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1、人胰島素的制備 I轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增 20 / 21 基因工程基本流程示意注 an 皿 ana □oo Q 一、 獲得目的基因 從供體細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反 轉(zhuǎn)錄合成胰島素mRNA互補(bǔ)DNA,再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄 酶或DNA聚合酶I的作用在，最終合成編碼它的雙鏈DNA序列。即得到 了目的基因。 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法 （一）從人體細(xì)胞內(nèi)提取胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 1,細(xì)胞總RNA的提?。? 取胰島B細(xì)胞，用P

2、BS洗后，加入TRIZOL試將細(xì)胞破裂，后用 DEPC處理，多次離心后，取RNA白色沉淀，測(cè)OD值，電泳。 2 ,從總RNA中分離mRNA： 取上述提取的總RNA若干，加入Buffer OBB , Oligotex Suspension ,打勻。7（TC水?。呀釸NA的二級(jí)結(jié)構(gòu)），20-30℃ 條件下,靜置（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。將Oligotex/mRNA復(fù)合 物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速離心，加Buffer將其他RNA洗脫， 最后用瓊脂糖凝膠電泳純化mRNA。 （二）mRNA轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 cone第一鏈的合成 加入上步獲得的mRNA和適當(dāng)引物于EP

3、管中，加入RNase-free water,混勻后,70七反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)完成后，立刻將反應(yīng)體系置于冰上 5min;稍微離心一下，順序加入緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP （加入放射性同位素利于檢驗(yàn)），混勻，稍微離心反應(yīng)物之后,42（放置 2分鐘。取出置于冰上。電泳分析，同位素活性測(cè)定。 （三）PCR法擴(kuò)增，特異合成目的cDNA鏈 通過(guò)胰島素的特異引物，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異的合成胰島素 的cDNA鏈。 PCR法的操作步驟： 預(yù)變性 引物退火 引物延伸 循環(huán)25-35次 最后延伸 ⑥前端引物: ⑥ 5' -ggt tcc gga tct ggt tct ggt

4、 tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3' ⑥后端引物： ⑥ 5' -agt gtc gac tta gtt gca gta gtt etc cag ctg gta-3' 二、組建重組質(zhì)粒 采用pQE—30質(zhì)粒作為載體，用雙酶切法進(jìn)行基因重組。 1 ,雙醯切法 用兩種酶限制性?xún)?nèi)切核酸酸消化載體DNA和外源DNA片段,使載體 和外源目的基因的兩端分別形成不同黏性末端，將它們混合，在連接酶的 作用下相同的黏性末端可退火連接成重組DNA分子，從而實(shí)現(xiàn)

5、DNA的定 向連接。 2 ,重組過(guò)程 PQE-30用Hind III和BainH I酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收 純化酶切片段。外源DNA片段同樣也用Hind III和BamH I酶切并回收 純化酶切片段。雙酶切后的載體外源DNA片段混合退火，因?yàn)镠ind HI 和BamH I的黏性末端不匹配,避免了載體和外源DNA片段的自身連接, 外源DNA片段只能定向地連接到載體的Hind III和BamH I位點(diǎn)之間。 當(dāng)然也不可避免發(fā)生載體的Hind III和BamH I的黏性末端之間的兩個(gè) 堿基互補(bǔ)形成開(kāi)環(huán)，轉(zhuǎn)到大腸桿菌中被修復(fù)，但這樣的重組子占少數(shù)，是 低效轉(zhuǎn)化。 三、構(gòu)建基因工程菌 （

6、一） 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法 將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌 -半乳糖昔酶基因的下游。重組子表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)CNBr處理后，分 離純化A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸殘基性質(zhì)，采用 相應(yīng)的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過(guò)體外化學(xué)折疊制備具有活 性的重組人胰島素。重組DNA的轉(zhuǎn)化 1, CaC12法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞： 取100 ml菌體培養(yǎng)至（DD600 = 0.5,離心收集菌體，用10 ml冰 冷的10 mM CaC12溶液懸浮菌體，離心，收集菌體，用1 ml冰冷的 75 mMeaC12溶液懸浮菌體

7、,冰浴放置12-24小時(shí)，備用。 2,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 取100 ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50 ng載體的重組，DNA連接 液，混勻。冰浴放置半小時(shí)。在42 I保溫2分鐘（熱脈沖），快速將 轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘。加入1 ml新鮮培養(yǎng)基，于 37七培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。 經(jīng)典的CaC12轉(zhuǎn)化方法： a將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘,然后于41下3000g離 心10分鐘。 b棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaC12溶液10ml輕輕懸浮細(xì) 胞，冰上放置15-30分鐘后,49下3000g離心10分鐘。 c棄

8、去上清，加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaC12溶液, 輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 d感受態(tài)細(xì)胞分裝成200口1的小份，貯存于-709。 e從-7CTC冰箱中取200可感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍,解凍后立即置 冰上。 f加入pBS質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10凰,輕輕 搖勻，冰上放置30分鐘后。 g42，C水浴中熱擊90秒或37C水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷 卻3-5分鐘。 h向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基（不含Amp）,混勻后37C振蕩培養(yǎng) 1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 （Ai

9、npr ） o i將上述菌液搖勻后取100Ml涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上 放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37七培養(yǎng)16-24小 時(shí)。 （二）重組子的篩選和鑒定（載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)） 1 .初篩選 隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化單菌落，在LB/AK培養(yǎng)基（含100p g/ml氨節(jié)青霉素和 50ug/ml卡那霉素）中進(jìn)行培養(yǎng)，用O.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 表達(dá)情況用16. 5%SDS. PAGE進(jìn)行分析。 2 .重組菌的后續(xù)鑒定 直接電泳檢測(cè)法 將初篩選獲得的重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取其質(zhì)粒DNA,通過(guò)PCR對(duì)其進(jìn) 行擴(kuò)增，利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體

10、分子量大，用 電泳法檢測(cè)質(zhì)粒是否為重組質(zhì)粒。 目的蛋白表達(dá)檢驗(yàn) 所得菌體經(jīng)溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞后得到的包涵體進(jìn)行SDS-PAGE分 析，所需基因工程菌表達(dá)的外源蛋(His)6 ? Arg-Arg-人胰島素原以包涵體 形式存在，其分子大小約為13kb,經(jīng)電泳與胰島素原marker對(duì)比，如 條帶顯示有所需目的蛋白，則所得菌既可做工程菌使用，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后， 斜面保存以便后續(xù)使用。 3 .工程菌的保藏 15%甘油保存菌種，菌液=20:80,,充分混勻后,-70度保藏。 四、培養(yǎng)工程菌 優(yōu)化發(fā)酵條件 采用比濁法測(cè)定不同時(shí)間培養(yǎng)基中菌量， 繪制基因工程菌的生長(zhǎng)曲線，在搖瓶培 養(yǎng)的水平下，

11、采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵基因工菌，培養(yǎng)4小時(shí)候即進(jìn)入 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可延長(zhǎng)至17小時(shí)。 1,正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)： 采用正交法，選取搖瓶培養(yǎng)條件中七個(gè)主要因素進(jìn)行兩水平正交優(yōu) 化，該七個(gè)因素為：種子活化方式，搖床轉(zhuǎn)遞（通風(fēng)量），IPTG誘導(dǎo)溫度， 接種量，IPTG添加量，誘導(dǎo)時(shí)間，補(bǔ)料方式。分別用A、B、C、D、E、 F、G表示,以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量與發(fā)酵液的A600為目標(biāo)量， 考察條件優(yōu)化的效果，進(jìn)行八次實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化出最佳 實(shí)驗(yàn)條件。 2,其他條件優(yōu)化： 在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步就各種金屬元素對(duì)苗體生長(zhǎng)發(fā)重 組蛋白誘導(dǎo)的影響作了分析。 3,放大培

12、養(yǎng)（比較不同發(fā)酵工藝產(chǎn)： 在優(yōu)化搖瓶水平發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，放大至1 L培養(yǎng)基中比較兩種 發(fā)酵工藝。在不同轉(zhuǎn)速，通氣量，pH條件下，比較選擇產(chǎn)量最高的發(fā)酵 工藝。 五、產(chǎn)物分離純化 由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以 對(duì)產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。 基因工程藥物的分離純化一般不應(yīng)超過(guò)4-5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液 分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以與成品加工。 發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞分離，分別得到胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物。 胞外產(chǎn)物直接進(jìn)行透析濃縮然后進(jìn)行再?gòu)?fù)性與酶轉(zhuǎn)化，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn) 行高度純化，最后制劑即可。 胞內(nèi)產(chǎn)物用溶酶菌或超聲波將細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎

13、后用高速離心法 進(jìn)行固液分離。分離后用變性劑或者離子去污劑得到包含體，再用變性劑 （尿素）使其變形，接著用二次復(fù)性法將其復(fù)性。對(duì)復(fù)性后的產(chǎn)物進(jìn)行透 析濃縮，然后進(jìn)行再?gòu)?fù)性與酶轉(zhuǎn)化，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高度純化，最后制劑即 可。 重組蛋白分離純化的特點(diǎn) 重組蛋白質(zhì)分離純化的特點(diǎn)為：（1）大多數(shù)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品是生物活性 物質(zhì)，在分離純化過(guò)程中，有機(jī)溶劑、溶液pH值、離子強(qiáng)度的變化均可 使蛋白質(zhì)變性失活a（2）重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品在物料中含量很低，凰物料組成非 常復(fù)雜。例如，利用基因工襁菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藤，物料中含有大量綴成復(fù) 雜的培養(yǎng)基、榮體生產(chǎn)代謝物等，疆揀蛋鑫襄魏含量囂豢不瑟蛋鑫凄慈爨 鵑1%。舂些囂揀鬣

14、囊矮存在予綴懿武或在胞內(nèi)形成包含體，為獲敬蛋白 質(zhì)，還需避行細(xì)脆破碎，結(jié)鬟物料中含有大量的細(xì)胞碎片和胞內(nèi)產(chǎn)物。（3） 含蛋白質(zhì)產(chǎn)晶的物料不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)產(chǎn)品易受料液中蛋自水解酶降解。（4） 很多熏組蛋白質(zhì)產(chǎn)品作為醫(yī)藥、食品被人炎利用，因而要求蛋國(guó)螺產(chǎn)器必 綏是裹潢縫鈉瓣，產(chǎn)蘸無(wú)螢、茲致熱源等。與傳統(tǒng)麓生物大分子分離方式 楣鐐，嚶綴蛋臼的分離純純恣憨秘用其攜理稻化學(xué)性質(zhì)的差異，即以分子 的大小、形狀、溶解度、等電點(diǎn)、祭疏水性以與與其它分子的親和性等性 質(zhì)建立起來(lái)的。 二次復(fù)性法： 0. 5g包涵體溶解于一定量的緩沖液B(50mmol/LGly—NaOH, 8 moi/L尿素，B_琉基乙醇，p

15、H 9. 5)中，使之充分混懸，靜置1小時(shí) 以上?；鞈乙悍植街鸬渭尤氲骄彌_液C(50mmol/LGly-NaOH,半胱氨 酸一胱氨酸，pH 9. 5)中，49靜置復(fù)性過(guò)夜。上樣于巳用50mmol/LGly —NaOH(pH9. 5)平衡的 DEAE-Sepharose FF 柱，用 0. Imol/L 的 氯化鈉梯度洗脫，通過(guò)SDS-PAGE確定RRhPI位置，用 DEAE-Sepharose FF做離子交換層析，收集含RRhPI的洗脫峰2,層 析圖譜見(jiàn)(圖6)。電泳檢測(cè)顯示(圖11)峰2主要為RRhPI,與少量高分 子雜質(zhì)，收集峰2做再?gòu)?fù)性。峰1為pH高于9.5與一些疏水性蛋白質(zhì) 形成的穿透

16、峰，絕大部分pH低于RRhPI的蛋白質(zhì)和核酸類(lèi)雜質(zhì)則牢固 地結(jié)合在柱子上，在較高鹽濃度與2mol/L NaCl的條件下被洗脫下來(lái)， 形成其他峰3和峰4。胰島素原(RRhPI)的再?gòu)?fù)性與酶切轉(zhuǎn)化： 1,復(fù)性 將初步復(fù)性與純化后的RRhPI通過(guò)透析濃縮，先后轉(zhuǎn)換到緩沖液B 和D(50mmol/L Gly-NaOH,氧化型谷胱甘肽(GSSG)—還原型谷胱甘 (GSH)pH9. 5)中，使蛋白濃度為0. 1~0. 6 mg/ml, 4寸靜置過(guò)夜。 2廨切 復(fù)性后的RRhPI復(fù)性液調(diào)節(jié)pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin) 和竣肽酶B(carboxypeptidase B)在37。C進(jìn)行

17、協(xié)同酶切一段時(shí)間，然 后滴加2 moi/LZnCI:至ZnCl:濃度為0. Imol/L終止反應(yīng)并沉淀 生成的 hl,用雙蒸水洗滌沉淀得較純B9重組人胰島素約79 mg/L培養(yǎng)基。 重組胰島素粗品的純化： 胰島素粗品用0. 2 mol/L NaAc - HAc, pH4. 0溶解。溶解后的樣品 通過(guò) Superdex 75進(jìn)行純化（圖10）,得1、2、3峰，收集峰3,透析后凍干 即 為胰島素產(chǎn)品所得胰島素產(chǎn)品用SDS-PAGE分析為單帶，電泳檢測(cè)見(jiàn)圖。 2 kfl ▲ 10 9 20.1 kO ,4 40 一 一 1 2 3-4567 圖11.SDS-聚丙埃酰聯(lián)電泳檢測(cè)

18、圖 1 ,低分子量標(biāo)準(zhǔn)：2.人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品；3.人胰島素制品 4.二次復(fù)性法中通過(guò)DEAE?Sepharose FF純化的RRhPI 六、除菌過(guò)濾 傳統(tǒng)過(guò)濾只能濾去空氣中的塵埃、液體中的異物微粒，很難去除 微生物活體（細(xì)菌、病毒與熱原體）；薄膜過(guò)濾是微孔篩分，大于孔徑的 微粒均被截留，微生物粒子大小為0.5-2微米，只要選用0.45微米的微 孔濾膜即可將微生物截留去除，用0.22微米的微孔濾膜則可能將病毒、 熱原體去除。。 注射用藥液除用傳統(tǒng)過(guò)濾器去除藥液中的異物外，現(xiàn)已采用微孔 濾膜將澄清的藥液再次除菌、除熱原，其濾膜孔徑最好在0.22微米以下。 制藥空氣的過(guò)濾亦因GMP的不同級(jí)別

19、要求而采用相應(yīng)的器材、過(guò)濾器。 要指出的是，制藥無(wú)菌空氣的供應(yīng)僅采用傳統(tǒng)濾材、濾器往往不能達(dá)到要 求，其終端必須選用微孔薄膜，孔徑必須在0。45微米以下。 注射用無(wú)菌藥液的處理：按GMP要求，注射用藥液應(yīng)當(dāng)無(wú)菌無(wú)熱原，本 品藥液配制好后，經(jīng)過(guò)粗砂棒、細(xì)砂棒（適當(dāng)使用滑石粉或碳粉）過(guò)濾 成澄明液后，再經(jīng)過(guò)0.45微米多層微孔濾芯除菌，終端通過(guò)0.22微米 單層超微孔濾膜后上機(jī)灌裝。 目前，用于過(guò)濾器常用的主要過(guò)濾材料大致有以下幾種： 混合纖維素酯 常用來(lái)制成圓形的單片平板濾膜，用于液體和氣體的精過(guò)濾；聚丙烯 (PP) 做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，有較大的孔徑，其具有親水性，屬 粗過(guò)濾

20、材料； 聚偏二氟乙烯(PVDF) 屬精過(guò)濾材料，耐熱和耐化學(xué)穩(wěn)定，蒸汽滅菌承受性良好，可制成親 水性濾膜，較廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)無(wú)菌制劑用水與注射用水的過(guò)濾； 聚醮翱PES) 做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，耐溫耐水解性能好，親水性材料， 用于精度較高的溶液的精過(guò)濾； 尼龍 做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，親水性材料，常用作液體的精過(guò)濾; 聚四氟乙烯(PTFE) 做成折疊式，常用于筒式過(guò)濾器，疏水性材料，其是使用相當(dāng)廣泛的 一種材料，耐熱耐化學(xué)穩(wěn)定，常用于水、無(wú)機(jī)溶劑與空氣的精過(guò)濾。 除菌過(guò)濾器的特點(diǎn) (1)除菌過(guò)濾器一般采用十字懸掛式，水平進(jìn)出。多芯過(guò)濾器可設(shè) 計(jì)成落地式。

21、 (2)有些使用場(chǎng)合根據(jù)實(shí)際需要分成預(yù)過(guò)濾器、精過(guò)濾器兩種。 (3)空氣流向：從外向內(nèi)穿過(guò)濾芯。 (4)進(jìn)入除菌過(guò)濾器的壓縮空氣必須先經(jīng)過(guò)至少三級(jí)的精密過(guò)濾器 與干燥機(jī)。除油、除水、除塵，油霧濃度應(yīng)40.01PPM,否則將影響除菌 濾芯的壽命，達(dá)不到預(yù)期的除菌效果。 (5)定期殺菌，根據(jù)實(shí)際使用情況每周或每月1~2次，每次30分 鐘，采用經(jīng)過(guò)小過(guò)濾精度的潔凈飽和蒸汽殺菌。蒸汽溫度V14(TC,蒸汽 壓力V0.3MP3閥門(mén)緩慢開(kāi)關(guān)。 (6)作為罐體、設(shè)備的呼吸器使用時(shí)，其作用主要在于連通大氣防 止設(shè)備內(nèi)部負(fù)壓和隔離開(kāi)空氣中的污染源，過(guò)濾方面的功能不大，因此在 過(guò)濾上基本無(wú)要求。 對(duì)胰島

22、素進(jìn)行除菌過(guò)濾后采用胰島素凍干粉等凍干技術(shù)凍干，既得胰島素 結(jié)晶。 經(jīng)包裝等工序后的成品。 如下圖： 七、半成品檢定 重組人胰島素半成品檢測(cè)（檢測(cè)提取純化后重組人胰島素樣品）： （一）雜質(zhì)檢定 1,有關(guān)物質(zhì)：取本品適量，用O.Olmol/L鹽酸溶液制成每1ml中含 3.5mg的溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液20 1注入液相色譜儀， 記錄色譜圖，按面積歸一化法計(jì)算，含A21脫酰胺人胰島素不得過(guò)1.5%, 其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過(guò)2.0%。 2,高分子蛋白質(zhì)：取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中 含4mg的溶液，作為供試品溶液。按照分子排阻色譜法試驗(yàn)。以色

23、譜用 親水改性硅膠為填充劑（5?10 m）;冰醋酸-乙晴-0.1%精氨酸溶液（15: 20： 65）為流動(dòng)相，流速為每分鐘0.5ml,檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm。取重組 人胰島素單體-二聚體對(duì)照品，用O.Olmol/L鹽酸溶液制成每1ml中含 4mg的溶液；取100 1注入液相色譜儀，重組人胰島素單體與二聚體的 分離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液100 1,注入液相色譜儀，記錄色譜圖， 除去保留時(shí)間大于人胰島素主峰的其它峰面積，保留時(shí)間小于人胰島素主 峰的所有峰面積之和不得過(guò)L0%。 3,鋅：對(duì)照品溶液的制備 精密量取鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（lOOOug/ml） 5ml, 置100ml量瓶中，加O.Olmol/L

24、鹽酸溶液至刻度，搖勻。供試品溶液的 制備 精密稱(chēng)取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含鋅約 0.4~0.8陽(yáng) 的溶液，搖勻。測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液，用O.Olmol/L 鹽酸溶液分別稀釋成每1ml鋅含量為0.20砥、0.40口g、0.60pg. 0.80日 g、l.OOpg的溶液。將上述各溶液與供試品溶液，照原子吸收分光光度法, 在213.9nm的波長(zhǎng)處測(cè)定，按干燥品計(jì)，含鋅量不得過(guò)1.0%。 4,熾灼殘?jiān)喝”酒芳s0.2g,依法檢查，遺留殘?jiān)坏眠^(guò)2.0%。 （二）效價(jià)測(cè)定：按照高效液相色譜法測(cè)定 取本品適量，精密稱(chēng)定，用0.01mol/L鹽酸溶液定量稀釋至每1ml

25、 中約含10單位的溶液（臨用新配）。精密量取20 1注入液相色譜儀， 記錄色譜圖；另取重組人胰島素對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以人胰 島素峰面積（包括A21脫酰胺峰面積）計(jì)算，即得。 （三）胰島素生物測(cè)定法 本法系比較胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)引起小鼠血糖下降的 作用，以測(cè)定供試品的效價(jià)。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)取胰島素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價(jià)，加入每 100ml中含有苯酚0.2g并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5的0.9%氯化鈉溶液, 使溶解成每1ml中含20單位的容易忘，4~8(貯存，以不超過(guò)5天為宜。 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備試驗(yàn)當(dāng)日，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按高低劑量 組(ds2 ,

26、 dsj)加0, 9氯化鈉溶液(pH2. 5)制成兩種濃度的稀釋液，高低劑 量的比值①不得大于l：0. 5o高濃度稀釋液一般可制成每1 ml中含0. 06八’0. 12單位，調(diào)節(jié)劑量使低劑量能引起血糖明顯下降，高劑量不致差 別。 供試品溶液與稀釋液的制備按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)(AJ,照標(biāo) 準(zhǔn)品溶液與其稀釋液的制備法制成高、低兩種濃度的稀釋液，其比值①應(yīng) 與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品高低劑量所致的反應(yīng)平均值應(yīng)相近。 測(cè)定法取健康合格、同一來(lái)源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠, 體重相差不得超過(guò)3g,按體重隨機(jī)等分成4組，每組不少于10只，逐只 編號(hào)，各組小鼠分別自皮下注人一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)

27、品或供試品稀釋液，每鼠 0. 2八0. 3ml,但各鼠的注射體積(ml)應(yīng)相等。注射后40分鐘，按給藥 順序分別自眼靜脈叢采血，用適宜的方法，如葡萄糖氧化酶一過(guò)氧化酶法 測(cè)定血糖值。第一次給藥后間隔至少3小時(shí)，按雙交叉設(shè)計(jì)，對(duì)每組的各 鼠進(jìn)行第二次給藥,并測(cè)定給藥后40分鐘的血糖值。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(附 錄XIV)中量反應(yīng)平行線測(cè)定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)與實(shí)驗(yàn)誤差。 本法的可信限率(FL%)不得大于25 % (四)注射液檢測(cè) 1,滲透壓摩爾濃度：除另有規(guī)定外，靜脈輸液與椎管注射用注射液按 各品種項(xiàng)下的規(guī)定，照滲透壓摩爾濃度測(cè)定法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 2,可見(jiàn)異物：除另有規(guī)定外，照可見(jiàn)異物檢

28、查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 3,不溶性微粒：除另有規(guī)定外，溶液型靜脈用注射液、注射用無(wú)菌粉 末與注射用濃溶液照不溶性微粒檢查法檢查，均應(yīng)符合規(guī)定。 3,無(wú)菌：按照無(wú)菌檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 4,細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原：除另有規(guī)定外，靜脈用注射劑按各品種項(xiàng)下的 規(guī)定，照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法或熱原檢查法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 熱原(pyrogen) 1 .熱原的定義：注射后能引起人體特殊致熱反應(yīng)的物質(zhì)。 2 .熱原的組成：熱原是微生物的代謝產(chǎn)物，是微生物的一種內(nèi) 毒素，大多數(shù)細(xì)菌都能產(chǎn)生熱原，革蘭氏陰性桿菌致熱力最強(qiáng)。熱原由磷 脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，其中脂多糖是致熱活性中心。脂多 糖組成因

29、菌種的不同而異，熱原的分子量106左右。 3 .熱原的危害：含熱原的注射劑輸入人體后，約半小時(shí)人體就發(fā) 冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、全身痛、出汗、惡心嘔吐等，嚴(yán)重時(shí)高燒40度、 昏迷、虛脫、甚至死亡。 八、成品檢定 重組人胰島素成品檢測(cè)(即檢測(cè)重組人胰島素注射液樣品)： 本品為重組人胰島素的無(wú)菌水溶液。其效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%? 110.%。 本品可加入適量的苯酚或間甲酚作抑菌劑。 【鑒別】 (1)取本品，按照重組人胰島素項(xiàng)下的鑒別項(xiàng)試驗(yàn)，顯相同的結(jié)果。 (2)在苯酚或間甲酚檢查項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液中苯酚峰或 間甲酚峰的保留時(shí)間應(yīng)與苯酚或間甲酚對(duì)照品的保留時(shí)間一致。 【

30、檢查】 1,有關(guān)物質(zhì) 取本品，每1ml中加9.6mol/L鹽酸溶液3位酸化，混 勻后作為供試品溶液；取供試品溶液適量(約相當(dāng)于人胰島素2單位)， 按照重組人胰島素項(xiàng)下的方法檢查，扣除苯酚峰和間甲酚峰，按面積歸一 化法計(jì)算，A21脫酰胺人胰島素不得過(guò)2.0%,其他有關(guān)物質(zhì)總量不得過(guò) 6.0%0 2,高分子蛋白質(zhì) 取本品，每1ml加9.6mol/L鹽酸溶液3pL酸化， 混勻后作為供試品溶液；取供試品溶液100PL,按照重組人胰島素項(xiàng)下方 法檢查，除去保留時(shí)間大于人胰島素主峰的其它峰面積，保留時(shí)間小于人 胰島素主峰的所有峰面積之和不得過(guò)2.0%。 3,鋅： 取本品適量，用O.Olmol/L鹽

31、酸溶液制成每1ml含鋅約0.4? 0.8四的溶液作為供試品溶液,按照重組人胰島素項(xiàng)下的方法檢查，每100 單位中含鋅量應(yīng)為10?40pg。 4,苯酚或間甲酚： 取苯酚或間甲酚（純度）99.5%）,精密稱(chēng)定，用 0.01mol/L鹽酸溶液定量稀釋制成每1ml中約含苯酚或間甲酚 0.25mg的溶液，作為苯酚或間甲酚對(duì)照品溶液；精密量取本品適量，用 0.01mol/L鹽酸溶液定量稀釋成每1ml約含苯酚或間甲酚0.25mg的溶 液，作為供試品溶液。按照重組人胰島素效價(jià)測(cè)定項(xiàng)下方法檢查，檢測(cè)波 長(zhǎng)為270nmo取重組人胰島素對(duì)照品適量，用苯酚或間甲酚對(duì)照品溶液 制成每1ml中含重組人胰島素Img的溶液

32、，取20口1注入液相色譜儀， 苯酚峰、間甲酚峰與人胰島素主峰的分離度應(yīng)符合要求。精密量取苯酚或 間甲酚對(duì)照品溶液與供試品溶液各20PL,分別注入液相色譜儀，記錄色 譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。每1ml含苯酚或間甲酚應(yīng)為2.00? 2.75mgo 九、包裝 生物制品包裝規(guī)程 1 .同一車(chē)間有數(shù)條包裝生產(chǎn)線同時(shí)進(jìn)行包裝時(shí)，各包裝線之間應(yīng)有隔離設(shè) 施。外觀相似的制品不得在相鄰的包裝線上包裝。每條包裝線均應(yīng)標(biāo)明正 在包裝的藥品名稱(chēng)、批號(hào)。 2 .藥品的內(nèi)包裝和外包裝標(biāo)簽的內(nèi)容、格式應(yīng)符合國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén) 的有關(guān)規(guī)定。 3 .包裝制品應(yīng)在25七以下進(jìn)行。有專(zhuān)門(mén)規(guī)定者應(yīng)按各論執(zhí)行。 4 .瓶簽要求貼牢，直接印字的制品要求字跡清楚，不易脫落或模糊，瓶簽 內(nèi)容不得用粘貼、剪貼的方式進(jìn)行修改或補(bǔ)充。 5 .制品包裝全部完成后，在未收到產(chǎn)品合格證前，應(yīng)在待檢區(qū)封存。收到 合格證后，方可填寫(xiě)入庫(kù)單，交送成品庫(kù)。 6 .每個(gè)最小包裝盒內(nèi)均應(yīng)附有藥品說(shuō)明書(shū)。 7 .藥品說(shuō)明書(shū)應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥品管理法》與國(guó)家藥品監(jiān)督管理 部門(mén)對(duì)藥品說(shuō)明書(shū)的規(guī)定，并根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)的內(nèi)容編 寫(xiě)。 小組成員： 沈迪、曾宇、屠言貝、張鉉英、張寒光、溫馨、謝丹、王亮杰、郭正兵、 周明毅 查資料：全體 ppt制作：沈迪 文稿：張鉉英