《52《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》參考課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《52《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》參考課件（50頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、課題課題2 2多聚酶鏈式反應擴增多聚酶鏈式反應擴增DNADNA片斷片斷一、基礎知識一、基礎知識（一）（一）DNADNA分子的結構分子的結構C C、H H、O O、N N、P P1 1、組成元素、組成元素脫氧核苷酸脫氧核苷酸2 2、基本單位、基本單位3 3、脫氧核苷酸結構、脫氧核苷酸結構脫氧核脫氧核苷酸苷酸脫氧核苷脫氧核苷磷酸磷酸脫氧核糖脫氧核糖含氮含氮堿基堿基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鳥嘌呤（鳥嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T） 一個核苷酸上的一個核苷酸上的磷酸基團上的磷酸基團上的“OH”O(jiān)H”和和另一個另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基核苷酸

2、分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子之間失去一分子水，形成水，形成磷酸二脂鍵，磷酸二脂鍵，即在即在相鄰的相鄰的兩個脫氧核苷酸的兩個脫氧核苷酸的33和和55碳原子碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數量龐大的四種脫之間形成磷酸二脂鍵。數量龐大的四種脫氧核苷酸通過氧核苷酸通過33、55、磷酸二脂鍵彼此連接起來形、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。成脫氧核苷酸鏈。通常將通常將DNADNA的羥基的羥基“OH”O(jiān)H”末端稱為末端稱為33端，而磷酸基團的末端稱為端，而磷酸基團的末端稱為55端端4 4、多脫氧核苷酸鏈得形成、多脫氧核苷酸鏈得形成脫氧核苷酸結構式脫氧核苷酸結構式OOPOHO堿基堿基OOHOOP

3、OHOOH堿基堿基533553多脫氧核苷酸鏈結構簡圖多脫氧核苷酸鏈結構簡圖5 5、DNADNA分子的雙螺旋結構分子的雙螺旋結構 DNA DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3355，另一條鏈為，另一條鏈為5 5 33）脫氧核苷酸長鏈盤）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結構旋而成的規(guī)則雙螺旋結構 脫氧核糖與磷酸交替連結，排列在外側，構脫氧核糖與磷酸交替連結，排列在外側，構成基本骨架；堿基排列在鏈的內側成基本骨架；堿基排列在鏈的內側 兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結起來，形成堿兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定基對。

4、堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對6 6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算、利用堿基互補配對規(guī)律的計算 規(guī)律一：規(guī)律一：DNADNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等，雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等，任意兩個互補的堿基之和相等即任意兩個互補的堿基之和相等即A=TA=T，G=CG=C。任意兩個。任意兩個不互補的堿基之和恒等，占堿基總數的不互補的堿基之和恒等，占堿基總數的50%50%。即：。即：A+GA+GT+CT+CA+CA+CT+GT+G50%50%，（，（A+GA+G）/(T+C)/(T+C)(A+C)/(G+T)(A+C)/

5、(G+T)(T+C)/(A+G)(T+C)/(A+G)1 1 規(guī)律二：在規(guī)律二：在DNADNA雙鏈中的一條單鏈雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)(A+G)/(T+C)的的值與另一條互補鏈的值與另一條互補鏈的 (A+G) /(T+C)(A+G) /(T+C)的值互為倒數關的值互為倒數關系系 規(guī)律三：規(guī)律三：DNADNA雙鏈中，一條單鏈的雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的的值與另一條互補鏈的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與的值是相等的，也與整個整個DNADNA分子中的分子中的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C

6、)的值相等的值相等（二）（二）DNADNA分子的特性分子的特性1 1、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性 在在DNADNA分子雙螺旋結構的內側，分子雙螺旋結構的內側，通過通過氫鍵氫鍵形形成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯起來聯起來 例題：甲例題：甲DNADNA分子中，分子中，A A和和T T占占2525，G G和和C C占占75%75%，乙乙DNADNA分子中，分子中，G G和和C C占占2525， A A和和T T 占占75%75%，哪一個穩(wěn)，哪一個穩(wěn)定？定？ 答：甲答：甲DNADNA分子比乙分子比乙DNADNA分子穩(wěn)定。因為分子穩(wěn)定。因為A A與與T T之間之間

7、形成兩個氫鍵，形成兩個氫鍵，在在G G和和C C之間形成三個氫鍵，之間形成三個氫鍵，三個氫鍵三個氫鍵比兩個氫鍵穩(wěn)定，所以在比兩個氫鍵穩(wěn)定，所以在DNADNA分子中含有較多的分子中含有較多的G GC C堿基對比含有較多的堿基對比含有較多的A AT T堿基穩(wěn)定堿基穩(wěn)定2 2、多樣性、多樣性 構成構成DNADNA分子的堿基對的數量不同，堿基對的排分子的堿基對的數量不同，堿基對的排列順序千變萬化列順序千變萬化 例題：如果有例題：如果有40004000個堿基對，堿基對有多少種排個堿基對，堿基對有多少種排列方式？列方式？答：堿基對排列方式有答：堿基對排列方式有4 440004000種種3 3、特異性、特異

8、性 不同的不同的DNADNA分子由于堿基對的排列順序存在差異，分子由于堿基對的排列順序存在差異，因此每一個因此每一個DNADNA分子的堿基對都有其特定的排列順序，分子的堿基對都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物生物(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的比值是特定的的比值是特定的（三）（三）DNADNA的復制的復制2 2、時期、時期有絲分裂間期減數第一次分裂前的間期有絲分裂間期減數第一次分裂前的間期3 3、場所、場所細胞核（主）、線粒體、葉綠體細胞核（主）、線粒體、葉綠體4 4、模板、模板DNADNA母鏈母

9、鏈1 1、概念、概念由一個由一個DNADNA形成兩個完全相同的形成兩個完全相同的DNADNA的過程的過程5 5、原材料、原材料脫氧核苷酸脫氧核苷酸6 6、基本條件、基本條件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、復制過程、復制過程 DNA DNA的解旋的解旋 親代親代DNADNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈的雙鏈 RNA RNA引物的合成引物的合成 以單股以單股DNADNA為模板，在引物酶的作用下合成小段為模板，在引物酶的作用下合成小段的的RNARNA引物引

10、物 DNA DNA的生成的生成 以單股的以單股的DNADNA為模板，在為模板，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，在在RNARNA引物的末端由引物的末端由55端端33端合成端合成DNADNA。切掉引物生成岡崎片斷切掉引物生成岡崎片斷 在核酸酶的作用下切掉引物。在在核酸酶的作用下切掉引物。在DNADNA聚合酶的作聚合酶的作用下將引物部位換上用下將引物部位換上DNADNA，此時的，此時的DNADNA片斷稱為岡崎片斷稱為岡崎片斷片斷 DNA DNA片斷的連接片斷的連接 在在DNADNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的成一條完整的新的D

11、NADNA鏈。新鏈與舊鏈構成新的鏈。新鏈與舊鏈構成新的DNADNA邊解旋邊復制邊解旋邊復制( (過程）過程）8 8、復制特點、復制特點半保留復制（結果）半保留復制（結果）9 9、遵循原則、遵循原則堿基互補配對原則堿基互補配對原則1010、精確復制的原因、精確復制的原因1111、復制的意義、復制的意義 DNA DNA分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的

12、進行 一條雙鏈一條雙鏈DNADNA分子，復制分子，復制N N次，形成的子代次，形成的子代DNADNA分子中，含親代分子中，含親代DNADNA母鏈的有兩個母鏈的有兩個DNADNA分子，占子代分子，占子代DNADNA總數的總數的2/22/2N N；親代；親代DNADNA分子母鏈兩條，占子代分子母鏈兩條，占子代DNADNA中脫氧核苷酸鏈總數的中脫氧核苷酸鏈總數的2/2 2/2 N+1N+1= 1/2= 1/2N N 設一條設一條DNADNA分子中有胸腺嘧啶為分子中有胸腺嘧啶為m m個，則該個，則該DNADNA復制復制n n次后，形成子代次后，形成子代DNADNA分子需游離的胸腺嘧啶為分子需游離的胸腺

13、嘧啶為T=(2T=(2N N-1)m-1)m1212、DNADNA復制過程中的等量關系復制過程中的等量關系（四）（四） PCR(PCR(多聚酶鏈式反應）多聚酶鏈式反應）1 1、 DNADNA聚合酶聚合酶特性特性 不能從頭合成不能從頭合成DNADNA，只能從，只能從DNADNA的的33端開始延伸端開始延伸DNADNA鏈，因此，鏈，因此， DNADNA復制需要引物復制需要引物2 2、 DNADNA聚合酶聚合酶作用過程作用過程 當引物與當引物與DNADNA母鏈通過堿基互補配對結合后，母鏈通過堿基互補配對結合后， DNADNA聚合酶就能從引物的聚合酶就能從引物的33端開始延伸端開始延伸DNADNA鏈，

14、鏈，DNADNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的55端向端向33端延伸端延伸3 3、 PCRPCR原理原理 在在8080100100C C的溫度范圍內，的溫度范圍內， DNADNA的雙螺旋結的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性 當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNADNA鏈又鏈又會重新結合成雙鏈會重新結合成雙鏈 PCR PCR利用了利用了DNADNA的熱變性原理，通過控制溫度的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現在使用的來控制雙鏈的解聚與結合，現在使用的PCRPCR儀實質上儀實質上也是一臺能

15、夠自動調控溫度的儀器也是一臺能夠自動調控溫度的儀器 高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNADNA聚合酶失活的問題，耐高溫的聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNATaq DNA聚合酶解聚合酶解決了高溫導致決了高溫導致DNADNA聚合酶失活的問題，促成了聚合酶失活的問題，促成了PCRPCR技技術的自動化術的自動化4 4、 Taq DNATaq DNA聚合酶的應用聚合酶的應用5 5、 緩沖液需要為緩沖液需要為PCRPCR反應提供的物質反應提供的物質 DNA DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，

16、耐熱的物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNADNA聚合酶，同時通聚合酶，同時通過控制溫度使過控制溫度使DNADNA復制在體外反復進行復制在體外反復進行 PCR PCR技術是技術是8080年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。技術。 它具有特異、敏感、產率高、它具有特異、敏感、產率高、 快速、快速、 簡便、簡便、重復性好、易自動化等突出重復性好、易自動化等突出 6 6、 PCRPCR技術的特點技術的特點7 7、細胞內和細胞外細胞內和細胞外DNADNA復制環(huán)境的區(qū)別復制環(huán)境的區(qū)別體內體內DNADNA的復制的復制體外的模擬體外的模擬模板（母鏈）模板（母鏈）細胞內源細胞內源外源加

17、入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP細胞內源細胞內源外源加入外源加入聚合酶聚合酶細胞內源細胞內源外源加入外源加入反應環(huán)境反應環(huán)境細胞內環(huán)境細胞內環(huán)境緩沖液緩沖液 PCR PCR過程需要的引物不是過程需要的引物不是RNARNA，而是人工合，而是人工合成的成的DNADNA單鏈，其長度通常為單鏈，其長度通常為20203030個脫氧核苷酸個脫氧核苷酸8 8、細胞內復制和、細胞內復制和PCRPCR不同點不同點 PCR PCR過程中過程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現的過對反應溫度的控制來實現的（五）（五）

18、 PCRPCR的反應過程的反應過程1 1、PCRPCR的反應步驟的反應步驟 PCR PCR一般經歷三十多次循環(huán)，一般經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為每次循環(huán)可以分為三個基本步驟三個基本步驟變性、復性和延伸變性、復性和延伸變性（模板變性（模板DNADNA解旋）解旋） 模板模板DNADNA經加熱至經加熱至90900 0C C以上。一定時間后，使模以上。一定時間后，使模板板DNADNA雙鏈或經雙鏈或經PCRPCR擴增形成的雙鏈擴增形成的雙鏈DNADNA解離，使成為解離，使成為單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備2 2、循環(huán)過程、循環(huán)過程靶序列靶序列靶

19、序列靶序列PCR PCR 循環(huán)第一步循環(huán)第一步 ：加熱變性：加熱變性復性（退火）復性（退火） 模板模板DNADNA經加熱變性成單鏈后，溫度降到經加熱變性成單鏈后，溫度降到50500 0C C左左右，引物與模板右，引物與模板DNADNA單鏈的互補序列配對結合單鏈的互補序列配對結合靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5533555533553333PCR PCR 循環(huán)第二步循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火：引物與靶序列退火延伸延伸 DNA DNA模板引物結合物在模板引物結合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配以脫氧核苷酸為原料

20、，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNADNA鏈鏈靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物553 3555533553333Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循環(huán)第三步循環(huán)第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列 靶序列靶序列第第1 1個個 PCR PCR 循環(huán)完成后循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列：得到兩個拷貝的靶序列循環(huán)循環(huán)次數次數DNADNA數量數量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243

21、3、3030次循環(huán)后靶序列擴增的數量次循環(huán)后靶序列擴增的數量4 4、PCR PCR 循環(huán)的結果循環(huán)的結果 DNA DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的之間的DNADNA序列，使這段固定長度的序列呈指數擴增序列，使這段固定長度的序列呈指數擴增 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也作從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應，并且由引物為模板參與反應，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA單鏈單鏈會與引物會與引物結合，進行結合，進行DNADNA的延伸的延伸二、二、 PCR PCR 的實驗操作的實驗操作1 1、PCRPCR儀儀（一）設備及用具

22、（一）設備及用具實質上一臺能夠實質上一臺能夠自動調控溫度自動調控溫度的儀器的儀器2 2、微量離心管、微量離心管一種一種薄壁塑料管薄壁塑料管，總容積為，總容積為0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量轉移定量轉移PCRPCR配方中的配方中的液體，液體，其上的其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次一次性吸液槍頭用一次更換一次PCRPCR儀儀微量離心管微量離心管微量移液器微量移液器1 1、準備、準備2 2、移液、移液（二）實驗操作步驟（二）實驗操作步驟 按照按照PCRPCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上在實驗桌上 用微量移液器按照用微量

23、移液器按照PCRPCR反應體系配方往微量反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑離心管里面加入各種試劑過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁擊管壁注意：注意：3 3、混合、混合 B B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻使反應液混合均勻 A A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢落或液體外溢將離心管放入將離心管放入PCRPCR儀上，設置好儀上，設置好PCRPCR儀的循環(huán)程序儀的循環(huán)程序過程：將微量離心管放在離心機上過程：將微量離心管放在

24、離心機上, ,離心約離心約10s10s4 4、離心、離心5 5、反應、反應離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果反應效果循環(huán)數循環(huán)數變性變性復性復性延伸延伸第一次第一次949410min10min3030次次4430s30s555530s30s72721min1min最后一次最后一次441min1min555530s30s72721min1min PCR PCR技術技術高度靈敏，高度靈敏，為了避免外源為了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干擾實驗，污染而造成干擾實驗，PCRPCR操作時要注意做到：操作時要注意做到：6 6、注意事

25、項、注意事項 隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌； 分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭（一）理論上（一）理論上DNADNA擴增數目的計算擴增數目的計算三、課題成果評價三、課題成果評價1 1 、一條、一條DNADNA，復制，復制n n次，次， DNADNA為為2 2 n n2 2 、 a a條條DNADNA，復制，復制n n次，次， DNADNA為為a x2 a x2 n n（二）實驗中（二）實驗中DNADNA含量的測定含量的測定1 1、原

26、理、原理 可以通過計算可以通過計算DNADNA含量來評價擴增的效果，含量來評價擴增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與小與DNADNA的含量有關的含量有關2 2 、過程、過程稀釋稀釋 2uLPCR 2uLPCR反應液，加入反應液，加入98uL98uL蒸餾水，即將樣品蒸餾水，即將樣品進行進行5050倍稀釋倍稀釋對照調零對照調零 以蒸餾水作為空白對照，在波長以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm260nm處，將處，將紫外分光光度計的讀數調節(jié)至零紫外分光光度計的讀數調節(jié)至零 取取DNADNA稀釋液稀釋液100uL

27、100uL至比色杯中，測定至比色杯中，測定260nm260nm處的處的光吸收值光吸收值計算計算計算計算DNADNA含量（含量（ g g）50 x(260nm50 x(260nm的讀數）的讀數） x x 稀釋倍數稀釋倍數5050：1 1 g g /ml /ml的的DNADNA在厚度為在厚度為1cm1cm比色杯中的吸光值為比色杯中的吸光值為0.020.02比色杯比色杯四、四、 課題延伸課題延伸 例如：例如：PCRPCR產物每輪循環(huán)增加一倍，產物每輪循環(huán)增加一倍，3030輪循環(huán)輪循環(huán)擴增量達擴增量達2 23030個拷貝（個拷貝（10109 9拷貝）拷貝） PCR PCR技術是技術是8080年代中期發(fā)

28、展起來的體外核酸擴增年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。技術。 它具有特異、敏感、產率高、它具有特異、敏感、產率高、 快速、快速、 簡便、簡便、重復性好、易自動化等突出特點重復性好、易自動化等突出特點五、實驗小結五、實驗小結 PCRPCR儀加熱使（儀加熱使（ ）變性）變性, , 復性使引物與模板復性使引物與模板DNADNA（ ）, ,延伸需將反應溫度升至中溫延伸需將反應溫度升至中溫( ),( ),在在（ ）的作用下）的作用下, ,以（以（ ）為原）為原料料, ,以（以（ ）為復制的起點）為復制的起點, ,合成新鏈。合成新鏈。 如此重復改如此重復改變反應溫度變反應溫度, ,經（經（ ）三個階段為一個）三個階段為一個循環(huán)循環(huán), ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數放大一倍每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數放大一倍, ,一般樣品是經過一般樣品是經過3030次循環(huán)次循環(huán), ,最終使基因放大了數百萬最終使基因放大了數百萬倍倍; ; 將擴增產物進行電泳將擴增產物進行電泳, ,經溴化乙錠染色經溴化乙錠染色, ,在紫外燈在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNADNA帶。帶。模板模板互補互補TaqTaq聚合酶聚合酶四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸引物引物變性、復性和延伸變性、復性和延伸7272