基因工程乙肝疫苗的制備 【摘要】基因工程乙肝疫苗是通過構(gòu)建含有乙肝表面抗原的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞，制備乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介紹基因工程疫苗-重組酵母乙肝疫苗制備的基本原理和工藝流程，以及乙肝疫苗的純度分析方法。【關(guān)鍵詞】 乙肝疫苗 重組質(zhì)粒 工藝流程1.基因工程乙肝疫苗產(chǎn)生背景疫苗是人類目前可以徹底消滅某一疾病的唯一武器，接種疫苗被認(rèn)為是最有效、最經(jīng)濟(jì)的疾病預(yù)防手段。發(fā)展中國家消滅乙型肝炎免疫接種計(jì)劃實(shí)施指南中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行區(qū)，因此，唯一的策略就是有效地減少乙肝的流行，最終消滅乙肝”世界衛(wèi)生組織肝炎專家及計(jì)劃免疫全球咨詢組認(rèn)為：控制全球乙型肝炎及減少死亡的策略是開展大規(guī)模的嬰兒及學(xué)齡前兒童的乙肝疫苗接種。我國衛(wèi)生部制定的目標(biāo)是從92年開始在全國逐步推行乙型肝炎（HB）計(jì)劃免疫。92年全國共生產(chǎn)血源疫苗1500萬人份，尚不能滿足新生兒接種需要，如考慮其他人群，缺口更大。為了實(shí)現(xiàn)HB計(jì)劃目標(biāo)，進(jìn)一步為控制全球HB做出貢獻(xiàn)，我們必須大規(guī)模提高HB疫苗的產(chǎn)量和進(jìn)一步提高質(zhì)量。血源HB疫苗原料為無癥狀帶毒者的HBsAg陽性血漿。血源價(jià)格昂貴，供應(yīng)量有限，采集困難。因此血源疫苗的產(chǎn)量和成本受到原料的限制。利用基因工程重組微生物細(xì)胞表達(dá)HBsAg生產(chǎn)HB疫苗的技術(shù)，原料易得，價(jià)廉，適宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，有可能大幅度降低成本。2.使用重組酵母的原因和重組酵母構(gòu)建2.1使用重組酵母的原因使用重組酵母進(jìn)行乙肝疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，有如下幾點(diǎn)原因：酵母度ng物制02059 （1）.酵母對培養(yǎng)基的要求低，價(jià)廉易得。（2）.酵母細(xì)胞生長快，故生產(chǎn)率高。（3）.動(dòng)物細(xì)胞生長慢，容易染菌，對操作要求嚴(yán)。（4）.酵母系統(tǒng)容易放大，動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)放大難。2.2重組酵母構(gòu)建HBV只有3200bp，為雙鏈的DNA,是一個(gè)相當(dāng)小的病毒。其基因組共有四個(gè)ORF，編碼以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重組酵母可用以下方法：目的基因分離重組質(zhì)粒的構(gòu)建（切，接）導(dǎo)入酵母細(xì)胞（轉(zhuǎn)）培養(yǎng)酵母細(xì)胞（增）檢測正確表達(dá)目的產(chǎn)物的酵母（檢）（1）.根據(jù)已經(jīng)測定的編碼乙肝病毒表面抗原決定簇基因序列，用化學(xué)合成法直接合成目的基因或者通過鳥槍法克隆目的基因。用識(shí)別相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶將外源DNA和質(zhì)粒分子切開。（切）（2）.用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段連接到質(zhì)粒分子上，構(gòu)成DNA重組分子。（接）（3）.借組細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入酵母細(xì)胞內(nèi)。（轉(zhuǎn)）（4）.短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子。（增）（5）.篩選和鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的酵母細(xì)胞，獲得外源基因高效表達(dá)的基因工程菌。（檢）3.酵母表達(dá)的HBsAg之特性重組酵母表達(dá)的HBsAg在沒有化學(xué)處理的條件下自發(fā)地構(gòu)成平均直徑為22nm的球形顆粒。這些顆粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂構(gòu)成的脂基。其氨基酸的構(gòu)成、羥基和氨基酸末端序列分析、質(zhì)譜儀分析的肽譜等表明，重組酵母忠實(shí)地表達(dá)和生產(chǎn)了HBsAg。酵母生產(chǎn)的HBsAg在細(xì)胞內(nèi)以顆粒形式存在，其中的亞單位通過非共價(jià)鍵不緊密地結(jié)合在一起。在細(xì)胞外它轉(zhuǎn)變成第二種形式，即單個(gè)多肽通過二硫鍵結(jié)合成二聚體，最后二聚體之間形成二硫鍵，得到二硫鍵交聯(lián)的顆粒。它在表觀上、化學(xué)性質(zhì)和免疫性等方面都與血源HBsAg類似。HBsAg比大部分生物分子要大，但比細(xì)胞要小，很適宜用膜分離方法純化。HBsAg表現(xiàn)出很強(qiáng)的疏水性，可用硫酸銨或聚乙二醇進(jìn)行分步沉淀，或用疏水層析純化。HBsAg含有大量的二硫鍵，是其對熱穩(wěn)定的主要原因。在制備血源疫苗時(shí)，可運(yùn)用長時(shí)間保溫法以滅活HBV。但在制備重組HBsAg時(shí)沒有必要?？蛇x用更加溫和的條件。HBsAg對蛋白酶的抵抗力很強(qiáng)，可在pH為2的時(shí)候耐胰蛋白酶的處理。HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可進(jìn)行梯度離心分離。4.疫苗的工作原理任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理：（1）.將疫苗注射到人體內(nèi)，疫苗通常含有已經(jīng)死亡或者弱化的病毒。而乙肝疫苗就是一類沒有感染能力的病毒蛋白，能引起機(jī)體的特異性反應(yīng)。（2）.免疫系統(tǒng)識(shí)別出體內(nèi)的外來物質(zhì)（病毒和細(xì)菌），這些外來物質(zhì)也被稱之為抗原。（3）.一旦發(fā)現(xiàn)抗原，免疫系統(tǒng)就分泌出被稱為抗體的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在血液中流動(dòng)，將抗原殺死以消滅身體感染的病毒（或者與病毒蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，使之失去生物活性）?？贵w是由淋巴細(xì)胞制造的。這些細(xì)胞也被稱為B細(xì)胞，它的主要功能是產(chǎn)生能夠特異性與抗原結(jié)合的抗體。（4）.人體會(huì)儲(chǔ)存這些抗體，淋巴細(xì)胞也會(huì)有記憶這種特殊抗原的功能。所以再次染病時(shí)，它們會(huì)及時(shí)消滅此種疾病的病毒，然而抗體的針對性很強(qiáng)，所以曾經(jīng)接種過乙肝疫苗的人，面對其他疾病時(shí)仍舊會(huì)感染（值得注意的是：當(dāng)人體感染真正的病毒時(shí)，抗體會(huì)不停繁殖，直到病毒最終被消滅。而疫苗會(huì)提供數(shù)量恰到好處的抗原，以幫助人體完成識(shí)別病毒和免疫反應(yīng)的過程，從而使人體能夠?qū)@種病毒免疫）。5.疫苗制備工藝5.1.菌種制備和發(fā)酵用成功構(gòu)造的基因工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過逐級(jí)放大至發(fā)酵罐。發(fā)酵過程應(yīng)該具有下列特點(diǎn)：原料以碳水化合物為主，不含有毒物質(zhì)，并加入少量有機(jī)和無機(jī)氮源；能容易進(jìn)行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生產(chǎn)；生物反應(yīng)過程是以生命體的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式進(jìn)行的，多個(gè)反應(yīng)像一個(gè)反應(yīng)一樣，在單一設(shè)備中進(jìn)行；生產(chǎn)過程中，通常常溫進(jìn)行，操作溫和，不考慮防爆問題；能夠高度選擇性的進(jìn)行復(fù)雜化合物在特定部分的反應(yīng)，如氧化、還原、官能團(tuán)導(dǎo)入；生產(chǎn)過程中考慮防止雜菌的污染。發(fā)酵過程中，可采用分批補(bǔ)料或連續(xù)流加補(bǔ)料以保證最優(yōu)生長和維持細(xì)胞濃度、生長速度和營養(yǎng)供應(yīng)之間的適當(dāng)平衡?？商砑诱T導(dǎo)劑如乳糖到發(fā)酵液中去以誘導(dǎo)可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的表達(dá)。有人對重組酵母表達(dá)的HBsAg的影響進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)在碳源中降低葡萄糖濃度，補(bǔ)充甘油和蔗糖能較明顯地改善比活值和HBsAg的相對濃度。將發(fā)酵前期、中期和后期溫度分別控制在27、33、25；發(fā)酵從pH4.5開始，逐步上升到pH6；以及維持溶氧濃度在最適水平（70%飽和度），都可以提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性和HBsAg在發(fā)酵液中的積累。當(dāng)然，需要根據(jù)不同菌種發(fā)酵的最適條件、培養(yǎng)基異同、當(dāng)?shù)貤l件等各種因素適當(dāng)對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行微調(diào)，以保證發(fā)酵的順利高效進(jìn)行。5.2.分離純化和純度測定工藝雖然我們已經(jīng)有從人血中分離純化HBsAg的豐富經(jīng)驗(yàn)，但由于重組酵母表達(dá)的抗原是在細(xì)胞內(nèi)，存在的量相當(dāng)小，僅占酵母蛋白、核酸和脂的5%不到，酵母細(xì)胞和培養(yǎng)基的成分與血漿有很大不同，為了從重組酵母中得到高純度的抗原，有必要研究、探索新的純化工藝。對于血源性乙肝疫苗分離純化的重點(diǎn)是除去活性污染物或使其失活，對于基因工程乙肝疫苗而言是去除細(xì)胞和培養(yǎng)基成分。下圖表示文獻(xiàn)報(bào)道的國外工業(yè)化生產(chǎn)重組酵母乙肝疫苗的工藝路線，可作為技術(shù)開發(fā)的參考。工藝1： 疏水層析細(xì)胞破碎微濾超濾硅膠吸附硫氰酸鹽處理無菌過濾氫氧化鋁共沉淀分裝發(fā)酵結(jié)束后，通過過濾或離心，使酵母與發(fā)酵液分離，然后細(xì)胞通過高壓勻漿機(jī)破碎，釋放出抗原。酵母的細(xì)胞壁較厚，比大腸桿菌難破碎，可在高壓勻漿機(jī)內(nèi)施加幾千個(gè)大氣壓力，通過針形閥突然降壓到零，使細(xì)胞破碎。在細(xì)胞破碎前加入蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。細(xì)胞破碎后加入表面活性劑使抗原溶解。粗細(xì)胞裂解物用0.2um中空纖維柱進(jìn)行微濾。抗原和大部分低分子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過濾膜，細(xì)胞碎片被膜攔截。濾液再進(jìn)行超濾，此時(shí)抗原被膜攔截而低分子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過濾膜除去。殘留的表面活性劑通過吸附在一種聚苯乙烯小珠上除去。再用硅膠吸附抗原，用熱硼酸緩沖液洗脫。純化最后一步是用丁基瓊脂糖進(jìn)行疏水層析。純化后的抗原用硫氰酸鹽處理以完成二硫鍵的交聯(lián)。純化后的抗原再與氫氧化鋁共沉淀，在共沉淀時(shí)，抗原吸附在氫氧化鋁上。除了上述一種工藝外，某些文獻(xiàn)中還提到如下兩種：工藝2：細(xì)胞破碎表面活性劑提取沉降離心超濾凝膠層析離子交換超濾無菌過濾分裝氫氧化鋁吸附 工藝3：細(xì)胞破碎超濾排阻層析離子交換超離心脫鹽無菌過濾氫氧化鋁吸附分裝三種工藝大致相同，不同之處在于：工藝2在細(xì)胞破碎之后經(jīng)過二步沉淀和離心除去大部分雜質(zhì)和所有細(xì)胞碎片，然后通過超濾濃縮。用陰離子交換層析去除DNA是該工藝的一個(gè)關(guān)鍵步驟。 工藝3用吐溫80處理破碎細(xì)胞，細(xì)胞碎片通過離心除去，上清超濾濃縮，用體積排阻層析和離子交換純化以除去核酸，并進(jìn)一步做氯化銫梯度等密度離心，然后脫鹽。因HBsAg的體積大，適宜采用體積排阻層析純化。但如果用于大規(guī)模生產(chǎn)的話，層析住體積會(huì)很大，要求在純化工藝的最后階段，對產(chǎn)品進(jìn)行濃縮，以減小其體積。用免疫層析也可以分離酵母源HBsAg。柱中的抗體是從羊血中純化來的。用人血HBsAg免疫羊，將羊的IgG通過一根含有血源HBsAg的親和層析柱純化抗HBsAg抗體。這種方法，即用一種抗原制備抗體，再用此抗體純化另一種不同來源的抗原，可保證最后的親和層析柱不會(huì)含有酵母雜質(zhì)的抗體。5.3.疫苗純度的測定乙肝疫苗是通過肌肉注射的方式進(jìn)入人體系統(tǒng)，為了降低疫苗內(nèi)雜質(zhì)含量對人體產(chǎn)生的不良影響，必須進(jìn)行疫苗的純度檢測。乙肝疫苗表面抗原的純度檢定是疫苗質(zhì)量控制的關(guān)鍵手段之一。目前分析測定重組乙型肝炎疫苗純度的HPLC常用方法是應(yīng)用TSK-G5000PW分子篩。中國藥品生物制品檢定所疫苗二室曾報(bào)道應(yīng)用該系統(tǒng)對Merck釀酒酵母重組乙肝疫苗和CHO細(xì)胞重組乙肝疫苗進(jìn)行純度分析，可獲得良好的分離效果。對重組漢遜酵母乙肝疫苗，現(xiàn)有的HPLC檢測系統(tǒng)應(yīng)用0.1mol/L DTT與1:50吐溫80等量混合處理后能有效地檢測不同類型重組乙肝疫苗表面抗原的純度。5.4疫苗的保存疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在28下能保存12個(gè)月，但當(dāng)溫度升高后，效力很快降低。在37下，許多疫苗只能穩(wěn)定幾天或者幾個(gè)小時(shí)，非常不利于在室溫下運(yùn)輸。為了使疫苗的穩(wěn)定性提高，可用凍干的方法使之干燥。這樣，疫苗的有效期往往可延長1倍或以上，在室溫下其效價(jià)的損失亦較慢。凍干要點(diǎn)是：（1）冷凍，即將疫苗冷凍至共熔點(diǎn)以下。（2）真空升華，即在真空狀態(tài)下降水分直接由固態(tài)升華為氣態(tài)。（3）升溫緩慢，即升溫的過程盡量緩慢，不使疫苗在任何時(shí)間下有融解的情況發(fā)生。（4）凍干好的疫苗應(yīng)在真空或充氮?dú)夂竺芊獗４?，使其殘余水分保持?%以下。這樣的疫苗能保持良好的穩(wěn)定性。6.結(jié)語國內(nèi)已規(guī)模化生產(chǎn)預(yù)防用基因乙肝疫苗重組乙型肝炎疫苗，免疫性強(qiáng)、安全性好、母嬰傳播阻斷率高。自主研制的國家一類新藥治療性乙肝DNA疫苗已進(jìn)入臨床研究，這是國內(nèi)首次批準(zhǔn)用于人體的DNA疫苗試驗(yàn)；第一個(gè)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療用合成肽乙肝疫苗也已經(jīng)正式進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。全國肝炎治療用藥市場規(guī)模約200億元，乙肝疫苗市場容量可維持在4000萬人份左右，基因工程乙肝疫苗具有廣闊的前景。