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1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,基因工程技術(shù),基因工程技術(shù),Jackson,Symons,and Berg(1972),generated first,recombinant DNA molecules,Cohen and Boyer(1973),produced first plasmid vector capable of,being replicated within a bacterial host,The Nobel Prize in Ch

2、emistry 1980,Jackson,Symons,and Berg(197,定義：,基因工程（,gene engineering,）,重組,DNA,技術(shù),（,recombinant DNA technique,）：是指在各種酶的作用下，將細(xì)胞外的核酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細(xì)菌或其它載體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組,DNA,分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無性繁殖（稱之為,“克隆”,）和,表達(dá),，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù)，人為地改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程，總稱為基因工程。,定義：基因工程（gene engineering）,應(yīng)用：,克隆感興趣基因進(jìn)行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)

3、。,轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體，進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)合成，生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。,轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞，研究其功能，表達(dá)調(diào)控機(jī)制等,應(yīng)用：克隆感興趣基因進(jìn)行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。,基因工程基本,步驟,：,分、切 目的基因,+,載體分子,轉(zhuǎn) 導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化）,接 構(gòu)成重組,DNA,分子,篩 篩選含有重組分子的克隆,鑒 鑒定重組分子片段,基因工程基本步驟：分、切 目的基因,基因工程流程示意圖,基因工程流程示意圖,構(gòu)建重組分子（連接）,原料,：,目的基因：,研究對(duì)象,載體：,目的基因的運(yùn)載工具,工具酶：,連接酶、限制性內(nèi)切酶,構(gòu)建重組分子（連接）原料：目的基因：研究對(duì)象,目的基因片段,來源,：,基因

4、組,DNA,（非編碼序列）,PCR,方法擴(kuò)增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它克隆構(gòu)建或從商品化的,cDNA,文庫(kù)擴(kuò)增）,通過,RT-PCR,方法得到目的基因,cDNA,人工合成基因片段（價(jià)錢昂貴）,目的基因片段來源：基因組DNA（非編碼序列）,目的基因,來源選擇,：,取決于解決什么問題？,基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表達(dá)調(diào)控的研究,基因組,DNA,PCR,目的基因來源選擇：取決于解決什么問題？cDNART-PCR基,PCR,：,引入合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè),/,兩個(gè)。,加保護(hù)堿基，,1-3,個(gè)。,加上想要的標(biāo)簽，如,Flag,Myc,His,HA,。,啟始及終止密碼子。,高

5、保真聚合酶：,HF,，,Pfu,，,Probest,等。,PCR：引入合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè)/兩個(gè)。高保真聚合酶：HF，,片斷的回收與純化,片斷的回收與純化,載體：,載體,(,Vector),是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)。,種類：,按來源分：質(zhì)粒載體,(plasmid vector),、噬菌體載體,(phage vector),、,柯氏質(zhì)粒載體,(cosmid vector),、病毒載體,(virus vector).,按作用分：克隆載體,(cloning vector),、表達(dá)載體,(expression vector),、穿梭載體,(shut

6、tle vector),載體：載體(Vector)是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目,克隆載體,(cloning vector),用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的,基因擴(kuò)增,的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。主要由細(xì)菌質(zhì)粒或與其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的,DNA,重組構(gòu)建（,pBR322,）。,表達(dá)載體,(expression vector),使,目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá),的載體?？蓪⒅亟M體,DNA,導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（,pcDNA3,）。,克隆載體(cloning vector),穿梭載體,(shuttIe vector),能在

7、兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體。,其可同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的,復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（,ARS,），它即能在,原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá),。主要用,于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。,穿梭載體(shuttIe vector)能在兩種不同的,質(zhì)粒載體,具有,復(fù)制起始點(diǎn),，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。,具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個(gè),松弛型,的質(zhì)粒。,具有某種,選擇性標(biāo)記,以區(qū)別轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。大多是一些抗菌素抗性基因，賦予受體細(xì)胞對(duì)某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。（,Amp,r,；,Tet,r,）,具有若干限制性內(nèi)切酶,單

8、一,識(shí)別位點(diǎn)，便于外源基因插入。,是細(xì)菌染色體外能夠自我復(fù),制的雙鏈環(huán)狀,DNA,分子。,質(zhì)粒載體具有復(fù)制起始點(diǎn)，這是質(zhì)粒自我增殖的必要條件。是細(xì)菌染,克隆載體,:,pBR322,特點(diǎn)：,分子量小，,4.3kb,，便于操作。,有兩個(gè)抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。,有幾個(gè)常用的限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)，分布在抗性基因上，,7,種位于四環(huán)素選擇標(biāo)記上，,4,種位于,Amp,抗性基因上。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導(dǎo)致抗性基因,插入失活,，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。,松弛性質(zhì)粒，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有較高的拷貝數(shù)，當(dāng)細(xì)菌蛋白質(zhì)合成停止時(shí)，它仍能繼續(xù)復(fù)制。,克隆載體:pBR322 特點(diǎn)：,基

9、因工程技術(shù)分子生物學(xué)ppt課件,TA,克隆,A,A,TA 克隆AA,TOPO-TA,TOPO-TA,原核,His-tag:pQE,系列,(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX,系列,(Pharmacia),表達(dá)載體：,帶有調(diào)控基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟 動(dòng)子等，這些調(diào)控元件應(yīng)與宿主細(xì)胞相適應(yīng)。,原核 His-tag:pQE系列(Qiagen),pcDNA 3,系列,(Invitrogen),，,真核表達(dá)載體：,大多是穿梭載體。,pcDNA 3系列(Invitrogen)，真核表達(dá)載體：,pFLAG-CMV,系列,(Sigma),pFLAG-CMV系列(

10、Sigma),DNA,分子的體外連接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配對(duì)進(jìn)行連接,DNA分子的體外連接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配對(duì),兩種情況：,（,a,）,目的基因和載體,用,同一種限制酶切割,后連接。載體,易,自身環(huán)化,。,用,堿性磷酸酶,(,能除掉,DNA,兩端的,5,磷酸基團(tuán)）處,理載體，可防止載體自身環(huán)化。,（,b,）目的基因和載體用兩種產(chǎn)生粘末端的限制酶,切割后連接，可控制目的基因的插入方向,(,定向克隆,),。,兩種情況：（a）目的基因和載體用同一種限制酶切割后連接。載體,堿性磷酸酶處理：,堿性磷酸酶處理：,平頭末端：,（,1,）增加連接酶的量（連接酶對(duì)平末端,DN

11、A,的,Km,約高于粘性末端,DNA100,倍）,（,2,）在末端加上一個(gè)人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi),切酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體,連接。如加上一個(gè)人工接頭內(nèi)含,GAATTC,序列，用,EcoRI,酶切，產(chǎn)生,EcoRI,粘性末端。,平頭末端：（1）增加連接酶的量（連接酶對(duì)平末端DNA的Km,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco REco REco R,連接,策略,：,pCMV,連接策略：pCMV,連接濃度：,片段與載體連接機(jī)率自身環(huán)化,一般計(jì)算公式：,粘性末端：,載體片段含量（,ng,）,/,載體長(zhǎng)度（,kb,）,1,DNA,片段含量（,ng,）,/DNA,片段長(zhǎng)度

12、（,kb,）,3-5,平末端,1,：,5 10,連接濃度：片段與載體連接機(jī)率自身環(huán)化,連接反應(yīng)：,10ul,體系,H,2,O,Buffer,Vector,Insert,ligase,14,過夜,連接反應(yīng)條件,連接酶的活性；,DNA,的純度；載體與目的基因的比例；,PH,值,7.2-7.8,適宜；,14(,不高于,16),過夜,連接反應(yīng)：10ul 體系H2O 14過夜連接反應(yīng)條件,連接酶：兩種,DNA,連接酶：,連接雙鏈中兩條,DNA,鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。需要一條,DNA,鏈的,3-,末端具有游離的,OH,，另一條,DNA,鏈,5-,末端的磷酸基團(tuán),-P,，吸能反應(yīng)，需,A

13、TP,存在。也可做,DNA,修復(fù)。但不能連接兩條單鏈,DNA,分子和環(huán)化的單鏈,DNA,分子。而且只能連接粘性末端。,T4 DNA,連接酶：,是從感染,T4,噬菌體的,E,coli,中分離得到的一種連接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。用途比,DNA,連接酶廣泛，是分子生物學(xué)研究及基因克隆中較常用的連接酶。,連接酶：兩種DNA連接酶：連接雙鏈中兩條DNA鏈之間形成磷酸,其他酶：末端修飾酶,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（,terminal deoxynucleotidyl transferase,）,簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶。在合適的反應(yīng)系統(tǒng)中，這種酶使,DNA,片段平末端的,3-OH,加上同聚核苷酸，產(chǎn)

14、生具有,poly,（,A,）、或,poly,（,T,）、或,poly,（,G,）、或,poly,（,C,）的粘性末端。,堿性磷酸酶,根據(jù),DNA,重組的需要，為防止兩,DNA,片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使,DNA,末端的,5-P,成為,5-OH,。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來源于大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（,BAP,）和來源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（,CIP,）。,CIP,的比活性比,BAP,高出,10,倍以上，而且對(duì)熱敏感，便于加熱使其失活。,其他酶：末端修飾酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal d,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：,把重組,DNA,導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,.,根據(jù)

15、所用載體的特性選擇適宜的受體細(xì)胞（原核，真核）及選擇適宜的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。,受體細(xì)胞的要求：必須具備使外源,DNA,進(jìn)行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達(dá)由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的選擇與鑒定。,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：把重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增.根據(jù)所,重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：途徑,轉(zhuǎn)化：,質(zhì)粒,DNA,或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌（感受態(tài)菌）的過程,轉(zhuǎn)染：噬菌體、病毒、或以它作為載體構(gòu)建的重組子主動(dòng)或被動(dòng)被導(dǎo)入細(xì)胞的過程。,感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過感染受體細(xì)胞，然后整合到受體細(xì)胞基因組上。,重

16、組子導(dǎo)入受體細(xì)胞：途徑轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重,轉(zhuǎn)化,受體細(xì)胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細(xì)胞,轉(zhuǎn)化機(jī)理：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于吸收外源,DNA,發(fā)生可遺傳的改變。,轉(zhuǎn)化效率：,只有很少比例的細(xì)胞有能力摻入質(zhì)粒,DNA,轉(zhuǎn)化時(shí)大約在,1000,個(gè),DNA,分子中，只有一個(gè),DNA,分子獲得成功。一般每微克完整的,pBR322DNA,產(chǎn)生,10,5-,10,7,轉(zhuǎn)化細(xì)胞,轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞：大腸桿菌，基因工程中最常用的宿主細(xì)胞,感受態(tài)菌制備,感受態(tài)：,細(xì)菌細(xì)胞處于一個(gè)容易吸收外源,DNA,狀態(tài)，這種狀態(tài)的細(xì)菌稱為感受態(tài)菌。,氯化鈣法,：,氯化鎂法：,電轉(zhuǎn)法：,感受態(tài)菌制備感受態(tài)：細(xì)菌細(xì)胞處于一個(gè)容易吸收外源DNA狀態(tài)，,氯化鈣,法：,原理,快速生長(zhǎng)的細(xì)菌用低滲低濃,(50 100mM),的氯化鈣（,CaCl,2,),處理，使細(xì)胞腫脹成球形,加入質(zhì)粒后，即于細(xì)胞表面形成抗,DNAase,的羥基,-,磷酸鈣復(fù)合物,經(jīng),42,熱休克后，復(fù)合物被細(xì)胞吸收。,非選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)，球狀細(xì)胞復(fù)原開始增殖,抗生素基因表達(dá)。,氯化鈣法：原理快速生長(zhǎng)的細(xì)菌用低滲低濃(50 100m,重