《高中生物 第1部分 專題5 課題3 血紅蛋白的提取和分離課件 新人教版選修1》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《高中生物 第1部分 專題5 課題3 血紅蛋白的提取和分離課件 新人教版選修1（40頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第第1部部分分專專題題5課課題題3理解教材理解教材新知新知把握熱點(diǎn)把握熱點(diǎn)考向考向應(yīng)用創(chuàng)新應(yīng)用創(chuàng)新演練演練知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)二知識(shí)點(diǎn)二考向一考向一考向二考向二 1.透析法分離蛋白質(zhì)的目的是除去小分子透析法分離蛋白質(zhì)的目的是除去小分子 雜質(zhì)。雜質(zhì)。 2利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，相對(duì)利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，相對(duì) 分子質(zhì)量大的先洗脫出來，相對(duì)分子分子質(zhì)量大的先洗脫出來，相對(duì)分子 質(zhì)量小的后洗脫出來。質(zhì)量小的后洗脫出來。3在電泳中，待分離樣品中分子帶電性質(zhì)的差異以及分在電泳中，待分離樣品中分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀都會(huì)影響分子的遷移速度。子本身的大小、形狀都會(huì)影響分子的遷移速

2、度。4SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移速率完全取決于分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移速率完全取決于分子的大小。的大小。5蛋白質(zhì)提取和分離的一般步驟是：樣品處理與粗分蛋白質(zhì)提取和分離的一般步驟是：樣品處理與粗分離、純化和純度鑒定。離、純化和純度鑒定。6在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定時(shí)，使用最多的方法是在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定時(shí)，使用最多的方法是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。 自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 形狀和大小形狀和大小電荷電荷親和力親和力1蛋白質(zhì)分離的理論依據(jù)蛋白質(zhì)分離的理論依據(jù) 2分離的方法分離的方法 (1)凝膠色譜法：根據(jù)凝膠色譜法：根據(jù) 分離蛋白分離蛋白質(zhì)的一種有效方法，也稱做質(zhì)的一

3、種有效方法，也稱做 法。法。 (2)電泳：電泳： 概念：指概念：指 在電場(chǎng)的作用下發(fā)生在電場(chǎng)的作用下發(fā)生 的過程。的過程。 原理：在一定的原理：在一定的 下，多肽、核酸等生物大分下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上 ，在電場(chǎng)的作用下，這，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。的電極移動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小分配色譜分配色譜帶電粒子帶電粒子遷移遷移pH正電或負(fù)電正電或負(fù)電相反相反影響電泳效果的因素：影響電泳效果的因素：帶電性質(zhì)帶電性質(zhì)大小大小形狀形狀遷移速度遷移速度 方法：常用的電泳方法有方法：常用的電

4、泳方法有 電泳和電泳和 電泳。電泳。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠酰胺凝膠 3緩沖溶液緩沖溶液 (1)配制：由配制：由12種種 溶解于水中配制而成，通溶解于水中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的過調(diào)節(jié)緩沖劑的 就可以得到不同就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用范圍內(nèi)使用的緩沖液。的緩沖液。 (2)作用：在一定范圍內(nèi)，抑制外界的作用：在一定范圍內(nèi)，抑制外界的 對(duì)溶液對(duì)溶液pH的影響，維持的影響，維持pH基本不變?；静蛔?。緩沖劑緩沖劑使用比例使用比例酸和堿酸和堿 跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1凝膠色譜法凝膠色譜法 (1)凝膠：是一些微小多孔的球體，內(nèi)含許多貫穿的凝膠：是一些微小多孔的球體，內(nèi)含許多貫

5、穿的通道，具有多孔的凝膠，又稱為分子篩。通道，具有多孔的凝膠，又稱為分子篩。 (2)原理：原理：相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小相對(duì)分子質(zhì)量小直徑直徑大小大小大于凝膠顆?？障吨睆?，大于凝膠顆?？障吨睆?，被排阻在外面被排阻在外面小于凝膠顆?？障吨睆?，小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)方式方式垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度速度較快較快較慢較慢運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)路程路程較短較短較長(zhǎng)較長(zhǎng)洗脫洗脫次序次序先從凝膠柱洗脫出來先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來 2電泳的常用方法電泳的常用方法 (1)瓊脂糖凝膠電

6、泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場(chǎng)中的遷移速率因各種分子的帶電性質(zhì)差異、各種分子在電場(chǎng)中的遷移速率因各種分子的帶電性質(zhì)差異、分子大小、形狀不同而不同，從而得以分離。分子大小、形狀不同而不同，從而得以分離。 (2)聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：凝膠形成：凝膠形成：?jiǎn)误w單體(丙烯酰胺丙烯酰胺) 交聯(lián)劑交聯(lián)劑(N，N亞甲基雙丙烯酰胺亞甲基雙丙烯酰胺) 引發(fā)劑和催化劑引發(fā)劑和催化劑三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠 加入加入SDS的作用：使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成的作用：使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)單

7、條肽鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDS所所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量，掩蓋了帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。的大小。 特別提醒特別提醒測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量通常用測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量通常用SDS聚聚丙烯酰胺凝膠電泳，原因是在一定濃度范圍內(nèi)聚丙烯酰胺丙烯酰胺凝膠電泳，原因是在一定濃度范圍內(nèi)聚丙烯酰胺對(duì)熱穩(wěn)定性強(qiáng)，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。對(duì)熱穩(wěn)定性強(qiáng)，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。 自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 雜蛋白雜蛋白1樣品處理樣品處理 (1)

8、紅細(xì)胞的洗滌：紅細(xì)胞的洗滌： 目的：去除目的：去除 ，以利于后續(xù)步驟的分離純化。，以利于后續(xù)步驟的分離純化。 措施：分離措施：分離(低速短時(shí)間離心低速短時(shí)間離心)用膠頭吸管吸去上層用膠頭吸管吸去上層透明黃色血漿透明黃色血漿下層暗紅色的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌下層暗紅色的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌(如此如此重復(fù)三次重復(fù)三次)。(2)血紅蛋白的釋放：血紅蛋白的釋放：目的：使紅細(xì)胞破裂釋放目的：使紅細(xì)胞破裂釋放 。過程：過程：血紅蛋白血紅蛋白離心離心濾紙濾紙脂溶性沉淀層脂溶性沉淀層分液漏斗分液漏斗 2粗分離粗分離透析透析 (1)方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析

9、袋放入一定量適宜濃度的磷酸緩沖液中，透析放入一定量適宜濃度的磷酸緩沖液中，透析12 h。 (2)目的：將目的：將 的雜質(zhì)除去。的雜質(zhì)除去。 (3)原理：透析袋能使原理：透析袋能使 自由進(jìn)出，而將自由進(jìn)出，而將 保留在袋內(nèi)。保留在袋內(nèi)。小分子小分子大分子大分子物質(zhì)物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較小相對(duì)分子質(zhì)量較小 3純化純化 通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。 (1)凝膠色譜柱的制作：凝膠色譜柱的制作： 取長(zhǎng)取長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。 柱底制作：打孔柱底制作：打孔挖凹穴挖凹穴安

10、裝安裝 覆蓋尼龍網(wǎng)，覆蓋尼龍網(wǎng)，再用再用100目尼龍紗包好。目尼龍紗包好。 柱頂制作：打孔柱頂制作：打孔安裝玻璃管。安裝玻璃管。 組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝，并在下端出口連接帶組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝，并在下端出口連接帶開關(guān)的尼龍管，尼龍管放入收集器。開關(guān)的尼龍管，尼龍管放入收集器。移液管頭部移液管頭部 (2)凝膠色譜柱的裝填：凝膠色譜柱的裝填： 色譜柱固定于支架上。色譜柱固定于支架上。 干凝膠的計(jì)算和稱量。干凝膠的計(jì)算和稱量。 溶脹：干凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成溶脹：干凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成 。 裝填：打開裝填：打開 ，將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色，將凝膠懸浮液一次性緩慢倒

11、入色譜柱內(nèi)。譜柱內(nèi)。 洗滌平衡：裝填完后，立即連接洗脫瓶，用洗滌平衡：裝填完后，立即連接洗脫瓶，用20 mmol/L的的磷酸緩沖液洗滌平衡凝膠磷酸緩沖液洗滌平衡凝膠12 h。凝膠懸浮液凝膠懸浮液下端出口下端出口 (3)樣品的加入和洗脫：樣品的加入和洗脫： 調(diào)整緩沖液面：與調(diào)整緩沖液面：與 平齊平齊 滴加透析樣品：用量為滴加透析樣品：用量為1 mL 樣品滲入凝膠床：樣品完全進(jìn)入凝膠層樣品滲入凝膠床：樣品完全進(jìn)入凝膠層 洗脫：打開下端出口，用洗脫：打開下端出口，用 洗脫洗脫 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱 時(shí)，用試管時(shí)，用試管收集流出液，每試管收集流出液，每試管5 m

12、L，連續(xù)收集，連續(xù)收集凝膠面凝膠面磷酸緩沖液磷酸緩沖液底端底端 4純度鑒定純度鑒定 在鑒定的方法中，使用最多的是在鑒定的方法中，使用最多的是 電泳。電泳。SDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 1洗滌紅細(xì)胞時(shí)能否用蒸餾水代替生理鹽水？洗滌紅細(xì)胞時(shí)能否用蒸餾水代替生理鹽水？ 提示：提示：不能。生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定而不不能。生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂，在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細(xì)胞如果提前至于破裂，在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細(xì)胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。分離的難度。

13、2在血紅蛋白釋放的過程中加入蒸餾水和甲苯的目在血紅蛋白釋放的過程中加入蒸餾水和甲苯的目的是什么？的是什么？ 提示：提示：加入蒸餾水使紅細(xì)胞吸水漲破。細(xì)胞膜的主要加入蒸餾水使紅細(xì)胞吸水漲破。細(xì)胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有機(jī)溶劑，加入甲苯能成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有機(jī)溶劑，加入甲苯能加速紅細(xì)胞破裂以釋放血紅蛋白。加速紅細(xì)胞破裂以釋放血紅蛋白。 3血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？離有什么意義？ 提示：提示：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候

14、應(yīng)該收集洗脫液。這使可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1對(duì)血液樣品處理后樣品發(fā)生的變化對(duì)血液樣品處理后樣品發(fā)生的變化 (1)正?，F(xiàn)象：由于血紅蛋白與氧氣結(jié)合呈鮮紅色，與二正?，F(xiàn)象：由于血紅蛋白與氧氣結(jié)合呈鮮紅色，與二氧化碳結(jié)合呈暗紅色，所以剛分離的血紅蛋白溶液呈紅色。氧化碳結(jié)合呈暗紅色，所以剛分離的血紅蛋白溶液呈紅色。 (2)分層不明顯的原因：洗滌次數(shù)少，未完全除去血漿蛋分層不明顯的原因：洗滌次數(shù)少，未完全除去血漿

15、蛋白。白。 (3)紅細(xì)胞不純凈的原因：離心速度過高或時(shí)間過長(zhǎng)，使紅細(xì)胞不純凈的原因：離心速度過高或時(shí)間過長(zhǎng)，使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀而造成。白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀而造成。2判斷裝填的凝膠色譜柱成功與否判斷裝填的凝膠色譜柱成功與否 3對(duì)分離效果的判斷對(duì)分離效果的判斷 (1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。 (2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功。分離效果不好，裝填不成功。 特別提醒特

16、別提醒洗脫液的流速是影響分離效果的重要因洗脫液的流速是影響分離效果的重要因素之一，如果樣品出現(xiàn)渾濁、有沉淀，可離心或過濾后再素之一，如果樣品出現(xiàn)渾濁、有沉淀，可離心或過濾后再加樣，洗脫液應(yīng)維持流速的恒定，即維持洗脫液加在色譜加樣，洗脫液應(yīng)維持流速的恒定，即維持洗脫液加在色譜柱上的壓力恒定。柱上的壓力恒定。 例例1 下圖表示對(duì)某蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行下圖表示對(duì)某蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果凝膠電泳的結(jié)果(相似于紙層析法分離色素相似于紙層析法分離色素)，下列相關(guān)敘，下列相關(guān)敘述不正確的是述不正確的是 () A蛋白質(zhì)上某些基團(tuán)解離后可使蛋白蛋白質(zhì)上某些基團(tuán)解離后可使蛋白質(zhì)帶電，電場(chǎng)

17、中帶電的蛋白質(zhì)分子質(zhì)帶電，電場(chǎng)中帶電的蛋白質(zhì)分子(或或多肽多肽)會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) B蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠中的遷聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度完全取決于其所帶凈電荷多少移速度完全取決于其所帶凈電荷多少 C蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度基本聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度基本取決于相對(duì)分子質(zhì)量的大小取決于相對(duì)分子質(zhì)量的大小 D電泳結(jié)果表明溶液中蛋白質(zhì)可能有兩種，但也可電泳結(jié)果表明溶液中蛋白質(zhì)可能有兩種，但也可能只有一種能只有一種 解析解析蛋白質(zhì)的氨基與羧基可發(fā)生解離，使其帶正蛋白質(zhì)的氨基與羧基可發(fā)生解離，使其帶正電或負(fù)電，在電

18、場(chǎng)中發(fā)生遷移。電或負(fù)電，在電場(chǎng)中發(fā)生遷移。SDS聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳所加的泳所加的SDS可完全掩蓋蛋白質(zhì)本身所帶電荷，故其移動(dòng)可完全掩蓋蛋白質(zhì)本身所帶電荷，故其移動(dòng)速度與本身所帶電荷無關(guān)，而由其分子大小決定。速度與本身所帶電荷無關(guān)，而由其分子大小決定。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳會(huì)使蛋白質(zhì)水解成肽鏈，故結(jié)果所示聚丙烯酰胺凝膠電泳會(huì)使蛋白質(zhì)水解成肽鏈，故結(jié)果所示可能只有一種蛋白質(zhì)可能只有一種蛋白質(zhì)(有兩種肽鏈有兩種肽鏈)，也可能是兩種蛋白質(zhì)。，也可能是兩種蛋白質(zhì)。 答案答案B 蛋白質(zhì)在凝膠色譜柱中行進(jìn)的速度和途徑主要與蛋蛋白質(zhì)在凝膠色譜柱中行進(jìn)的速度和途徑主要與蛋白質(zhì)分子的大小相關(guān)；在

19、電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)速度和方向除了白質(zhì)分子的大小相關(guān)；在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)速度和方向除了與蛋白質(zhì)的分子大小相關(guān)外，蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、與蛋白質(zhì)的分子大小相關(guān)外，蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀都影響其在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度。形狀都影響其在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度。 例例2 凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣物學(xué)、生

20、物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題：用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題： (1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是洗脫出來的是_，原因是，原因是_。 (2)自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由_替代。替代。 (3)裝填凝膠色譜柱時(shí)，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存裝填凝膠色譜柱時(shí)，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是在，原因是_。 (4)洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡

21、凝膠所用的液體洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體_(填填“相同相同”或或“不同不同”)，洗脫時(shí)，對(duì)洗脫液的流速，洗脫時(shí)，對(duì)洗脫液的流速要求是要求是_。 (5)若選用若選用SephadexG75，則，則“G”表示表示_，75表示表示_。 解析解析本題主要考查凝膠色譜法的原理和操作注意本題主要考查凝膠色譜法的原理和操作注意事項(xiàng)，可按以下思路進(jìn)行分析作答。事項(xiàng)，可按以下思路進(jìn)行分析作答。 (1)原理：由于不同蛋白質(zhì)其相對(duì)分子質(zhì)量不同，相原理：由于不同蛋白質(zhì)其相對(duì)分子質(zhì)量不同，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，只能在對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程短

22、，速度快，易洗脫；相對(duì)分子質(zhì)量凝膠外部移動(dòng)，路程短，速度快，易洗脫；相對(duì)分子質(zhì)量較小的則進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程長(zhǎng)，速度慢。較小的則進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程長(zhǎng)，速度慢。 (2)注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 凝膠色譜柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆蓋尼龍凝膠色譜柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆蓋尼龍網(wǎng)和網(wǎng)和100目的尼龍紗，相當(dāng)于多孔板。目的尼龍紗，相當(dāng)于多孔板。 凝膠色譜柱的裝填：裝填時(shí)盡量緊密，不得有氣泡凝膠色譜柱的裝填：裝填時(shí)盡量緊密，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。分離效果。 裝填材料即交聯(lián)葡聚糖凝膠的特點(diǎn)及表示方法

23、。裝填材料即交聯(lián)葡聚糖凝膠的特點(diǎn)及表示方法。 樣品的加入和洗脫：洗脫時(shí)和浸泡凝膠所用液體均樣品的加入和洗脫：洗脫時(shí)和浸泡凝膠所用液體均是物質(zhì)的量濃度為是物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液，洗脫時(shí)，對(duì)的磷酸緩沖液，洗脫時(shí)，對(duì)洗脫液的流速要求保持穩(wěn)定。洗脫液的流速要求保持穩(wěn)定。 答案答案(1)aa相對(duì)分子質(zhì)量較大，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量較大，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快較快 (2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗尼龍網(wǎng)和尼龍紗 (3)氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分

24、離效果離效果 (4)相同保持穩(wěn)定相同保持穩(wěn)定 (5)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5 g (1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果不理想，需要重做時(shí)，必須進(jìn)行凝膠色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果不理想，需要重做時(shí)，必須進(jìn)行凝膠色譜柱的重新裝填。一般情況下，凝膠不會(huì)與其他溶質(zhì)發(fā)生任何譜柱的重新裝填。一般情況下，凝膠不會(huì)與其他溶質(zhì)發(fā)生任何作用，因此，在一次分離以后，稍加平衡就可以進(jìn)行下一次的作用，因此，在一次分離以后，稍加平衡就可以進(jìn)行下一次的操作。平衡時(shí)，需用操作。平衡時(shí)，需用3倍柱體積的洗脫液過柱。倍柱體積的洗脫液過柱。 (2)如果實(shí)驗(yàn)操作中有一些雜質(zhì)污染了色譜柱，可以用物如果實(shí)驗(yàn)操作中有一些雜質(zhì)污染了色譜柱，可以用物質(zhì)的量濃度為質(zhì)的量濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉和物質(zhì)的量濃度為的氫氧化鈉和物質(zhì)的量濃度為0.5 mol/L的氯化鈉混合液處理交聯(lián)葡聚糖凝膠。的氯化鈉混合液處理交聯(lián)葡聚糖凝膠。 (3)如果凝膠長(zhǎng)期不用，可以加入抑菌劑低溫保存，使用如果凝膠長(zhǎng)期不用，可以加入抑菌劑低溫保存，使用時(shí)再進(jìn)行充分的平衡。時(shí)再進(jìn)行充分的平衡。