,）染菌的判斷,,◆,以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應為主，鏡檢為輔。,,,◆,每,8h,一次的無菌檢查，至少用,2,只酚紅肉湯及,1,只雙碟同時取樣。,,,◆,無菌試驗時，如果肉湯連續(xù),3,次變色（紅→黃）或產生渾濁，或雙碟培養(yǎng)連續(xù),3,次有雜菌菌落，即判斷為染菌。,,,（,3,）染菌率的統(tǒng)計,,,以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準，染菌罐批（次）應包括染菌重消的重復染菌批（次）在內。整個發(fā)酵周期中，無論前期或后期染菌，均作“染菌”論處。,發(fā)酵（罐）染菌批（次）,,,總投罐批（次）,染菌率（,%,）,=,,?

34、,100%,,,（,4,）染菌的處理,,,發(fā)現(xiàn)染菌后，應立即根據(jù)染菌的種類及產生菌的菌齡等具體情況分別進行處理。除據(jù)染菌時間及危害程度對污染罐進行挽救或處理外，對有關設備也應進行處理。,◆,發(fā)酵中后期染菌或前期染菌輕微而發(fā)現(xiàn)較晚時，可加入適當?shù)臍⒕鷦┗蚩股?；或把高單位的后期發(fā)酵液壓一部分到染菌罐中，抑制雜菌生長速度；或者降低罐溫，減緩雜菌繁殖速度。,◆,種子罐染菌后，種子不能再接入發(fā)酵罐中，這時可用備用種子接種。如無備用種子，則可選一適當培養(yǎng)齡的發(fā)酵罐培養(yǎng)物作種子，即生產上所說的“倒種”。,◆,發(fā)酵罐前期染菌后，如培養(yǎng)基中,C,、,N,含量尚高，則可重新滅菌，接種后再運轉；若染的雜菌危害性較

35、大，則放掉部分料液，補入新料液，重新滅菌、接種。,,二、噬菌體污染的防治,,在國內外，發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的危害是一個普遍的問題。對于丙酮丁醇、氨基酸、酶制劑和抗生素等發(fā)酵都有噬菌體的危害，所帶來的經(jīng)濟損失是相當驚人的。,,1,、噬菌體的污染源,,◆,噬菌體廣泛地存在于適合宿主生存的泥土、污水和空氣中；,,,◆,發(fā)酵工業(yè)生產菌的噬菌體可以從異常發(fā)酵液和工廠環(huán)境中分離出來，溶源性細菌也混雜在工廠周圍環(huán)境的細菌中；,,,◆,一個新的發(fā)酵工廠往往在投產不久便會出現(xiàn)噬菌體污染；,,,◆,研究認為，當有許多細菌存在時，相應的噬菌體就會馬上出現(xiàn)，其濃度在自然條件下很容易增高。,,,◆,,工廠本身的排放物有時也

36、給重復污染提供了噬菌體來源。生產過程中發(fā)酵氣體排出，可以帶有大量的生產菌。,,,,◆,在生產罐污染有少量噬菌體（尚可進行生產）時，噬菌體也被排到環(huán)境中，造成惡性循環(huán)。,,,,◆,廢棄的發(fā)酵液處理不當可以成為難以對付的污染源。,,2,、 噬菌體污染與發(fā)酵異常,,,噬菌體污染后的情況因發(fā)酵工業(yè)的種類、污染的噬菌體特性、污染時間、感染復度（即培養(yǎng)物內的噬菌體與細菌的比率）、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵罐內的物理和化學條件不同而異。即使同樣的噬菌體并不一定引起同樣的異常發(fā)酵情況。,,一般來說，噬菌體污染引起的異常發(fā)酵有以下表現(xiàn)：,,,（,1,）污染較輕，或在發(fā)酵末期污染，則使發(fā)酵過程減慢或降低發(fā)酵產率。也有的行業(yè)

37、在這種情況下產率反而增高；,,,,（,2,）在細菌對數(shù)生長期污染，而且污染量大，就會造成細菌溶解，發(fā)酵終止。,,,噬菌體污染后可以觀察到糖消耗減慢，,pH,異常變化，產氣減少，發(fā)酵稀薄，繼之活的生產菌減少。通過測定可過濾性、傳染性、宿主特異性、溶菌斑形成能力和電鏡觀察來鑒別異常發(fā)酵中的噬菌體。,,,3,、噬菌體污染的防治,,發(fā)酵工業(yè)生產中噬菌體污染是一個復雜的問題，雖然至今還沒有完全滿意地解決這一問題，但采取一些措施來防治噬菌體的污染，也有一定的成效。,（,1,）防止噬菌體入侵和蔓延,,發(fā)酵工廠生產菌的噬菌體廣泛存在于其周圍環(huán)境中，為了防止噬菌體的污染，保持周圍環(huán)境的清潔是必要的，所有設備和設

38、施如發(fā)酵罐、管道系統(tǒng)等要進行滅菌處理。,,妥善地保藏菌種、對原料和水進行無菌處理、對工廠空氣、種子、發(fā)酵液、泥土和污水的噬菌體濃度進行日常檢查，即使空氣中噬菌體濃度極低時，也要進行檢測。,,,噴灑氯化物或殺藻胺,(,benzalkonium,chloride),氣溶膠能殺滅活噬菌體，紫外線照射用作一種額外的保護措施。漂白粉,(0.2%),、陽離子表面活性劑（如季銨鹽,0.01%,?,0.1%,）和福爾馬林（,1%,）均可單獨使用，如果必要也可聯(lián)合使用。,,（,2,）選用抗噬菌體突變株,抗噬菌體突變株應具備以下特征：,,,1,）對以前出現(xiàn)過的噬菌體都具有抗性；,,2,）為非溶源菌；,,3,）具有

39、與原始菌株相當或更高的生產能力；,,4,）沒有回復突變成噬菌體敏感株的能力。,,對付噬菌體污染的一個措施就是分離抗正在污染的噬菌體的細菌突變株，用于發(fā)酵生產上。,,（,3,）使用抑制噬菌體復制的化學藥物,,藥物必須具有以下性質：,,,① 選擇性抑制噬菌體而不影響宿主菌生長或發(fā)酵過程；,,② 在食品發(fā)酵工業(yè)上要求該化學物質不影響產品質量；,,③ 用量要小，要經(jīng)濟。,,◆,,有些噬菌體感染需要雙價陽離子,(Ca,2+,、,Mg,2+,),吸附或,DNA,注射才能進行。使用絡合劑可獲得較好的效果，如,0.2-0.3%,多磷酸鈉、,0.1-0.2%,肌醇六磷酸,(,phytic,acid),、,0.2

40、-0.5%,檸檬酸或草酸等可抑制乳糖發(fā)酵短桿菌的噬菌體。,◆,,非離子去污劑如聚乙烯二醇酯酸、聚羥乙烯烷基醚、吐溫,20,、吐溫,60,均能明顯地抑制噬菌體吸附、復制，或引起流行性感染。,◆,,有些抗生素能抑制多種噬菌體，氯霉素（,1,?,g/ml,）,對丙酮丁醇乳酸棒桿菌的,HM,噬菌體有良好的抑制作用，對宿主菌無影響。,,第 七 節(jié),,發(fā) 酵 終 點 的 判 斷,,不同類型的發(fā)酵，要達到的目標不同，因而發(fā)酵終點的判斷標準也不同,,1,） 一般對發(fā)酵及原材料成本占整個生產成本主要部分,,的發(fā)酵產品，主要追求提高：,,,產率 （,kg / m,3,·h),,,得率 （,Kg,產物,/ kg,基

41、,質）,,發(fā)酵系數(shù) （,kg,產物,/,罐容積,m,3,·,發(fā)酵周期,h,）,2,）如下游提取、精制占主要部分，則除了要求高的,產率,和,,發(fā)酵系數(shù),外，還要求高的,產物濃度,。,,t,T,—,培養(yǎng)放罐、檢修的工作時間,,t,D,,—,打料、滅菌時間,,t,L,,—,停滯期,分批培養(yǎng)的生產率,,發(fā)酵總的生產周期：,,,,t = 1/,μ,m,lnX,f,/X,0,+,t,T,+,t,L,+,t,D,t,T,—,培養(yǎng)放罐、檢修的工作時間,,t,D,,—,打料、滅菌時間,,t,L,,—,停滯期,,X,0,和,X,f,——,起始和終了時的細胞濃度；,,μ,m,——,最大比生長速率,,◆,,如要提高總的生產率則有必要縮短發(fā)酵周期,。,,,就是要在產物合成速率較低時放罐，延長發(fā)酵雖然略能提高產物濃度，但生產率下降，且消耗每千瓦電力，每噸冷卻水所得產量也下跌，成本提高。,◆,,放罐時間對下游工序有很大影響,,放罐時間過早，會殘留過多的養(yǎng)分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等，對提取不利，這些物質能增加乳化作用或干擾樹脂的交換；,,放罐時間太晚，菌絲自溶，不僅會延長過濾時間還會使一些不穩(wěn)定的抗生素單位下跌，擾亂提取工段的作業(yè)計劃。,,