5.1 DNA的粗提取與鑒定一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是選用一定的 或 方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在 和 性質(zhì)方面的差異，提取 ，去除其他成分。（1）DNA的溶解性：l DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在 中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使 充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。l 此外，DNA不溶于 溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。（2）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性：蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受 oC的高溫，而DNA在 以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解 ，但對(duì)DNA 影響。（二）DNA的鑒定：在 條件下，DNA遇 會(huì)被染成藍(lán)色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有 的生物材料都可以考慮，但是使用 的生物組織，成功的可能性更大。（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液：動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，雞血細(xì)胞較好：1、雞血細(xì)胞 ；2、雞血細(xì)胞 。以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的 ，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用 。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的 和 ，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。（三）去除濾液中的雜質(zhì) 方案一 利用DNA在 的不同（ NaCl溶液下，DNA溶解度最小，低濃度和高濃度的NaCl溶液都能溶解DNA），通過(guò)控制NaCl溶液的濃度可以去除雜質(zhì)，析出DNA。方案二 直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)1015min，嫩肉粉中的 能夠分解蛋白質(zhì)。方案三 將濾液放在 的恒溫水浴箱保溫1015min，注意 范圍。（四）DNA的析出與鑒定1、將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積相等的、 的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為 ），靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn) ，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。2、取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為 的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的 試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于 中加熱5min，待試管 后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。三、操作提示1、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g ，防止 。2、加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩柔和，否則容易產(chǎn)生 ，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要 ，以免加劇 ，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3、二苯胺試劑要 ，否則會(huì)影響鑒定的效果。5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1PCR原理 參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈 合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物 （1）DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為 ，而磷酸基團(tuán)的末端稱為 。DNA聚合酶不能 開始合成DNA，而只能 ，因此，DNA復(fù)制需要 。DNA的合成方向總是 。（2）在DNA的復(fù)制過(guò)程中，復(fù)制的前提是 。在體外可通過(guò)控制 來(lái)實(shí)現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過(guò)程稱為 。PCR利用了DNA的熱變性的原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過(guò)程的溫度高，只能使用 的DNA聚合酶。（3）PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供： ， ， ， ，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。2PCR的反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為 參與反應(yīng)。3操作提示：為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的相關(guān)儀器和試劑在使用前必須進(jìn)行 。 4.DNA在 的紫外線波段有一強(qiáng)烈吸收峰，可以利用DNA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定，其計(jì)算公式：DNA含量（µg/mL）= 5.3 血紅蛋白的提取和分離一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法1、凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。2、凝膠實(shí)際上是一些微小的 ，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，如葡聚糖或瓊脂糖。3、在多孔小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ；而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。（二）緩沖溶液1、緩沖溶液的作用是在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持 。2、緩沖溶液通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成的。3、生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境pH基本一致。（三）電泳1、電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生的遷移過(guò)程。2、許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3、兩種常用的電泳方法是 和 ，電泳速率完全取決于蛋白質(zhì) 。二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，以利于后續(xù)步驟的分離純化。采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用 離心（500r/min），然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ，將下層暗紅色的 倒入燒杯，再加入5倍體積生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%NaCl），緩慢攪拌10 min， 離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。2、血紅蛋白的釋放：在 和 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。3、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合溶液離心（2000r/min）后，試管中的溶液分為4層。第一層為無(wú)色透明的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透明液體，這是 ，第4層是 的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的 。（二）粗分離：透析：取1mL的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的 （PH7.0）中，透析12h。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。三、操作提示1、紅細(xì)胞的洗滌 洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去 ；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使 等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。2、色譜柱填料的處理 商品凝膠使干燥的顆粒，使用前需直接放在洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可以將加入洗脫液的濕凝膠用 加熱，逐漸升溫至接近沸騰。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且可以除去凝膠中可能帶有的 ，排除膠粒內(nèi)的 。3、凝膠色譜柱的裝填 在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量 ，以降低凝膠顆粒之間的空隙。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡會(huì) ，降低分離效果。在凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。4、蛋白質(zhì)的分離 在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過(guò)程中的移動(dòng)情況。如果 ，說(shuō)明色譜柱制作成功。5.一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）物理 化學(xué) 物理 化學(xué) DNA（1）不同濃度的NaCl溶液 酒精（2）6080oC 80 細(xì)胞膜 沒有（二）沸水浴 二苯胺 藍(lán)色二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）DNA DNA含量相對(duì)較高（二）核DNA含量豐富，材料易得 易吸水脹破，DNA物質(zhì)易釋放。 蒸餾水 洗滌劑溶解細(xì)胞膜 洗滌劑 食鹽（三）不同濃度的NaCl溶液中溶解度 0.14mol/LNaCl 木瓜蛋白酶 6075 嚴(yán)格控制溫度范圍。（四）冷卻 95% 白色絲狀物 2mol/L 二苯胺試劑 沸水中 變藍(lán)。三、操作提示 1、檸檬酸鈉 血液凝固 2、大量的泡沫 輕緩并沿一個(gè)方向 DNA分子的斷裂 3、現(xiàn)配現(xiàn)用5.2一基礎(chǔ)知識(shí)1.DNA復(fù)制 提供DNA復(fù)制的模板 4種脫氧核苷酸 使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸 （1）3端 5端 從頭 從3端延伸DNA鏈 引物 從子鏈的5端向3端延伸 （2）DNA雙鏈的解開 溫度 80100 DNA變性 耐熱的 （3）DNA模板 分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 四種脫氧核苷酸 耐熱的DNA聚合酶2變性 復(fù)性 延伸 模板3高壓滅菌 4.260nm 50（260nm的讀數(shù)）稀釋倍數(shù)。5.3一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法1、分配色譜法 相對(duì)分子質(zhì)量大小 2、多孔球體3、較小 較長(zhǎng) 較慢 較大 凝膠外部 較短 較快（二）緩沖溶液1、維持pH基本不變。（三）電泳正電或負(fù)電 相反 遷移速度 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)所帶凈電荷的多少以及分子大小二、實(shí)驗(yàn)操作 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定。（一）去除雜蛋白 短時(shí)間低速 黃色血漿 紅細(xì)胞液體 低速短時(shí)間 上清液不再呈現(xiàn)黃色 蒸餾水 甲苯 無(wú)色透明的甲苯層 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 血紅蛋白的水溶液 其他雜質(zhì) 紅色透明液體。（二）粗分離：透析袋 磷酸緩沖液 分子量較小三、操作提示1、血漿蛋白 白細(xì)胞 2、沸水浴 微生物 空氣3、緊密 攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 4、紅色區(qū)6