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1、,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,ppt課件,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第

2、五級,ppt課件,*,RNA-seq,技術原理及應用,RNA-seq技術原理及應用,主要內(nèi)容,1,、,RNA-seq,技術簡介,2,、,RNA-seq,技術原理,3,、,RNA-seq,結果分析,4,、,RNA-seq,技術應用,2,ppt課件,主要內(nèi)容1、RNA-seq技術簡介2ppt課件,一、,RNA-seq,技術簡介,1.,誕生于 20 世紀 70 年代的 Sanger 法是最早被廣泛應用的 DNA 測序技術，也是完成人類基因組計劃的基礎。,2.2005 年以來，以 Roche 公司的 454 技術、Illumina 公司的 Solexa 技術和 ABI 公司,的,SOLiD 技術為標志

3、的新一代測序技術相繼誕生,，又稱作深度測序技術。,3.把高通量測序技術應用到由 RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 上，從而獲得來自不同基因的RNA 片段在特定樣本中的含量，這就是 RNA測序或 RNA-seq,。,3,ppt課件,一、RNA-seq技術簡介1.誕生于 20 世紀 70 年代,二、RNA-seq技術原理,Illumina/Solexa 測序技術的基本原理是邊合成邊測序，即測序過程是以 DNA 單鏈為模板，在生成互補鏈時，利用帶熒光標記的 dNTP 發(fā)出不同顏色的熒光來確定不同的堿基。,新加入 dNTP 的末端被可逆的保護基團封閉，既保證單次反應只能加入一個堿基，又能在該堿基讀取完畢

4、后，將保護基團除去，使得下一個反應可繼續(xù)進行。為了增加熒光強度，使之更易被成像系統(tǒng)所采集，該技術在測序之前還需要對待測片段做橋式擴增。,4,ppt課件,二、RNA-seq技術原理Illumina/Solexa 測,Shot Gun,文庫構建,DNA,片段固定,簇序列讀取反應,圖像獲得和處理,序列組裝和比較,單條模板擴增,1,2,3,4,T T T T,T,G,C,T,二、RNA-seq技術原理,5,ppt課件,Shot Gun文庫構建DNA片段固定簇序列讀取反應圖,二、RNA-seq技術原理,RNA-seq,實驗流程圖,6,ppt課件,二、RNA-seq技術原理RNA-seq實驗流程圖6ppt

5、課,為了便于測序數(shù)據(jù)的發(fā)布和共享，高通量測序數(shù)據(jù)以 FASTQ 格式來記錄所測的堿基讀段和質(zhì)量分數(shù)。NCBI、EBI、DDBJ 等數(shù)據(jù)中心建立了大容量的數(shù)據(jù)庫 SRA來存放共享的測序數(shù)據(jù)。,三、,RNA-seq結果分析,7,ppt課件,為了便于測序數(shù)據(jù)的發(fā)布和共享，高通量測序數(shù)據(jù)以 FASTQ,三、,RNA-seq結果分析,RNA-seq 數(shù)據(jù)的基本處理,8,ppt課件,三、RNA-seq結果分析RNA-seq 數(shù)據(jù)的基本處理8p,1.序列定位算法,（,1,）空位種子索引法：首先將讀段切分，并選取其中一段或幾段作為種子建立搜索索引，再通過查找索引、延展匹配來實現(xiàn)讀段定位，通過輪換種子考慮允許出

6、現(xiàn)錯配的各種可能的位置組合（,Maq）,。,（,2,）Burrows-Wheeler 轉(zhuǎn)換技術：通過B-W 轉(zhuǎn)換將基因組序列按一定規(guī)則壓縮并建立索引，再通過查找和回溯來定位讀段，在查找時可通過堿基替代來實現(xiàn)允許的錯配（,Bowtie）,。,（,3,）,改進的 SmithWaterman 動態(tài)規(guī)劃算法：隨著讀長的增加，允許讀段序列中存在插入刪除(indel)的定位（BFAST、SHRiMP、Mosaik）。,三、,RNA-seq結果分析,9,ppt課件,1.序列定位算法三、RNA-seq結果分析9ppt課件,2.基因表達水平估計,RNA-seq 數(shù)據(jù)最基本的應用是檢測基因的表達水平，與基因芯片數(shù)

7、據(jù)相比，RNA 測序得到的是數(shù)字化的表達信號，具有靈敏度高、分辨率高、無飽和區(qū)等優(yōu)勢,。,RNA 測序數(shù)據(jù)是對提取出的 RNA 轉(zhuǎn)錄本中隨機進行的短片段測序，如果一個轉(zhuǎn)錄本的豐度高，則測序后定位到其對應的基因組區(qū)域的讀段也就多，可以通過對定位到基因外顯子區(qū)的讀段計數(shù)來估計基因表達水平,。,三、,RNA-seq結果分析,10,ppt課件,2.基因表達水平估計三、RNA-seq結果分析10ppt課,3.選擇性剪接事件識別和剪接異構體表達水平推斷,只要測序深度足夠深，就能檢測到所有轉(zhuǎn)錄本的全部序列，包括來自剪接接合區(qū)的序列,。,Tophat 等軟件定位剪接接合區(qū)讀段的策略能標定出剪接事件中的兩個剪接

8、位點：供體位點和受體位點,。,通過比較供體位點和受體位點的組合，就能識別選擇性剪接事件,。,進一步，通過對供體和受體位點的讀段計數(shù)，結合外顯子其他區(qū)域的讀段數(shù)據(jù)，還能定量地計算選擇性剪接事件之間的比例。,三、,RNA-seq結果分析,11,ppt課件,3.選擇性剪接事件識別和剪接異構體表達水平推斷三、RNA-,三、,RNA-seq結果分析,兩類樣本 RNA-seq 數(shù)據(jù)比較分析的框架,12,ppt課件,三、RNA-seq結果分析兩類樣本 RNA-seq 數(shù)據(jù)比較,四、RNA-seq技術應用,1、轉(zhuǎn)錄本結構研究,利用單堿基分辨率的RNA-Seq技術可極大地豐富基因注釋的很多方面內(nèi)容,包括 5/3

9、邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。RNA-Seq還可對可變剪接(Alternative splicing)進行定量研究。,2、轉(zhuǎn)錄本變異研究,在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究等，RNA-seq也具有很大的潛力。,13,ppt課件,四、RNA-seq技術應用1、轉(zhuǎn)錄本結構研究13ppt課件,四、RNA-seq技術應用,3、非編碼區(qū)域功能研究,轉(zhuǎn)錄組學研究的一個重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析 ncRNA，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因表達。,4、基因表達水平研究,RNA-Seq一個特別強大的優(yōu)勢是它可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化而無需對數(shù)據(jù)集進行復雜的標準化。,14,ppt課件,四、RNA-seq技術應用3、非編碼區(qū)域功能研究14ppt課,總結,高通量測序技術的應用面非常廣，RNA-seq 只是其中一個方面，除此之外，基因組的從頭測序和重測序、染色質(zhì)免疫沉淀測序、甲基化測序等技術都同樣有著廣泛的應用。,15,ppt課件,總結高通量測序技術的應用面非常廣，RNA-seq 只是其中一,THANK YOU!,16,ppt課件,THANK YOU!16ppt課件,