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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Developmental Biology-Spring 2007,Slide,*,Developmental Biology-Spring 2007,Portions 1996-2007 jlh,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third

2、level,Fourth level,Fifth level,發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù),常用發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)簡介,顯微鏡技術(shù),(,成像,imaging);,組織切片技術(shù),(,經(jīng)典解剖形態(tài)學(xué),morphology);,生化分子生物學(xué),;,原位雜交技術(shù),(,in situ,hybridization);,顯微注射,;,報告基因技術(shù),;,細(xì)胞標(biāo)記技術(shù),;,顯微鏡技術(shù),目的：觀察胚胎個體,分類：,光學(xué),(optical),顯微鏡,:,體視顯微鏡,:,組織分離用,熒光顯微鏡,：,顯微鏡技術(shù),激光共聚焦顯微鏡,(laser confocal),：,熒光標(biāo)記，對胚胎或細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或,mRNA,的分布進(jìn)行定

3、性或定量研究；,圖像采集的效果很好,；細(xì)胞或組織的三維重塑,(reconstructing),組織切片技術(shù),目的：觀察胚胎的內(nèi)部組織學(xué)結(jié)構(gòu),分類：,石蠟組織切片：,石蠟包埋，切片機切片,冷凍切片：,低溫包埋劑包埋，低溫切片機切片，對樣品中,核酸的保存較好，但切片的質(zhì)量差。,分子生物學(xué)技術(shù),目的：檢測目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時期或特定組織中的表達(dá),分類：,Polymerase chain reaction(PCR):,DNA amplification,Real-time quantitative PCR:,RNA,定量,RT-PCR/Northern blotting:,mRNA,expre

4、ssion,Western blotting:,protein,expression,免疫共沉淀,(Co-IP):,protein-protein interaction,Northern Blotting Analysis,Southern Blotting Analysis,Real-time PCR,儀,原位雜交技術(shù),目的：檢測某一特定基因,mRNA,在某胚胎和組織中的分布情況,分類：,放射性標(biāo)記探針：放射自顯影,非放射性標(biāo)記探針：,地高辛,(DIG)-,免疫組化,熒光素,-,熒光免疫組化,(FISH),原位探測基因表達(dá),Gene expressing guiding developme

5、nt,When and where particular genes are active,Intact embryos or sections of embryos,In situ hybrid:probes-radioactive isotope,fluorescence tag or an enzyme,Dectection:autoradiography,fluorescence microscope,enzyme-substrate reaction,原位探測基因表達(dá),原位探測基因表達(dá),Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 i

6、n the amphibian egg.,In situ hybridization with a radioactive probe.(yellow signals),原位探測基因表達(dá),利用原位雜交技術(shù)研究基因表達(dá)的時空譜,mRNA,的檢測,FISH,探測基因表達(dá),報道基因,(reporter gene),技術(shù),目的：,用于啟動子,/,增強子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測的基因,(,報道基因,),與待研究的表達(dá)調(diào)控序列串聯(lián)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入胚胎體內(nèi)，分析報道基因產(chǎn)物的表達(dá)來研究目的片斷的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。,常用報道基因分類：,綠色熒光蛋白,(GFP):,分布用熒光顯微鏡觀察,lac,Z,基因

7、,:,編碼,-,半乳糖苷酶,用特異底物顯色研究其產(chǎn)物分布,熒光素酶,(luciferase):,常用體外基因表達(dá)活性分析，近年開始體內(nèi)研究,啟動子活性檢測法,表達(dá)載體的構(gòu)建：,利用大分子間的相互作用克隆新的基因,鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的,DNA,序列,分離靶蛋白質(zhì)，（可采用,gel-shift assay),克隆靶蛋白的表達(dá)基因。,利用,DNA,與蛋白質(zhì)間的相互作用,分離時空特異性表達(dá)基因的方法,利用蛋白質(zhì)之間的相互作用,酵母雙雜交法,顯微注射及細(xì)胞標(biāo)記技術(shù),目的：,將外源,DNA,、,RNA,或標(biāo)記物等導(dǎo)入早期胚胎細(xì)胞中，如運用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)對胚胎早期卵裂球分化命運圖譜的研究。在小鼠和果蠅中常用于

8、轉(zhuǎn)基因分析。,細(xì)胞標(biāo)記物分類：,早期：,活體染料如尼羅藍(lán)或中性紅，不能標(biāo)記胚胎內(nèi)部組織,現(xiàn)在：細(xì)胞外,-,親脂性熒光染料如,DiI/Dio,，不適于組織切片,細(xì)胞內(nèi),-,熒光標(biāo)記葡聚糖和,HRP,，需顯微注射，通過熒光顯微鏡或組織化學(xué)方法進(jìn)行定位。,示蹤基因：,GFP,和,LacZ,基因,染料細(xì)胞標(biāo)記,熒光細(xì)胞標(biāo)記,細(xì)胞移植,DNA/,蛋白芯片,目的：,高通量篩選不同胚胎細(xì)胞或組織中基因,/,蛋白表達(dá)圖譜，獲得不同時期或組織差異表達(dá)的基因或蛋白。,DNA chip,Protein chip,microRNA chip,分類：,應(yīng)用,DNA microarrays,研究基因表達(dá),High out

9、put screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development,基因組時代：人類基因組計劃,控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測方法,后基因組時代功能基因組時代,空間結(jié)構(gòu)？,胞內(nèi)分布及靶位？,影響器官？,基因類型？,底物？,影響途徑？,發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),發(fā)育生物學(xué)基本任務(wù)之一：,研究基因在胚胎發(fā)育中的作用,正向遺傳學(xué)技術(shù)：,大規(guī)模隨機誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個體，然后再尋找突變的基因。,1.,大規(guī)模誘變篩選,;,2.,插入誘變篩選,;,3.,突變基因的克隆,

10、;,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,自然群體中的突變體；,化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基乙脲乙亞硝基脲,(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea,ENU),；,外源,DNA,插入法，如,DNA,注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等；,X,射線或,r,射線照射,獲得突變體的方法,自發(fā)突變,(spontaneous mutation),Recessive mutation(,純合體狀態(tài),)/Dominant,(,雜合體狀態(tài),),/semi-dominant,自發(fā)突變,(spontaneouse mutation),se

11、mi-dominant mutation(,半顯性突變,),斑馬魚上,ENU,化學(xué)突變研究的成就,(1996),從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,化學(xué)誘變法,大規(guī)模誘變篩選,通過射線或化學(xué)誘變劑處理父本個體，在其生殖系細(xì)胞中產(chǎn)生隨機突變，然后與,wild-type,母本個體雜交，,F1,個體中可能攜帶有基因突變。,F1,與野生型，,F2(50%,雜合突變體,),群體內(nèi)雜交，,F3(25%),可出現(xiàn),純合突變,個體，發(fā)育異常,DNA,插入誘變法,反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起的突變的鑒定,DNA,插入誘變法,大規(guī)模誘變篩選,突變后的,表型,改變：,致死性,功能喪失,：最常見。突變后的蛋白質(zhì)比野生型

12、活性差；某一蛋白質(zhì)完全失活的突變?yōu)闊o效突變,(null mutation),功能獲得,：如某些受體突變后活化,插入誘變篩選,利用,轉(zhuǎn)座子,(transposon),或病毒載體做誘變劑。果蠅中為,P-,因子，可以隨即插入基因組中，并可以在基因組中移動，包括特殊序列和轉(zhuǎn)座酶，后代生殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶就會誘導(dǎo),P-,因子在基因中隨即轉(zhuǎn)座造成基因突變。,突變基因的克隆,突變體獲得后，克隆引起該突變的基因,插入突變：,利用,P-,因子序列作為探針，從突變體文庫中篩選出含,P-,因子的克隆，從而確定其插入點及被阻斷的基因。,化學(xué)誘變或射線突變：定位克隆,(positional cloning),根據(jù)目的基因

13、在染色體上的位置進(jìn)行基因分離的。通過分析突變位點與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定突變基因的染色體位置。常用的分子標(biāo)記包括單核苷酸多態(tài)性,(SNPs),。,Positional cloning:,1,),確定突變基因的染色體定位,2),獲取該片斷的基因組序列：數(shù)據(jù)庫,3),生物信息學(xué)確定該片段可能含有的基因，結(jié)合其可能的功能和該突變體的表型，確定候選基因,4),實驗驗證：功能異常，野生型,rescue,RNAi,發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),反向遺傳學(xué)技術(shù)：,通過功能喪失,(loss of function),或功能獲得,(gain of function),實驗，研究胚胎個體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。

14、,基因修飾,1.,基因敲除,;,2.,條件基因敲除,;,3.,轉(zhuǎn)基因,;,Constructing knockout mice,獲得攜帶有特定基因突變個體的技術(shù)，研究基因在發(fā)育中功能的重要方法。,1),構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu),2),重組基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞,(ES),3),注射,ES,入胚胎中以獲得雜合性小鼠,4),小鼠雜交獲得純合體小鼠并進(jìn)行表型分析。,Conditional knockout,僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時期失活。,Cre-,lox,系統(tǒng),1)Cre,編碼一種重組酶，可識別并結(jié)合位點并切除位于兩個,LoxP,位點之間的序列。,2),兩個品系：靶基因兩側(cè)都加入,LoxP

15、,位點,;,轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動子控制的,cre,基因,3),小鼠雜交，,cre,基因會在特異性組織中表達(dá)，切除靶基因，使之失活。,Transgenic technique,1),將外源基因注射到受精卵的細(xì)胞核中，缺點是無法控制外源基因的插入情況，只能通過后代檢查,DNA,。,2),將外源基因轉(zhuǎn)化到,ES,中，同,gene knockout,3),小鼠雜交。,發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),反向遺傳學(xué)技術(shù)：,通過抑制性因子抑制目的基因的功能,1.RNA,干擾,;,2.,嗎啉代寡聚核苷酸,(MO):,利用反義寡聚核苷酸抑制特定,mRNA(5-UTR),的翻譯而阻斷目的基因功能的方法。主要應(yīng)用在斑馬魚和爪蟾研究中

16、，但現(xiàn)在也用于,miRNA,研究中。,RNAi,技術(shù),1),雙鏈,RNA,抑制含其同源序列基因的表達(dá)，抑制基因表達(dá)的新方法,2),線蟲中：直接導(dǎo)入,dsRNA;,脊椎動物中,siRNA(21-23 nt),發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),反向遺傳學(xué)技術(shù)：,其它手段：,1.,顯性抑制,(dominant negative):,通過過量表達(dá)顯性抑制型蛋白,(,是通過某種修飾或加工，可以抑制野生型蛋白功能的缺陷型蛋白,),以阻斷內(nèi)源蛋白的活性，研究其功能的方法。如將某些信號傳導(dǎo)受體的膜內(nèi)區(qū)域缺失等。,2.,基因捕獲,(gene trap),與增強子捕獲,(enhancer trap):,是一種報道基因轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用于獲得在某些組織中特異性表達(dá)的基因。如報道基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，如附近有內(nèi)源性增強子，就可啟動報道基因的啟動子激活。,