考點75 蛋白質(zhì)的提取與分離 1蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)分子的形狀、大?。浑姾尚再|(zhì)和多少；溶解度；吸附性質(zhì)；對其他分子親和力。2凝膠色譜法（1）材料：凝膠多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 （2）步驟：混合物上柱洗脫大分子流動快、小分子流動慢收集大分子收集小分子原理：當相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。3緩沖溶液（1）概念：在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的溶液。（2）作用：能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的pH的影響，維持pH基本不變。（3）配制：通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。由弱酸和相應的強堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。（4）本實驗使用的是磷酸緩沖液(NaH2PO4/Na2HPO4)，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和科學研究（活性）。4電泳法（1）概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。（2）原理：分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（3）類型：瓊脂糖凝膠電泳法：由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場中遷移速度決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀的不同。聚丙烯酰胺凝膠電泳法：在凝膠中加入SDS，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復合物，使其遷移速度完全取決于分子的大小。5實驗操作實驗操作的基本步驟：樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。（一）樣品處理（1）紅細胞的洗滌：目的：去除雜蛋白。為防止血液凝固，應先加入檸檬酸鈉。所用洗滌液：是五倍體積的生理鹽水（質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液）。緩慢攪拌，采用低速短時間離心。洗滌干凈的標準是上清液沒有黃色。（2）血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯的作用下，紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。（3）分離血紅蛋白溶液：（方法）離心。試管中的溶液分為4層，從上往下依次是：無色透明的甲苯層。白色薄層固體：脂溶性物質(zhì)沉淀層。紅色透明液體：血紅蛋白溶液層。暗紅色沉淀層：紅細胞破碎物沉淀。（4）透析：方法：取1 mL血紅蛋白溶液裝入透析袋，將透析袋放入盛有300 mL物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7）中，透析12 h。目的：去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。原理：透析袋能使小分子自由進出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作制作步驟：打孔挖穴安管覆網(wǎng)紗包插管。（2）凝膠色譜柱的裝填材料：實驗所用凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠。方法：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有氣泡存在。然后用300 mL物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡12 h，使凝膠裝填緊密。（3）樣品的加入和洗脫使吸管管口沿管壁將樣品緩慢加入色譜柱內(nèi)，不要破壞凝膠面。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱低端時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。 考向一 蛋白質(zhì)提取與分離的方法及原理 1下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白實驗的敘述，錯誤的是A該實驗的材料必須選用雞血B通過透析法可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C凝膠色譜法是利用蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)D電泳法是利用各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子的大小差異分離蛋白質(zhì)【參考答案】A 2已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種蛋白質(zhì)分子，分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量情況如圖所示，下列有關(guān)蛋白質(zhì)分離的敘述正確的是 A若將樣品以2 000 r/min的速度離心10 min，分子戊在沉淀中，則丙也一定在沉淀中B若用凝膠色譜法分離樣品中的蛋白質(zhì)，則分子甲移動速度最快C將樣品裝入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋內(nèi)，則乙也一定保留在袋內(nèi)D若用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)，則分子甲和分子丁形成的電泳帶相距最遠【答案】A 考向二 蛋白質(zhì)提取與分離的實驗操作 3紅細胞中含有大量血紅蛋白，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗來提取和分離血紅蛋白。下列對血紅蛋白提取和分離的敘述，錯誤的是A血紅蛋白提取和分離一般按照“樣品處理粗分離純化純度鑒定”的順序進行B純化過程中要用生理鹽水充分溶脹凝膠來配制凝膠懸浮液C樣品處理過程中用蒸餾水的目的是使紅細胞吸水漲破釋放出血紅蛋白D可經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定【參考答案】B【試題解析】血紅蛋白提取和分離一般按照“樣品處理粗分離純化純度鑒定”的順序進行，A正確；純化過程中要用緩沖溶液充分溶脹凝膠來配制凝膠懸浮液，B錯誤；樣品處理過程中用蒸餾水的目的是使紅細胞吸水漲破釋放出血紅蛋白，C正確；可經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定，D正確。易錯警示1紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。3凝膠的預處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡。4色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。 4血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，負責血液中O2或CO2的運輸。請根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。 （1）將實驗流程補充完整：A為_，B為_。凝膠色譜法是根據(jù)_而達到蛋白質(zhì)分離的有效方法。（2）洗滌紅細胞的目的是去除_，洗滌次數(shù)過少，無法除去_；離心速度過高和時間過長會使_一同沉淀，達不到分離的效果。洗滌干凈的標志是_。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是_。（3）在洗脫過程中加入物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH為7.0)的目的是_。如果紅色區(qū)帶_，說明色譜柱制作成功?！敬鸢浮浚?）血紅蛋白的釋放 樣品的加入和洗脫 相對分子質(zhì)量的大?。?）雜蛋白(血漿蛋白) 血漿蛋白 白細胞和淋巴細胞 離心后的上清液中沒有黃色 蒸餾水和甲苯（3）準確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內(nèi)一致 均勻一致地移動【解析】（1）血紅蛋的提取與分離的實驗步驟主要有樣品處理：紅細胞的洗滌血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液透析；粗分離；純化：凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的裝填樣品的加入和洗脫；純度鑒定聚丙烯酰胺膠電泳。所以A表示血紅蛋白的釋放，B表示樣品的加入和洗脫。凝膠色譜法的原理是分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。所以凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量大小而達到蛋白質(zhì)分離的有效 1蛋白質(zhì)的分離與提純技術(shù)是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)，下列有關(guān)敘述不正確的A根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的特性，可將樣品中各種不同蛋白質(zhì)分離B根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小，可通過電泳分離蛋白質(zhì)C根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)D根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì)2蛋白質(zhì)提取過程中有關(guān)透析的敘述，錯誤的是A用于透析的薄膜要具有選擇透過性B透析膜一般是用硝酸纖維素制成的C透析能使小分子自由出入，而將大分子保留在袋內(nèi)D透析可用于更換樣品的緩沖液3下列關(guān)于凝膠色譜法的原理及操作不正確的是A是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法B在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部而最先流出，而小分子可以進入凝膠內(nèi)部而流速緩慢，以致最后流出C凝膠內(nèi)部有很微細的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離的物質(zhì)分子的大小無相應關(guān)系D一般情況下，凝膠對要分離的物質(zhì)沒有吸附作用，因此所有要分離的物質(zhì)都應該被洗脫出來4將處理破裂后的紅細胞混合液以2 000 r/min的速度離心10 min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是A血紅蛋白、甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、細胞破碎物沉淀層B甲苯層、細胞破碎物沉淀層、血紅蛋白、脂質(zhì)物質(zhì)層C脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、甲苯層、細胞破碎物沉淀層D甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、細胞破碎物沉淀層5為了提取血紅蛋白，從學校附近的屠宰場取新鮮的豬血，對豬血處理的正確操作是A要在采血容器中預先加入抗凝血劑檸檬酸鈉B取血回來后，馬上進行高速長時間離心C將離心后的血細胞加入清水緩慢攪拌D重復洗滌直到上清液呈紅色為止6相對分子質(zhì)量不同的兩種蛋白質(zhì)在凝膠色譜柱中的行進過程，可表示為圖中哪一個ABCD7下列有關(guān)血紅蛋白的提取與分離的實驗操作的敘述，正確的是A分離紅細胞時采用低速長時間離心B紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水即可C分離血紅蛋白溶液要低速短時間離心D透析時要用20 mmol/L的磷酸緩沖液，透析12 h8鐮刀型細胞貧血癥是一種由基因突變引起的遺傳病，患者的紅細胞是彎曲的鐮刀狀。這樣的紅細胞容易破裂，使人患溶血性貧血，嚴重時會導致死亡。某科學興趣小組計劃從血紅蛋白的成分是否變化來開展研究性學習。下列是該小組成員獲得純度很高的血紅蛋白的實驗過程，不正確的一項是A對紅細胞進行洗滌，在加入蒸餾水和甲苯使紅細胞破裂釋放出血紅蛋白后，將混合液靜置一段時間后分層獲得血紅蛋白溶液B將血紅蛋白溶液裝入透析袋中透析，可達到粗分離的目的C利用凝膠色譜操作對血紅蛋白進行純化D使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行純度鑒定，以獲得純度很高的血紅蛋白9如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實驗裝置。請據(jù)圖回答下列問題： （1）血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，它在紅細胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質(zhì)的_功能。（2）甲裝置用于_，目的是_。用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫_，是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。（3）甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是_；乙裝置中，C溶液的作用是_。（4）用乙裝置分離血紅蛋白時，待_時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。10紅細胞內(nèi)含有大量血紅蛋白，我們可以選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白。請回答下列有關(guān)問題：（1）血紅蛋白的提取和分離一般可分為四步：_、粗分離、純化和_。（2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行處理、離心后，收集血紅蛋白溶液。以上所述的過程即是樣品處理，它包括紅細胞的洗滌、_、_。（3）收集的血紅蛋白溶液要進行粗分離，其方法是_。然后通過_將樣品進一步純化，最后經(jīng)_進行純度鑒定。（4）如圖是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品加入和洗脫示意圖。請據(jù)圖回答下列問題。 在加樣品示意圖中，正確的順序是_。用吸管加樣品時，應注意正確操作，分別是_、_、_。待_時，才加入緩沖溶液。待_接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每_mL收集一管，連續(xù)收集。 1【答案】A【解析】蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜，但溶液中的小分子物質(zhì)則可以透過半透膜，因此可以將蛋白質(zhì)和溶液中的小分子物質(zhì)分離，A項錯誤。電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程，根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小，可通過電泳使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分離，B項正確。凝膠色譜法的原理是：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快，而分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢，所以可以根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，通過凝膠色譜法使大分子的蛋白質(zhì)先洗脫出來，小分子的蛋白質(zhì)后洗脫出來，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分離，C項正確。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法使不同密度的蛋白質(zhì)分子位于不同層次的離心液中，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離，D項正確。2【答案】A 3【答案】C【解析】凝膠內(nèi)部有很微細的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小決定了被分離的物質(zhì)分子的運輸路徑，從而實現(xiàn)了物質(zhì)的分離，C錯誤。4【答案】D【解析】將處理破裂后的紅細胞混合液以2 000 r/min的速度離心10 min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是甲苯層、脂質(zhì)物質(zhì)層、血紅蛋白、細胞破碎物沉淀層，D正確。5【答案】A【解析】為了防止血液凝固，要在采血容器中預先加入抗凝血劑檸檬酸鈉，A正確；取血后，應進行低速短時間離心，B錯誤；離心后的血細胞加入蒸餾水和40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌，使紅細胞破裂，C錯誤；紅細胞重復洗滌直到上清液不再呈現(xiàn)黃色為止，D錯誤。6【答案】B【解析】相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程長，移動的速度慢，相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程短，移動的速度快，B正確。7【答案】D【解析】分離紅細胞應采用低速短時間離心，防止白細胞與紅細胞一同沉淀，A錯誤；紅細胞釋放血紅蛋白，需加入蒸餾水和40%體積的甲苯，再在磁力攪拌器上充分攪拌10 min，B錯誤；分離血紅蛋白要高速長時間離心，C錯誤；透析時要用20 mmol/L的磷酸緩沖液，透析12 h，D正確。8【答案】A 9【答案】（1）運輸（2）透析（粗分離） 去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 凝膠色譜法 相對分子質(zhì)量的大?。?）磷酸緩沖溶液 洗脫血紅蛋白（4）紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱的底端【解析】（1）血紅蛋白具有運輸O2的作用，體現(xiàn)了蛋白質(zhì)的運輸功能。（2）甲是透析裝置，用于透析，其目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較少的雜質(zhì)，使大分子蛋白質(zhì)保留在袋中。乙是利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的裝置，是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。（3）甲所示的透析裝置中，透析袋內(nèi)的B是血紅蛋白溶液，則透析袋外的A是磷酸緩沖溶液。乙裝置中的C為緩沖溶液，其作用是洗脫血紅蛋白。（4）由于血紅蛋白帶有紅色，當紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱的底端時，用試管收集血紅蛋白，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。10【答案】（1）樣品處理 純度鑒定（2）血紅蛋白的釋放 分離血紅蛋白溶液 （3）透析 凝膠色譜法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （4） 不能破壞凝膠面 貼著管壁加樣 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 樣品完全進入凝膠層 紅色的蛋白質(zhì) 5【解析】（1）血紅蛋白的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。（2）樣品處理包括紅細胞洗滌、血紅蛋白釋放、分離血紅蛋白溶液和透析四步。（3）收集的血紅蛋白溶液要通過透析的方法進行粗分離；樣品的純化是通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，最后 11