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1、單元整合提升單元整合提升 1.限制酶選擇時的兩種特例(1)限制酶具有特異性，一般情況下，不同限制酶切割形成的黏性末端不同。但也有不同限制酶處理后形成的黏性末端相同，可以用DNA連接酶進行連接。如GGATCC和GATC，識別的序列不同，但處理后形成的黏性末端相同。(2)一般情況下，用同一種限制酶分別處理質(zhì)粒和目的基因，使其具有相同的黏性末端。但如果都用相同的兩種限制酶分別處理，也可形成分別對應(yīng)的相同黏性末端，例如目的基因的兩端分別有BamH 和Hind的酶切位點，質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點。如圖所示：學法指導學法指導構(gòu)構(gòu)建基因表達載體時限制酶的選擇方法建基因表達載體時限制酶的選擇方法 2.限制酶選

2、擇的注意事項(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst。 不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇Sma。 為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst 和EcoR 兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切點)。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。插入的目的基因的表達需要調(diào)控序列，用作載體的質(zhì)粒的插入基因部位之前需有啟動子，之后需有終止子，所以所選限制酶的切點應(yīng)該“前有啟動子，后有

3、終止子”。質(zhì)粒作為運載體必須具備標記基因、啟動子和終止子等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶Sma 會破壞標記基因；如果所選限制酶的切點不是一個，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復(fù)制?！镜淅?下表中列出了幾種限制酶的識別序列及其切割位點，圖1、圖2中的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。下列說法錯誤的是 ()。限制酶 BamHHind EcoRSma識別序列及切割位點GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATT CC TTAAGCCCGGGGGGCCC A.一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割

4、后，含有4個游離的磷酸基團 B.用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割 C.為防止酶切后單個含目的基因的DNA片段自身連接成環(huán)狀，圖2所示的外源DNA不能使用EcoR切割 D.為了獲取重組質(zhì)粒，可用BamH 和Hind同時切割質(zhì)粒和外源DNA 解析本題主要考查考生對基因工程的操作工具限制酶的理解。圖1所示質(zhì)粒被Sma切割后形成2個黏性末端，根據(jù)DNA分子兩條鏈反向平行的特點可知，切割后應(yīng)含有2個游離的磷酸基團，故A錯誤。若用Sma切割圖1中的質(zhì)粒和圖2中的目的基因，會分別破壞質(zhì)粒中的標記基因和目的基因；用一種限制酶處理的目的基因會因兩端含有相同黏性末端而可能發(fā)生自身環(huán)化，用兩種限制酶同時切割質(zhì)粒和外源DNA即可解決這一問題，所以可以用BamH和Hind同時處理。 答案A