課后限時集訓(xùn)40 基因工程1科學(xué)工作者將某種海蜇的DNA分子上一段長度為5 170個堿基對的片段綠色熒光蛋白基因，轉(zhuǎn)入到夾竹桃細(xì)胞中，培育出一種夜間發(fā)光的夾竹桃。培育過程如圖所示，回答有關(guān)問題。(1)構(gòu)建圖中的重組Ti質(zhì)粒，還需用到的基因工程基本工具是_。作為受體農(nóng)桿菌應(yīng)_，以方便篩選已導(dǎo)入重組Ti質(zhì)粒的受體農(nóng)桿菌。在將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌之前，先要用Ca2處理農(nóng)桿菌，其目的是使其成為_細(xì)胞。(2)圖中將綠色熒光蛋白基因?qū)電A竹桃細(xì)胞的方法稱為_。轉(zhuǎn)基因夾竹桃幼苗對青霉素_(填“具有”或“不具有”)抗性，原因是_。(3)綠色熒光蛋白基因含有_，因此在農(nóng)桿菌細(xì)胞中不能正常表達(dá)，而在夾竹桃細(xì)胞中能正常表達(dá)。解析(1)構(gòu)建圖中的重組Ti質(zhì)粒，還需用到的基因工程基本工具是限制性核酸內(nèi)切酶(或限制酶)、DNA連接酶。由于Ti質(zhì)粒上含有抗青霉素基因，故作為受體農(nóng)桿菌應(yīng)不含抗青霉素基因(或?qū)η嗝顾孛舾?，以便根據(jù)質(zhì)粒上的標(biāo)記基因篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。在將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌之前，先要用Ca2處理農(nóng)桿菌，其目的是使其成為感受態(tài)細(xì)胞，易于吸收周圍環(huán)境中的外源DNA分子。(2)圖示中將綠色熒光蛋白基因?qū)電A竹桃細(xì)胞的方法稱為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。根據(jù)圖示可知目的基因插入在了質(zhì)粒上的T­DNA片段，由于T­DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，所以插入在T­DNA中的目的基因被導(dǎo)入夾竹桃細(xì)胞并整合到了染色體DNA上，而抗青霉素基因沒有進(jìn)入夾竹桃細(xì)胞，故轉(zhuǎn)基因夾竹桃幼苗對青霉素不具有抗性。(3)綠色熒光蛋白基因來自真核生物，含有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后需要將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分在細(xì)胞核進(jìn)行剪切，而農(nóng)桿菌為原核生物，不具備該剪切功能，因此在農(nóng)桿菌細(xì)胞中不能正常表達(dá)，而在夾竹桃細(xì)胞中能正常表達(dá)。答案(1)限制性核酸內(nèi)切酶(或限制酶)、DNA連接酶不含有抗青霉素基因(或?qū)η嗝顾孛舾?感受態(tài)(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法不具有農(nóng)桿菌(或重組Ti質(zhì)粒)中只有T­DNA才能進(jìn)入夾竹桃細(xì)胞，而抗青霉素基因沒有進(jìn)入夾竹桃細(xì)胞(3)內(nèi)含子2幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}：(1)在進(jìn)行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是_。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是_。(2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_。(3)若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是_(答出兩點(diǎn)即可)。(4)當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是_。(5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是_。(6)目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物安全性的爭論主要集中在_安全、_安全和_安全三個方面，而這三個方面的爭論發(fā)生的原因主要還是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因生物的特性及其對現(xiàn)存生物和自然環(huán)境的影響具有很大的不確定性。例如，由于_，因此在轉(zhuǎn)基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果。解析(1)與老葉相比，嫩葉組織細(xì)胞易破碎，容易提取到幾丁質(zhì)酶的mRNA。提取RNA時，提取液中添加RNA酶抑制劑可防止RNA被RNA酶催化降解。(2)以mRNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對原則，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，通過逆轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄)可以獲得cDNA。(3)因該目的基因是通過逆轉(zhuǎn)錄形成的，無表達(dá)所需的啟動子，也無在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)等，所以在受體細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在和表達(dá)，也不能遺傳下去。(4)構(gòu)建基因表達(dá)載體時，DNA連接酶能催化目的基因和質(zhì)粒載體這兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。(5)轉(zhuǎn)基因植株的基因組中含有幾丁質(zhì)酶基因，但該植株抗真菌的能力并沒有提高，可能是由于轉(zhuǎn)錄或翻譯異常，即幾丁質(zhì)酶基因未能正常表達(dá)。(6)目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物安全性的爭論主要集中在食物安全、生物安全和環(huán)境安全三個方面。由于外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機(jī)的，加之轉(zhuǎn)移的基因不少都是異種生物的基因，因此在轉(zhuǎn)基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果。答案(1)嫩葉組織細(xì)胞易破碎防止RNA降解(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對的原則可以合成cDNA(3)目的基因無復(fù)制原點(diǎn)；目的基因無表達(dá)所需啟動子(4)磷酸二酯鍵(5)目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常(6)食物生物環(huán)境外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機(jī)的(轉(zhuǎn)移的基因不少都是異種生物的基因)3(2019·安徽省宣城市高三期末)煙草是有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙子葉植物，易受TMV(煙草花葉病毒)感染而大幅度減產(chǎn)。絞股藍(lán)細(xì)胞中含有抗TMV基因，能抵抗TM感染。研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了抗TM煙草，操作流程如圖所示。(1)表示遺傳信息流動中的_過程，所需原料為_。過程所需要的工具酶是_。(2)大量擴(kuò)增目的基因可以使用PCR技術(shù)，該技術(shù)包括變性、退火、延伸三個步驟，變性這一步驟的目的是_。(3)過程最常用的方法是_，過程用到的細(xì)胞工程技術(shù)是_。(4)過程還需要進(jìn)行基因工程操作步驟中的_，其中，在個體水平上檢驗(yàn)獲得的煙草能否抗TMV的方法是_。解析(1)表示以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成DNA的過程，所需原料為DNA的單體：4種脫氧核苷酸。過程構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程需要用同種限制酶切割目的基因與運(yùn)載體，用相同的DNA連接酶連接目的基因與運(yùn)載體的末端。(2)PCR技術(shù)中的變性是利用高溫使DNA發(fā)生變性，解旋形成單鏈。(3)過程將目的基因?qū)胫参矬w細(xì)胞的方法常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，過程受體細(xì)胞通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到再生植株。(4)過程從再生植株中篩選成功轉(zhuǎn)基因的抗TMV煙草植株還需要進(jìn)行基因工程操作步驟中的目的基因的檢測與鑒定；其中，若從個體水平鑒定獲得的煙草能否抗TMV，可通過接種煙草花葉病毒的方法來確定。答案(1)逆轉(zhuǎn)錄四種脫氧核苷酸限制酶和DNA連接酶(2)使DNA解旋為單鏈(DNA解旋)(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法植物組織培養(yǎng)(4)目的基因的檢測與鑒定用TMV感染煙草，觀察煙草是否被感染(患病)4國際水稻研究所人員從產(chǎn)量低的耐淹水稻中找到一種耐淹基因，將其移入到高產(chǎn)熱帶水稻中，終于培育出耐淹的高產(chǎn)水稻品系，其產(chǎn)量比高產(chǎn)熱帶水稻產(chǎn)量還要高。耐淹基因移入的方法可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)。請回答下列相關(guān)問題：(1)為培育耐淹的高產(chǎn)水稻品系，應(yīng)需將耐淹基因進(jìn)行體外擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中加入了熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等，還加入耐淹基因作為_，加入_作為合成DNA的原料。(2)質(zhì)粒常被用作運(yùn)載體，因?yàn)橘|(zhì)粒具有_(答2點(diǎn)即可)。構(gòu)建耐淹基因的質(zhì)粒表達(dá)載體時，常用不同的限制酶對耐淹基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割，目的是_。(3)根據(jù)耐淹基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，研究人員通過對它的氨基酸序列設(shè)計(jì)并人工合成耐淹基因。與水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在結(jié)構(gòu)上缺少了_。雖然兩種基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物不同，但最終表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)，可能原因是_。(4)蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)的原因是_。解析(1)利用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增耐淹基因(目的基因)時，在PCR反應(yīng)體系中除了加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等外，還加入耐淹基因作為模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作為合成DNA的原料。(2)質(zhì)粒被用作運(yùn)載體，應(yīng)具備的條件有：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定存在；具有多個限制酶切位點(diǎn)，方便剪切；具有標(biāo)記基因，便于檢測和篩選。構(gòu)建耐淹基因的質(zhì)粒表達(dá)載體時，用不同的限制酶對耐淹基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割，可以減少耐淹基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、使耐淹基因定向連接到質(zhì)粒上，以增大耐淹基因正向(正確)連接的概率。(3)根據(jù)耐淹基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測出的mRNA分子中，缺乏與基因中的啟動子、終止子和內(nèi)含子相對應(yīng)的堿基序列。由于密碼子具有簡并性，雖然兩種基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物不同，但最終能夠表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)。(4)由于直接改造的蛋白質(zhì)不能遺傳，而改造基因易于操作且改造后能夠遺傳，所以在蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)。答案(1)模板dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)(2)能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定存在；具有多個限制酶切位點(diǎn)，方便剪切；具有標(biāo)記基因，便于檢測和篩選(答2點(diǎn)即可)減少耐淹基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、增大耐淹基因正向(正確)連接的概率(3)啟動子、終止子和內(nèi)含子密碼子具有簡并性(4)改造基因易于操作且改造后能夠遺傳5(2019·廣東省實(shí)驗(yàn)中學(xué)高三聯(lián)考)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)是近年來頗受關(guān)注的一項(xiàng)新技術(shù)。該基因表達(dá)系統(tǒng)主要包含引導(dǎo)RNA和Cas9蛋白兩個部分，引導(dǎo)RNA能識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實(shí)現(xiàn)對靶基因序列的編輯。研究人員試圖用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻產(chǎn)量基因Q基因進(jìn)行編輯，請回答下列問題：(1)研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9僅存在于原核生物，故需借助_技術(shù)才能在水稻細(xì)胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與_酶的功能相似。(2)首先依據(jù)_的部分序列設(shè)計(jì)DNA片段A(負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)引導(dǎo)RNA)，再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構(gòu)建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達(dá)載體(如圖所示)。位點(diǎn)、位點(diǎn)分別表示_酶切位點(diǎn)。(3)質(zhì)粒B大小為2.5 kb(位點(diǎn)與位點(diǎn)相隔60 b)，經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5 kb(千堿基對)，連接形成的表達(dá)載體大小為_kb。(4)常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胨臼荏w細(xì)胞，依據(jù)農(nóng)桿菌的侵染特點(diǎn)，目的基因?qū)⒉迦氲絋i質(zhì)粒的_上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用，進(jìn)入水稻細(xì)胞，并將其插入到_，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達(dá)。(5)CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導(dǎo)RNA的角度分析脫靶的原因_。解析(1)根據(jù)題干信息“Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA”，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。(2)由于是對水稻產(chǎn)量基因Q基因進(jìn)行編輯，故首先需要依據(jù)Q基因的部分序列設(shè)計(jì)DNA片段A(負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)引導(dǎo)RNA)，再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構(gòu)建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達(dá)載體(如圖所示)。根據(jù)片段A兩端的限制酶種類以及片段A連接在位點(diǎn)、位點(diǎn)之間，可知位點(diǎn)、位點(diǎn)分別表示Kpn和BamH的酶切位點(diǎn)。(3)質(zhì)粒B大小為2.5kb(位點(diǎn)與位點(diǎn)相隔60 b)，經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5 kb(千堿基對)，連接形成的表達(dá)載體大小為2.50.50.062.94 (kb)。(4)常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胨臼荏w細(xì)胞，由于農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T­DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T­DNA上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用，進(jìn)入水稻細(xì)胞，并將其插入到水稻細(xì)胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達(dá)。(5)由于其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)配對的序列，造成引導(dǎo)RNA錯誤結(jié)合，從而導(dǎo)致CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)會出現(xiàn)編輯對象出錯而造成脫靶。答案(1)轉(zhuǎn)基因(DNA重組或基因工程)限制(2)Q基因Kpn、BamH(3)2.94(4)T­DNA水稻細(xì)胞染色體的DNA上(5)其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)配對的序列，造成引導(dǎo)RNA錯誤結(jié)合而脫靶6(2019·河南頂級名校高三聯(lián)考)為探究M基因的功能，科研人員將克隆得到的M基因?qū)霐M南芥植株(自交繁殖)，流程圖如圖所示，回答下列問題：(1)通過過程a、b，采用_法來獲得了大量的M基因，過程b中需先加熱至9095 然后冷卻至5560 ，冷卻的目的是_。(2)為了獲得轉(zhuǎn)基因植物，采用_法侵染擬南芥的花序。基本過程如下：過程d：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，其目的是_。過程e：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，再將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌離心、富集，得到含有M基因的農(nóng)桿菌液。過程f：在擬南芥植株產(chǎn)生大量花序時，將其花表面部分在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡2030 s，34周后對轉(zhuǎn)化擬南芥植株收種子(T0)，浸泡之前，需先剪去已經(jīng)長成的角果(這些角果將來發(fā)育成種子)，原因是_。將收獲的擬南芥種子T0，播種在含有_的培養(yǎng)基上，能健康生長的幼苗含有_。(3)采用農(nóng)桿菌花序侵染的方法轉(zhuǎn)化，一般只能將目標(biāo)片段整合到一條DNA上，若要獲得M基因穩(wěn)定的突變體，需_篩選出能穩(wěn)定遺傳的突變體。解析(1)圖示中由已知RNA獲取目的基因的方法是反轉(zhuǎn)錄法(逆轉(zhuǎn)錄法)，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增采用的是PCR技術(shù)。進(jìn)行PCR時需加熱至9095 然后冷卻至5560 ，冷卻的目的是使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上。(2)圖示中將基因表達(dá)載體構(gòu)建完成后沒有直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌，而是先將其導(dǎo)入大腸桿菌，目的是利用大腸桿菌的增殖來獲取大量重組質(zhì)粒(讓目的基因擴(kuò)增)。適合轉(zhuǎn)化植株的花卉應(yīng)沒有成熟，也沒有產(chǎn)生已受精的角果。因?yàn)檫@些已受精的角果將來結(jié)的種子肯定是非轉(zhuǎn)基因的，如果不剪掉的話會降低轉(zhuǎn)化率，不利于后續(xù)操作。由于質(zhì)粒中含有卡那霉素抗性基因，成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的種子能夠在卡那霉素培養(yǎng)基上正常生長，非轉(zhuǎn)基因種子不能正常生長，一般萌發(fā)后死亡。(3)由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法一般只能將目標(biāo)片段整合到一條DNA單鏈上，為篩選出能穩(wěn)定遺傳的突變體，可將T0代連續(xù)自交。答案(1)反轉(zhuǎn)錄法(或逆轉(zhuǎn)錄法)和PCR使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲取大量重組質(zhì)粒(讓目的基因擴(kuò)增)這些已受精的角果將來結(jié)的種子是非轉(zhuǎn)基因的卡那霉素M(目的)基因(3)T0代連續(xù)自交7(2019·廣東省高三模擬)人參是珍貴的藥用植物，研究人員運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人參細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，為珍貴藥用植物與疫苗聯(lián)合應(yīng)用開辟了新思路，其構(gòu)建過程如圖所示，圖中Sma、Sst、 EcoRV為限制酶。請回答相關(guān)問題：(1)的構(gòu)建過程除限制酶外還需要_酶；想要從中重新獲得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoR 或Sma，原因是_。(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌常用_處理細(xì)胞；要使目的基因成功整合到人參細(xì)胞的染色體上，該過程所采用的質(zhì)粒應(yīng)含有_。(3)分析圖可知，中應(yīng)含有的標(biāo)記基因是_；過程的目的是_。(4)研究人員將HBsAg基因表達(dá)蛋白上的某位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行替換，通過一定的方法獲得了新HBsAg基因，進(jìn)而獲得了免疫效應(yīng)更強(qiáng)的疫苗，請按照蛋白質(zhì)工程的原理寫出獲得新HBsAg基因的基本途徑_。解析(1)圖中為重組質(zhì)粒，其形成時需要限制酶和DNA連接酶的參與；據(jù)圖分析可知，EcoR V、Sma切割后得到的是平末端，然后用DNA連接酶連接后，所形成的重組序列不能再被EcoR V和Sma識別，因此想要從中重新獲得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRV或Sma。(2)將目的基因?qū)朕r(nóng)桿菌等微生物的方法是用鈣離子處理細(xì)胞；農(nóng)桿菌的質(zhì)粒中含有一段可以轉(zhuǎn)移的DNA，即T­DNA，它能將目的基因成功整合到人參細(xì)胞的染色體上。(3)過程中是將受體細(xì)胞放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選出含有HBsAg基因的人參細(xì)胞，因此中應(yīng)含有的標(biāo)記基因是氨芐青霉素抗性基因。(4)據(jù)題意可知，按照蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的過程為從HBsAg基因表達(dá)蛋白的功能出發(fā)設(shè)計(jì)HBsAg基因表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)將HBsAg基因表達(dá)蛋白上的某位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行替換找到并改造HBsAg基因的脫氧核苷酸序列。答案(1)DNA連接兩平末端連接后的重組序列不能再被EcoR V和Sma識別(重組質(zhì)粒無這種限制酶的識別序列)(2)鈣離子(Ca2)T­DNA(3)氨芐青霉素抗性基因篩選出含有HBsAg基因的人參細(xì)胞(4)從HBsAg基因表達(dá)蛋白的功能出發(fā)設(shè)計(jì)HBsAg基因表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)將HBsAg基因表達(dá)蛋白上的某位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行替換找到并改造HBsAg基因的脫氧核苷酸序列8(2019·濮陽市高三二模)P450是石油降解的關(guān)鍵酶，用Sal和Nde聯(lián)合酶切獲得的P450基因，與如圖所示的質(zhì)粒(pCom8)重組，導(dǎo)入土著菌種Y9，獲得了基因工程菌P450/Y9。圖中mel是黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的菌落變成黑色，aacCl是慶大霉素(一種抗生素)抗性基因，限制酶Nde、Xho和Ssp在原質(zhì)粒上均只有一個酶切位點(diǎn)。如圖表示幾種限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)，據(jù)圖回答下列問題：(1)構(gòu)建pCom8重組質(zhì)粒時，需用_(限制酶)對圖示質(zhì)粒進(jìn)行處理，才能與_在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒。(2)為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入用_預(yù)先處理的土著菌種Y9中，提高質(zhì)粒導(dǎo)入率，以便獲得更多基因工程菌P450/Y9。為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的基因工程菌P450/Y9，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加_作為載體的質(zhì)粒除了含有標(biāo)記基因，還應(yīng)該含有_(至少寫兩個)。(3)為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可觀測的指標(biāo)是_。土著菌種Y9不能降解石油，但轉(zhuǎn)入上述構(gòu)建好的表達(dá)載體后則獲得降解石油的能力，這是因?yàn)開。解析(1)根據(jù)題干信息已知，切割目的基因的限制酶是Sal和Nde，而pCom8上無Sal的切割位點(diǎn)，又因?yàn)槿鐖D顯示Sal和Xho切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用Nde、Xho切割質(zhì)粒，然后與目的基因在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒。(2)為提高質(zhì)粒導(dǎo)入率，土著菌種Y9預(yù)先需用Ca2處理。因?yàn)閄ho切割質(zhì)粒會破壞標(biāo)記基因mel，而aacCl未破壞，因此為了篩選出轉(zhuǎn)入了基因工程菌P450/Y9，應(yīng)在篩選培養(yǎng)基中加入慶大霉素。質(zhì)粒具備的特點(diǎn)有：含有標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、自我復(fù)制等。(3)為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可在一定時間內(nèi)觀測所取樣品石油的剩余量。P450是石油降解的關(guān)鍵酶，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體后，P450基因得以表達(dá)，即基因工程菌P450/Y9可分泌降解石油的P450酶。答案(1)Nde、Xho目的基因(或P450基因)(2)Ca2(或CaCl2)慶大霉素啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)(答出兩點(diǎn)即可)(3)2天后(或一定時間后)樣品中石油的含量(剩余量) 基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶(答案合理即可)9