細(xì)胞培養(yǎng)污染簡(jiǎn)介
《細(xì)胞培養(yǎng)污染簡(jiǎn)介》由會(huì)員分享,可在線(xiàn)閱讀,更多相關(guān)《細(xì)胞培養(yǎng)污染簡(jiǎn)介(29頁(yè)珍藏版)》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣
2、式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10
3、/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),2021/10/10,*,細(xì)胞培養(yǎng)中污染物的預(yù)防與清除,中科院上海生化細(xì)胞所,2016,Jan,22-24,2021/10/10,1,培訓(xùn)班目的:,提高各生物資源保藏庫(kù)在資源保藏、評(píng)價(jià)方面的科技創(chuàng)新與服務(wù)能力。,資源保藏、評(píng)價(jià),創(chuàng)新能力,服務(wù)能力,(科學(xué)院對(duì)我們的要求),2021/10/10,2,十八大明確提出要“實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展戰(zhàn)略,強(qiáng)調(diào)科技創(chuàng)新是提高社會(huì)生產(chǎn)力和綜合國(guó)力的戰(zhàn)略支撐,必須擺在國(guó)家發(fā)展全局的核心位置”。,我國(guó)科技服務(wù)業(yè)已經(jīng)具備一定的發(fā)展基礎(chǔ),但是與英、美等發(fā)達(dá)國(guó)家相比,我國(guó)的科技服務(wù)
4、業(yè)產(chǎn)值及其占,GDP,比重較低,,2011,年度實(shí)現(xiàn)科技服務(wù)增加值不足,7000,億元,占,GDP,比重約為,1.4%,。,2014,年,10,月,國(guó)務(wù)院印發(fā),關(guān)于加快科技服務(wù)業(yè)發(fā)展的若干意見(jiàn),(國(guó)發(fā),201449,號(hào)),這是國(guó)務(wù)院,首次,對(duì),科技服務(wù)業(yè),發(fā)展作出的全面部署。,用創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)科技服務(wù)業(yè)的發(fā)展,(國(guó)家對(duì)我們的要求),2021/10/10,3,細(xì)胞資源為生物醫(yī)藥基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐和保障,細(xì)胞資源保藏和技術(shù)研發(fā),人類(lèi)遺傳資源庫(kù),基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)細(xì)胞庫(kù),國(guó)家發(fā)展和安全戰(zhàn)略,2021/10/10,4,一,,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。細(xì)胞庫(kù)的功能包括資源,保藏,能力、資源,利用,能力和資源,
5、開(kāi)發(fā),能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細(xì)胞保藏單位的關(guān)鍵抓手,也是推動(dòng)細(xì)胞庫(kù)向科技服務(wù)業(yè),轉(zhuǎn)移重心,的必經(jīng)之路。,二,,保證細(xì)胞株不受污染是細(xì)胞庫(kù)保藏能力的關(guān)鍵性標(biāo)志,也是其他能力提升的基礎(chǔ)。,2021/10/10,5,一,,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。由細(xì)胞庫(kù)(,Cell Bank,)負(fù)責(zé)保存細(xì)胞系。,細(xì)胞庫(kù),技術(shù)咨詢(xún),對(duì)外供應(yīng),鑒定檢測(cè),文檔管理,細(xì)胞培養(yǎng),質(zhì)量控制,保藏、評(píng)價(jià),開(kāi)放、共享,技術(shù)服務(wù),培訓(xùn)科普,2021/10/10,6,一,,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。負(fù)責(zé)保存細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)應(yīng)當(dāng)開(kāi)發(fā)、承擔(dān)更多的功能,提升服務(wù)科技、服務(wù)社會(huì)的能力,產(chǎn)生更高的服務(wù)業(yè)產(chǎn)值。,細(xì)胞庫(kù),技術(shù)咨詢(xún),對(duì)外供應(yīng),鑒
6、定檢測(cè),文檔管理,細(xì)胞培養(yǎng),質(zhì)量控制,保藏、評(píng)價(jià),開(kāi)放、共享,技術(shù)服務(wù),培訓(xùn)科普,拓寬收集渠道,提升保藏特色,瞄準(zhǔn)科技發(fā)展前沿提升利用開(kāi)發(fā)水平,2021/10/10,7,一,,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。保存細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)其功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開(kāi)發(fā)能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細(xì)胞保藏單位的關(guān)鍵抓手。,中科院細(xì)胞庫(kù),堅(jiān)持國(guó)際接軌的細(xì)胞保藏技術(shù)水平,積極吸引國(guó)內(nèi)有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞系進(jìn)入細(xì)胞庫(kù)保藏,逐步形成自己的特色。,堅(jiān)持用戶(hù)至上的服務(wù)態(tài)度,全方位為用戶(hù)著想為用戶(hù)服務(wù),積極推動(dòng)庫(kù)內(nèi)細(xì)胞資源的利用。,密切關(guān)注國(guó)際細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展前沿,主動(dòng)與醫(yī)院等單位合作,拓寬細(xì)胞資源的種類(lèi),為我國(guó)細(xì)胞
7、生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展做好準(zhǔn)備。,我們的目標(biāo),2021/10/10,8,二,污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。保證細(xì)胞株不受污染是細(xì)胞庫(kù)保藏能力的關(guān)鍵性標(biāo)志,也是其他能力提升的基礎(chǔ),1,,細(xì)菌污染,2,,真菌污染,3,,支原體污染,4,,內(nèi)毒素污染,5,,細(xì)胞間交叉污染,2021/10/10,9,1,,細(xì)菌污染。,實(shí)驗(yàn)室中因操作不慎而引起的污染,即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了預(yù)防劑量的抗菌素也會(huì)產(chǎn)生。最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌,如枯草桿菌,以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌,其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后,會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁,,pH,改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀(guān)察無(wú)多少改變,只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。
8、污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變,胞內(nèi)顆粒增多、增粗,最后變圓脫落死亡,造成實(shí)驗(yàn)失敗和細(xì)胞株,(,系,),丟失。,2021/10/10,10,2,,真菌污染,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中較為常見(jiàn),尤其在南方霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易產(chǎn)生。最常見(jiàn)的真菌有:煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后,可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色小點(diǎn),培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁;倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中,有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。,2021/10/10,11,3,,支原體污染,3.1,,支原體污染是目前實(shí)驗(yàn)室中最為常見(jiàn)的污染細(xì)胞的原核生物。,
9、因支原體屬于直徑介于,0.2,左右的最小原核生物,形態(tài)易變,故極易通過(guò)濾膜而逃過(guò)培養(yǎng)液的過(guò)濾除菌步驟。在細(xì)胞培養(yǎng)液中,支原體可達(dá)到,10,7,-10,8,CFU/mL,(,CFU=Colony Forming Unit,,支原體濃度測(cè)量單位)而不使培養(yǎng)液混濁及影響細(xì)胞生長(zhǎng)。多種支原體對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生任何病變效應(yīng),使得細(xì)胞污染不易被察覺(jué)。據(jù)報(bào)道,目前世界上有,30-50%,的細(xì)胞株已受支原體污染。但是支原體對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)的影響甚大,胚胎干細(xì)胞受支原體污染形態(tài)、生長(zhǎng)速度等均出現(xiàn)改變。,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞很多,需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時(shí)候,即應(yīng)懷疑支原體污染。,2021/1
10、0/10,12,由于多數(shù)細(xì)胞受支原體污染后無(wú)明顯變化或略有變化,若不及時(shí)處理,將產(chǎn)生交叉污染。另外,支原體會(huì)改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能等一系列特征,因此盡管很多受支原體污染的細(xì)胞其形態(tài)看不出變化,但對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分子生物學(xué)分析時(shí),其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)不準(zhǔn)確。為此建議各實(shí)驗(yàn)室定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查。,可污染細(xì)胞的支原體種類(lèi)較多,主要有,Mycoplasma orale,M.hyorhinis,M.arginini,和,Acholeplasma laidlawii,。目前已發(fā)現(xiàn)的支原體超過(guò),100,種,這就是單一的檢測(cè)方法有時(shí)會(huì)失敗的原因之一。我們建議至少選擇,2,種方法來(lái)檢測(cè)支原體。,2021/10/1
11、0,13,3.2,,常用支原體檢測(cè)方法,3.2.1,,肉湯培養(yǎng)基檢測(cè)法。醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定使用。,3.2.2,,間接染色法檢測(cè)支原體,用待檢測(cè)的細(xì)胞培液培養(yǎng),Vero,細(xì)胞,然后用顯微鏡觀(guān)察是否有支原體感染。,Vero,細(xì)胞來(lái)源于正常的成年非洲綠猴腎組織,由,Y.Yasumura,和,Y.Kawakita,于,1962,年在日本,Chiba,大學(xué)分離得到。,Vero,細(xì)胞是非整倍體,可在培養(yǎng)液中無(wú)限生長(zhǎng),常用來(lái)生產(chǎn)疫苗,檢測(cè)支原體和細(xì)菌外毒素等。細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體可用,Hoechst33258,或,DAPI,染色后觀(guān)察到。由于支原體含有,DNA,,染色后在細(xì)胞表面,培養(yǎng)基中及培養(yǎng)皿表面呈現(xiàn)出熒光小
12、點(diǎn)。,2021/10/10,14,Vero,細(xì)胞,DAPI,染色熒光照片,(400),。,A,,感染支原體的,Vero,細(xì)胞。藍(lán)色卵圓形熒光物質(zhì)為,Vero,細(xì)胞核,其周?chē){(lán)色熒光小點(diǎn)為支原體,(,箭頭,),;,B,,未感染支原體的陰性對(duì)照,Vero,細(xì)胞;,C,,加入待檢培養(yǎng)液的,Vero,細(xì)胞,(,未感染支原體,),。,A,B,C,間接染色法檢測(cè)支原體,2021/10/10,15,3.2.2,,,PCR,法檢測(cè)支原體,許多支原體檢測(cè)方法不僅用時(shí)長(zhǎng)而且復(fù)雜,有的方法僅限于檢測(cè)有限種類(lèi)的支原體。,PCR,檢測(cè)法靈敏度高,特異性強(qiáng),只用一天時(shí)間即可快速檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體,是一種檢測(cè)支原體的
13、有效手段。中科院干細(xì)胞庫(kù)選擇支原體,16S rDNA,序列為靶序列設(shè)計(jì)引物,同時(shí)做對(duì)照組實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)以避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果,取得了很好的效果。,2021/10/10,16,PCR,法支原體檢測(cè)電泳圖。,+,:陽(yáng)性對(duì)照;,-,:陰性對(duì)照;,1,:送檢樣品,1,(感染支原體);,2,:送檢樣品,2,(未感染支原體);,3,:樣品,1,的干擾實(shí)驗(yàn);,4,:樣品,2,的干擾實(shí)驗(yàn)。若在,270bp,處有條帶,檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照及干擾實(shí)驗(yàn),PCR,產(chǎn)物在,270bp,處有一條帶,陰性對(duì)照無(wú)條帶,證明本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。,600bp,400bp,500bp,200bp,300bp,100bp,Mar
14、ker +-1 2 3 4,PCR,法檢測(cè)支原體,2021/10/10,17,預(yù)防:,1.,支原體噴霧(品牌:,Biochrom),:噴于操作臺(tái)和培養(yǎng)箱,2.Plasmocin prophylactic,(品牌:,InvivoGen,):作用濃度為,5g/ml,作用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基(,500 x,稀釋?zhuān)?去除:,Plasmocin treatment,(品牌:,InvivoGen,):作用濃度為,25g/ml,,作用于感染的培養(yǎng)細(xì)胞基兩周(,1000 x,稀釋?zhuān)?3.3,,支原體污染的預(yù)防和去除,2021/10/10,18,4.1,,細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)培養(yǎng)物的危害:,實(shí)驗(yàn)證明,細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)培養(yǎng)細(xì)
15、胞(尤其是,ES,細(xì)胞)的生長(zhǎng)及活性具有明顯的抑制作用,且該作用具有一定的時(shí)間、劑量依賴(lài)性。,4.2,,細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來(lái)源:,細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要天然成份,-,牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是內(nèi)毒素的潛在來(lái)源。我國(guó),2000,年版,中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),中對(duì)牛血清提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量,細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素,支持細(xì)胞增殖檢查等等。對(duì)于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng),,LIF,和,bFGF,是細(xì)菌內(nèi)毒素的另一個(gè)潛在來(lái)源。,4,,內(nèi)毒素污染,2021/10/10,19,4.3,,細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的監(jiān)控:,為排除血清、,LIF,和,bFGF,中內(nèi)毒素的污
16、染,細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)是非常重要的。中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)只使用細(xì)菌內(nèi)毒素小于,1EU/ml,的血清、,LIF,和,bFGF,等各種生長(zhǎng)因子。,4.4,,內(nèi)毒素監(jiān)控是細(xì)胞用于臨床治療所必須的。,目前各類(lèi)臨床級(jí)干細(xì)胞尚無(wú)統(tǒng)一的國(guó)際、國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn),這是胚胎干細(xì)胞進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段的最大障礙之一,也是細(xì)胞庫(kù)水平的一個(gè)重要標(biāo)志。但是在制藥工業(yè)中內(nèi)毒素是必須去除的。因此,中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)強(qiáng)調(diào)高標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)要求,把內(nèi)毒素監(jiān)控作為細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。,2021/10/10,20,鱟試劑凝膠半定量法檢測(cè)(參考,2010,年版,中國(guó)藥典,),4.5,,內(nèi)毒素檢測(cè)方法,鱟試劑:鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無(wú)菌冷凍干燥品,含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原(,Proclotting enzyme,)和凝固蛋白原(,Coagulogen,)。在適宜的條件下(溫度,,pH,值及無(wú)干擾物質(zhì)),細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原,使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。凝膠法鱟試劑是根據(jù)反應(yīng)所形成凝膠的程度來(lái)檢測(cè)樣品內(nèi)內(nèi)毒素的含量。,2021/10/10,21,5,,細(xì)胞間交叉污染,Hela,細(xì)胞是第一株源細(xì)胞系。,1952,年建系以
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